Eksperimentalni rad na transplantaciji alogenih keratinocita na umjetno stvorene ožiljke bijelih štakora

Želja za korištenjem staničnog potencijala i potreba za pronalaženjem novih učinkovitih metoda za poboljšanje estetskog izgleda ožiljaka dovela je do ideje o pokušaju proučavanja mogućnosti transplantacije keratinocita na ožiljne površine.

Kako bi se dokazala vjerojatnost korištenja kulture keratinocita za poboljšanje izgleda ožiljaka, provedeno je eksperimentalno istraživanje na bijelim laboratorijskim štakorima, kojima su stvorene ožiljne površine. Model ožiljka štakora dobiven je kao rezultat zacjeljivanja umjetno nanesenih rana na leđima, duž kralježnice. Štakorima su izrezani identični komadi kože, veličine 2x3 cm. 2,5 mjeseca nakon operacije "modeliranja ožiljka", štakorima je učinjena dermabrazija (uklanjanje gornjih slojeva ožiljka termokaustikom) te su im transplantirani alogeni keratinociti, izolirani s kože štakorskih mladunaca 2-4 dana nakon rođenja.

Izolacija i uzgoj epidermalnih stanica štakora provedeni su u laboratoriju staničnih tehnologija Instituta za citologiju Ruske akademije znanosti korištenjem sljedeće tehnologije.

Koža je isprana u Hankovoj otopini soli koja sadrži 200 U/ml gentamicina i izrezana na male komadiće, površine 0,2-0,5 cm2 ^. Komadići kože inkubirani su u 0,5%-tnoj otopini dispaze u uravnoteženoj otopini fosfatnog pufera na 37°C tijekom 1 sata. Komadići su zatim prebačeni u Dulbeccovu fosfatno puferiranu otopinu soli i epiderma je odvojena od derme. Epiderma je inkubirana u 0,125%-tnoj otopini tripsina tijekom 10-15 minuta uz miješanje pri 50 okretaja u minuti, nakon čega je djelovanje enzima zaustavljeno dodavanjem 5% fetalnog goveđeg seruma. Jedna trećina dobivene stanične suspenzije korištena je u čistom obliku za jednu od opcija transplantacije na ožiljke, druga trećina uzgojena je na biokompatibilnim domaćim filmskim premazima "Polypor", a treća - na Petrijevim zdjelicama bez podloge. Operacija dermabrazije nastalih ožiljaka na štakorima s naknadnom transplantacijom stanica epiderme štakora na njih provedena je pod eterskom anestezijom pomoću termalnog kauterizirajućeg uređaja.

U prvoj skupini štakora, nakon dermabrazije, sterilni komadići kamabrika postavljeni su na uglačanu, opranu fiziološkom otopinom i osušenu površinu ožiljka, na koju je nanesena protresena suspenzija alogenih epidermocita štakora u koncentraciji od 1,5 milijuna stanica na 1 ml (prema Zavodu za citologiju). Komadići kamabrika postavljeni su na uglačani ožiljak tako da stanice leže na površini ožiljka. Na vrh je postavljen zavoj od nekoliko slojeva gaze, koji je prišiven na rubove ožiljka.

Dio dobivene stanične suspenzije zasijan je u Petrijeve zdjelice na sterilne Polypore filmove izrezane u oblik zdjelica, a drugi dio - na Petrijeve zdjelice bez filma. Uzgoj je proveden u FAD mediju, koji se sastojao od smjese DMEM i F12 medija u omjeru 3:1, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma, 5 μg/ml inzulina (Sigma), 0,5 μg/ml hidrokortizon hemisukcinata (Sigma), 10 μg/ml epidermalnog faktora rasta EGF (Institut za citologiju RAS, Sankt Peterburg). Druga i treća skupina štakora, od po 7 jedinki, operirane su 6 dana nakon prve. Do tog vremena, iz suspenzije zasijanih keratinocita u Petrijevim zdjelicama formirani su višeslojni slojevi, koji su transplantirani u štakore. Drugoj skupini transplantirani su epidermociti na filmu, trećoj - višeslojni sloj bez podloge. Nakon 7 dana, dobiveni višeslojni slojevi alogenih keratinocita (MPALK), posijani na "Polypore" filmove, transplantirani su kao kultura izravno na površinu rane. Na vrhu je film, kako bi se izbjeglo kidanje, fiksiran višeslojnim gaznim zavojem i prišiven na kožu štakora.

Prije transplantacije keratinocita u treću skupinu štakora uzgojenih bez supstrata, PAC je odvojen od dna Petrijeve zdjelice tretiranjem dispazom, koja ima sposobnost selektivnog prekida dermalno-epidermalnih veza. Djelovanjem na višeslojni sloj, dispaza prekida vezu stanica bazalnog sloja s dnom Petrijeve zdjelice i ima mnogo manji učinak na međustanične veze, što omogućuje potpuno „uklanjanje“ sloja. Odvajanje višeslojnog staničnog sloja dispazom provedeno je na sljedeći način. Transportni medij je ispušten iz Petrijeve zdjelice, stanični slojevi su tri puta isprani hranjivim medijem koji sadrži antibiotike, posebno gentamicin (0,2 mg/ml). Višeslojni slojevi su napunjeni 0,125%-tnom otopinom dispaze („Sigma“) i stavljeni u termostat, gdje su inkubirani na t=37°C tijekom 20-30 minuta. Pojava bijelog ruba koji se ljušti po obodu sloja pokazatelj je početka procesa njegovog odvajanja od rubova i dna Petrijeve zdjelice. Nekoliko minuta nakon početka procesa odvajanja, otopina dispaze je ocijeđena, epitelni slojevi su isprani medijem 2-3 puta. Na površinu epidermalnog sloja nanesen je komad sterilnog zavoja za rane "Lita-color" izrezan na veličinu čašice, na koji je zalijepljen sloj odvojen dispazom, dodatno oguljen s dna čašice špatulom. Pomoću pincete za oči, sloj je zajedno s premazom salvete "Lita-color" (Rusija) otkinut s dna Petrijeve zdjelice i pažljivo prenesen na pripremljenu površinu ožiljka. Salvete "Lita-color" sadrže gentamicin i egzolin (ekstrakt kolagena), koji su, kada se navlaže ostacima medija za rast, a zatim fiziološkom otopinom, nabubrili i postali moderni zavoj za rane, pružajući dobru zaštitu od vanjske infekcije i brzo zacjeljivanje zbog strukture koja upija vlagu.

Višeslojni gazni zavoji naneseni su na Polypore filmove i Lita-color salvete te prišiveni na kožu štakora radi jače fiksacije. Svaki je štakor smješten u zaseban kavez kako bi se stvorili optimalni uvjeti za njegovo održavanje i prihvaćanje transplantiranih keratinocita. Zavoji štakora kojima je transplantirana suspenzija i višeslojni sloj epidermocita uklonjenih dispazom navlaženi su sterilnom fiziološkom otopinom nekoliko puta dnevno kako bi se stvorili najpovoljniji uvjeti za prihvaćanje stanica. S obzirom na to da je Polypore film bio nepropustan za vodu, zavoji štakora u drugoj skupini nisu bili navlaženi, što je bila jedna od prednosti u odnosu na transplantacije bez filmova. Zavoji su uklonjeni nakon 10 dana. Klinička slika ožiljaka nakon transplantacije stanica malo se razlikovala od ožiljaka bez transplantacije, osim po ružičastijoj boji (zbog dermabrazije) i većem ljuštenju. Ta činjenica sugerira da odmah nakon što su zavoji za rane otpali s MPC-om, nije došlo do promjena u ožiljku.

Uzimanje biopsijskog materijala od štakora.

Nakon 1, 2, 5 i 9 mjeseci nakon transplantacije alogenih keratinocita štakora na polirane ožiljke bijelih štakora, uzet je materijal za histološki, citomorfološki i elektronsko-mikroskopski pregled. Uzorci normalne kože štakora i ožiljka bez transplantacije stanica uzeti su kao kontrola. Anestezija štakora provedena je eterskom anestezijom.

Nakon anestezije, s označenih područja uzeti su komadići ožiljnog tkiva na koja su pomoću biopsijskog bušilice promjera 2 mm transplantirani keratinociti i stavljeni u 2,5%-tnu otopinu glutaraldehida kako bi se materijal pripremio za elektronsko-mikroskopski pregled. Komadići tkiva uzeti za histološki pregled stavljeni su u 10%-tnu neutralnu otopinu formalina, nakon čega su propušteni kroz alkohole i uklopljeni u parafin, a zatim izrezani ultratanki rezovi i pregledani u svjetlosno-optičkom mikroskopu.

Kontrola I. Normalna koža štakora.

Kako bi se vidjela razlika između mikroskopske slike normalne kože štakora s ožiljcima i ožiljaka u određenim vremenima nakon transplantacije MPC-a, u svim fazama ove studije prikazane su fotografije i opisi istih.

Epiderma normalne kože sastoji se od 7-9 slojeva stanica. Stratum corneum je umjerene debljine. Na nekim mjestima sastoji se od 6-8 slojeva rožnatih ljuski. Bazalni sloj predstavljen je cilindričnim stanicama s velikim, svijetlim, pravilno oblikovanim jezgrama i nekoliko nukleola. Desmosomske veze između stanica i s bazalnom membranom jasno su izražene. Ispod dobro definirane bazalne membrane, koja ima male izrasline u subepidermalnom sloju, paralelno s njom leže nježni snopovi kolagenih i elastinskih vlakana, među kojima su izduženi fibroblasti, male žile. U dubljim slojevima, snopovi kolagenih i elastinskih vlakana leže u različitim smjerovima. Među njima su mnoge žile s tankim stijenkama istog kalibra, stanični elementi (fibroblasti, mastociti, leukociti). Veliki broj folikula dlake, lojne žlijezde.

Kontrola 2. Ožiljak štakora, star 2 mjeseca.

Klinička slika. Ožiljci su blijedoružičasti, ljušte se, mjestimično ostaju kraste. Njihova površina se smanjila zbog kontrakcije kolagenih vlakana i postala je približno 3,0-3,5 cm ^. Kožni dodaci su odsutni.

Mikroskopska slika. Epiderma se sastoji od 3-5 slojeva stanica, naboranih, predstavljenih zaobljenim bazalnim stanicama, jednim redom subulatnih, 1-2 reda granularnih s keratohijalinskim zrnima u gornjem sloju, postoje područja unutarstanične edema. Stratum corneum je neravnomjerno promijenjen od vrlo tankog do zadebljanog. Primjećuje se nabiranje ožiljka zbog (kontrakcije) ožiljnog tkiva. Nabori prodiru do papilarnog sloja i stvaraju dojam papila. Granica između epiderme i derme je ravna linija. Bazalna membrana se ne prati svugdje. U donjem dijelu subepidermalnih i dubljih slojeva nalaze se žile s debelom, labavom stijenkom, mnoge su puste, sa stazom. Oko žila dolazi do nakupljanja makrofaga, fibroblasta. Makrofagi okružuju eritrocite oslobođene iz kapilara i fagocitiraju ih. U površinskijim slojevima nalaze se male kapilare. Ispod epiderme labavo su smještena kolagena vlakna. U dubljem sloju ožiljka nalaze se grubi snopovi kolagena vlakana, među kojima ima mnogo fibroblasta.

Ožiljak štakora mjesec dana nakon transplantacije keratinocita štakora.

Klinička slika. Ožiljci su ružičasti, njihova površina se smanjila, posebno u promjeru, i u prosjeku iznosi 2,5-3 cm ^2. Kosa i lojne žlijezde su odsutne.

Podaci mikroskopskog pregleda materijala dobivenog od štakora transplantacijom MPaLK-a na film i MPaLK-a bez podloge praktički su identični. Međutim, čisto tehnički, rad s MPaLK-om bez podloge mnogo je složeniji i mukotrpniji nego pri uzgoju MPaLK-a na podlozi, stoga smo u daljnjem proučavanju problema transplantacije keratinocita u ožiljke koristili višeslojni cambric kao osnovu za uzgoj („podloge“).

Mikroskopska slika. Primjećuje se zadebljanje epiderme na 15-20 slojeva, gotovo do sredine kojih keratinociti imaju uzak, izdužen, okomit oblik i kompaktan raspored. Bazalne stanice smještene su u neravnoj liniji. Njihove jezgre su svijetle, velike, zaobljene s jednom ili dvije nukleole, što ukazuje na njihovu visoku sintetsku i proliferativnu aktivnost. Granica između epiderme i derme je ravna linija. Spinozni sloj je dobro razvijen, sastoji se od 3-5 slojeva zaobljenih stanica, postoje 2-nukleolarne stanice.

Neposredno ispod bazalne membrane nalaze se gusto raspoređeni tanki snopovi kolagenih vlakana, paralelno s njima nalazi se veliki broj napuštenih krvnih žila, dublja kolagena vlakna su grublja, skupljena u guste snopove. Mnogo velikih fibroblasta, mastocita (2-3 u vidnom polju), makrofaga, leukocita i napuštenih krvnih žila, čije su stijenke opuštene, oko njih su labavo raspoređena kolagena vlakna. U nekim krvnim žilama postoji staza, dijapedeza formiranih elemenata. Oko krvnih žila nalaze se fibroblasti, pojedinačni limfociti. Kožni dodaci su odsutni.

Prilikom transplantacije suspenzije keratinocita na polirani ožiljak, mikroskopska slika se razlikuje od prethodne. Kod većine životinja epiderma je tanka i sastoji se od 5-6 slojeva stanica. Donji sloj sastoji se od stanica nepravilnog, poligonalnog oblika s jezgrama okruglo-nepravilnog oblika. Stanje subepidermalnog sloja slično je njegovom stanju u skupini životinja bez transplantacije MPALK-a.

U ovom slučaju možemo govoriti ili o kašnjenju u procesima koji prate transplantaciju stanica ili o velikom gubitku stanica transplantiranih u obliku suspenzije. Stoga je donesen zaključak o neisplativosti korekcije ožiljaka transplantacijom keratinocita u obliku suspenzije.

Ožiljak štakora 2 mjeseca nakon transplantacije keratinocita štakora.

Klinička slika. Ožiljak izgleda tanko i nježno. Mjestimično se opaža ljuštenje i ljuskave mrlje.

Mikroskopska slika. Stratum corneum je zadebljan, mjestimično - hiperkeratoza. Epiderma je zadebljana, sastoji se od 12-20 redova stanica. Granica između epiderme i derme je ravna linija. Nježna kolagena vlakna ispod epiderme leže prilično gusto. U dubljim slojevima ožiljka skupljena su u velike grube snopove. U subepidermalnom sloju pojavljuju se nove vaskularne formacije. U donjim slojevima ožiljnog tkiva nalaze se mnoge napuštene žile smještene paralelno s površinom epiderme. Veliki fibroblasti ravnomjerno su raspoređeni u debljini ožiljka, postoje divovski, višegranati, mnogi makrofagi.

Ožiljak štakora 5 mjeseci nakon transplantacije epidermalnih stanica štakora.

Klinička slika. Ožiljak izgleda ujednačeno, glatko bez ljuštenja, prisutne su pojedinačne dlačice, njihova gustoća je veća na periferiji ožiljaka, što ukazuje na granično urastanje folikula dlake u ožiljak i novo stvaranje folikula dlake. Površina ožiljaka se i dalje smanjuje.

Mikroskopska slika. Epiderma je još uvijek debela (15-20 slojeva, na nekim mjestima i do 30), u gornjim slojevima ispunjena je keratohijalinskim zrncima. Bazalna membrana je jasno vidljiva. Ispod nje kolagena vlakna leže labavo. U donjim slojevima kolagen je snažniji i gušće zbijen. Među snopovima kolagena nalazi se mnogo kapilara. U gornjim slojevima broj napuštenih krvnih žila se smanjio. Spoj epiderme i derme je blago valovit. Na nekim mjestima postoje duboki epidermalni izraslini u ožiljnom tkivu. Među kolagenim vlaknima vidljive su novonastale krvne žile. Pojavljuju se pojedinačni folikuli dlake i lojne žlijezde.

Ožiljak štakora 9 mjeseci nakon transplantacije MPA stanica epidermisa štakora.

Klinička slika. Ožiljci su postali znatno manji u usporedbi s ranijim razdobljima, njihova površina je u prosjeku oko 1,5-2,0 cm ^2. Ožiljci su neravnomjerno prekriveni finim dlačicama, posebno na periferiji. Ostaje manje finopločasto ljuštenje.

Mikroskopska slika.

Epiderma je postala tanja, predstavljena je sa 6-8 redova stanica, po strukturi podsjeća na epidermu normalne kože štakora, samo što je gustoća stanica 1 mm veća i one su manje. Bazalni sloj sastoji se od malih okruglo-cilindričnih stanica. Bazalna membrana je dobro izražena, hemidesmosomi su jasno vidljivi. Primjećuje se prisutnost epidermalnih izraslina u subepidermalnom sloju. Papilarni sloj je izražen duž cijele duljine ožiljka. Ove činjenice ukazuju na to da je do ovog vremena prianjanje transplantiranih keratinocita postalo mnogo jače s temeljnim ožiljnim tkivom. Stoga, njega ožiljaka kod osoba s transplantacijom MPALK-a 9 mjeseci nakon transplantacije MPC-a može biti tradicionalna. Ispod epiderme kolagena vlakna su nježnija nego u dubokim slojevima. Pojavile su se mnoge žile, posebno površinske. Stijenke većih žila su zadebljane. Folikuli dlake i lojne žlijezde su u velikim količinama. Mikroskopska slika podsjeća na tkivo slično dermi.

Rezultati eksperimentalnog rada i njihova rasprava.

U tijeku ovog rada, keratinociti u različitim oblicima transplantirani su na umjetno stvorene ožiljke na koži štakora nakon operacije dermabrazije - na pokrivače za rane, kao suspenzija na batiste i kao višeslojni sloj bez podloge. Rad je proveden s ciljem dobivanja morfoloških podataka o učinku transplantiranih alogenih keratinocita na ožiljke, kao i određivanja optimalnih opcija transplantacije.

Utvrđeno je da su sve tri metode transplantacije izvedive, ali transplantacija MPAC-a bez supstrata je vrlo radno intenzivan postupak, tijekom kojeg se MPAC može ozlijediti, što utječe na rezultate transplantacije. Štoviše, ova metoda transplantacije isključuje rad na velikim površinama.

Transplantacija suspenzije keratinocita puno je isplativija metoda, ne zahtijeva dugotrajni uzgoj stanica i jednostavna je u verziji koju predlažemo korištenjem sterilnih cambricnih blankova, čije veličine odgovaraju veličini ožiljaka. Kašnjenje terapijskog učinka pri transplantaciji stanične suspenzije za oko mjesec dana u usporedbi s MPC-om na premazu za rane nije značajna točka s trajanjem liječenja od više mjeseci. Poznato je da kada se MPC transplantira pacijentima s opeklinama, transformacija strukture kože događa se postupno i tijekom nekoliko godina. Transplantacija kulture keratinocita na premaze za rane najpogodnija je i najperspektivnija metoda, ali i znatno skuplja. Osim toga, trenutno je potrebno tražiti naprednije opcije premaza koje bi trebale biti fleksibilne, higroskopne, imati bakteriostatska ili baktericidna svojstva i biti biološki neutralne za stanice. Film "Polypor" - srednja verzija domaćeg filma za premazivanje rana, unatoč nekim nedostacima, omogućio nam je da u eksperimentu proučimo transplantaciju keratinocita štakora na ožiljke i izvučemo zaključke o učinkovitosti ovog smjera liječenja ožiljaka.

Autori koji su transplantirali MPC na opekline primijetili su da se tijekom prvog tjedna nakon transplantacije višeslojnog sloja keratinocita na dezinficirane rane epiderma zadebljala i stratificirala. Svi slojevi epiderme bili su jasno vidljivi. Zanimljivo je da je broj staničnih slojeva u transplantatima bio 10-30% veći nego u biopsijama kože. Autori su primijetili pojavu keratohijalinskih granula 5. dana nakon transplantacije MPC-a, a bazalne membrane i hemidesmosoma već 3. dana.

J.Rives i sur. (1994.), Paramonov BA (1996.); Kuznetsov NM i sur. (1998.) otkrili su da je u ranim fazama nakon transplantacije MPC-a pacijentima s defektima kože pune debljine nakon opeklina veza između dermisa i epidermisa vrlo slaba i ravna je linija, papilarni sloj je odsutan. Do kraja drugog mjeseca počinju se formirati plitke papile i kožni dodaci, a veza između dermisa i epidermisa postaje jača. Podaci iz literature ukazuju da je transplantacija alogenih keratinocita na rane kod pacijenata s opeklinama obećavajuća metoda. Unatoč činjenici da se odbacivanje alogenih keratinocita, prema različitim autorima, događa unutar 10 dana do 3 mjeseca, oni ipak igraju svoju ulogu u zacjeljivanju površine rane, lučeći faktore rasta i mehanički zatvarajući defekt. Smatra se da MPALC imaju smanjenu antigensku aktivnost, budući da tijekom in vitro uzgoja gube Langerhansove stanice, što im omogućuje dugotrajno postojanje u tijelu primatelja. Osim toga, alogena kultura dobivena s kože mladih zdravih osoba ima neusporedivo veći biološki potencijal od autologne kulture pacijenata nakon ozljede.

Glavni cilj našeg istraživanja bio je utvrditi hoće li se alogeni keratinociti ukorijeniti na ožiljcima i koje će se promjene dogoditi u ožiljnom tkivu pod utjecajem takvog biološki aktivnog "premazivanja rane". U slučaju pozitivnog rezultata, razviti najučinkovitiju i najmanje radno intenzivnu tehnologiju za ovo područje rehabilitacijske medicine.

Podaci koje smo dobili u mnogočemu su slični podacima iz literature o morfološkim promjenama koje se događaju u ljudskoj epidermi nakon transplantacije alogenih keratinocita u opeklinske rane. Međutim, postoje i značajne razlike, kako u pogledu morfološke podloge na koju se transplantacija odvija, tako i u pogledu tehnologije. Dakle, proces formiranja bazalne membrane i dermalno-epidermalnih veza (hemidesmosomi, papile) događa se u kasnijoj fazi u usporedbi s transplantacijom keratinocita na površine rane bez ožiljnih promjena. Očito se to događa zbog slabije prehrane ožiljnog tkiva u usporedbi s dermisom ili mišićnom fascijom. Ožiljak, posebno stari, gusto je vezivno tkivo s vrlo malim brojem krvnih žila, dok je dno opeklinske rane granulacijsko tkivo bogato krvnim žilama. Dakle, očito je da su uvjeti pod kojima se odvija transplantacija i usađivanje keratinocita apsolutno različiti. Što je područje transplantacije stanica vaskulariziranije, to je proces njihovog usađivanja lakši. Iz ovog postulata slijedi zaključak o preferenciji rada s mladim ožiljcima, kod kojih je vezivno tkivo još uvijek prilično rahlo i bogato krvnim žilama.

Kao rezultat ovog eksperimentalnog rada dokazano je da:

1. Transplantacija MPALK-a na ožiljke je moguća.
2. Optimalna metoda transplantacije je transplantacija keratinocita na pokrov rane.
3. Površinu ožiljka treba polirati kirurškom laserskom dermoabrazijom ili Schumannovim rezačem.
4. Pod utjecajem MPALK-a dolazi do brze epitelizacije polirane površine ožiljka.
5. Što je ožiljno tkivo bolje vaskularizirano, odnosno što je ožiljak mlađi, to su bolji rezultati transplantacije keratinocita.
6. Pod utjecajem transplantiranih keratinocita, ožiljno tkivo se postupno transformira i pretvara u dermalno tkivo (rahlije ožiljno tkivo s kožnim dodacima).
7. Postupno labavljenje ožiljnog tkiva, počevši od subepidermalnog sloja. Njegova vaskularizacija se poboljšava, snopovi kolagenih vlakana u gornjem i donjem dijelu ožiljka zauzimaju labaviji raspored nego u ožiljnom tkivu bez transplantacije stanica. Pojavljuju se folikuli dlake i lojne žlijezde. Epidermis se po svojoj strukturi, prošavši fazu hipertrofije, približava epidermi normalne kože.
8. Uočene promjene povezane su s faktorima rasta i citokinima koje luče keratinociti, a koji, poboljšavajući trofiku ožiljnog tkiva, potiču njegovu transformaciju iz grubog vlaknastog tkiva u rahlije tkivo, što dovodi do poboljšanja izgleda ožiljka.

Dakle, na temelju ove studije može se zaključiti da transplantirani keratinociti imaju blagotvoran učinak na ožiljno tkivo, što može imati praktične implikacije za rehabilitaciju pacijenata s različitim vrstama ožiljaka.

Ovaj rad na štakorima također nam je omogućio formuliranje zahtjeva za obloge za rane na kojima se uzgajaju keratinociti.

Zavoji za rane trebaju biti:

• biokompatibilan sa stanicama,
• prozračna,
• imaju elastičnu, oblikovanu bazu,
• biti hidrofilan,
• kao ljekoviti dodaci sadrže antibakterijske lijekove i antioksidanse koji nisu toksični za kultivirane stanice.

Klinički rezultati biotehnološkog liječenja ožiljaka.

Prethodno su N. Carver i suradnici (1993.) otkrili da okluzivni zavoji najbolje potiču pričvršćivanje na ranu i preživljavanje keratinocita, ali ne dopuštaju stvaranje stratificirane (zrele) epiderme. Za stvaranje stratificirane epiderme nužno je zračno okruženje. Stoga je, nakon pričvršćivanja višeslojnog sloja, predloženo uklanjanje okluzivnog zavoja za rane nakon 7-10 dana i liječenje rana pod suhim zavojima ili mastima topljivim u vodi. Može se reći da su kvaliteta i svojstva "podloge" na kojoj se stanice uzgajaju vrlo važna točka za učinkovitost transplantacije staničnog materijala, a time i za rezultate rada liječnika. No, danas ne postoji idealna obloga za rane, unatoč obilju predloženih opcija (umjetna koža, netkana tkanina od karboksimetil celuloze, fibrinski premazi, polupropusni poliuretanski filmovi). Važna točka u ovom pitanju je cijena "podloga" (posebnih obloga za rane), budući da njihova visoka cijena povećava ukupne troškove biotehnološkog tretmana.

Učinkovitost staničnih tehnologija do danas je dokazana, ali, nažalost, te su tehnologije vrlo skupe, posebno u zemljama u kojima nije uspostavljena industrijska proizvodnja staničnih sastava. Međutim, zemlje poput Sjedinjenih Država odavno su uspostavile industriju za proizvodnju staničnog materijala za transplantaciju opeklina. Konkretno, tvrtka BioSurface Technology Inc., od 1989. godine, uzgojila je 37 000 višeslojnih slojeva keratinocita, koji su korišteni za liječenje 240 pacijenata u 79 zemalja svijeta (R. Odessey, 1992.), dok 1 cm 2 stanične kulture ^košta oko 7-8 američkih dolara.

Tehnologija liječenja raznih kožnih bolesti i problema ima niz razlika, ali svaki stanični tretman temelji se na dobivanju visokokvalitetnog staničnog materijala i njegovoj transplantaciji.

Ovaj proces se sastoji od sljedećih koraka:

• uzimanje kože od žrtava (ili od donora),
• transport kožnih režnjeva u biotehnološki centar,
• izolacija stanica bazalnog sloja i njihova proliferacija,
• rast višeslojnih slojeva keratinocita (MLK).
• transplantacija stanične kulture.

Glavni problem u provođenju liječenja transplantacijom višeslojnih keratinocitnih ploča je potreba za živim stanicama u svim fazama transplantacije stanica. Komadići kože za izolaciju autolognih ili alogenih stanica trebaju biti što tanji, jer ih je u tom slučaju lakše odvojiti mehaničkim i enzimskim metodama i dobiti suspenziju živih stanica za uzgoj. Mogu se dobiti rezanjem dermatomom ili korištenjem kože očnih kapaka, kožice i unutarnje površine ramena. S obzirom na to da su stanice osjetljive na halogene (klor, jod), vodikov peroksid, ne mogu se koristiti pri obradi kože tijekom uzimanja materijala.

Kvantitativni i kvalitativni prinos stanica iz kožnih transplantata i učinkovitost njihovog uzgoja također ovise o zdravlju i dobi darivatelja. Osim toga, biopsije kože moraju se što prije i pod odgovarajućim uvjetima (okolina, temperatura) dostaviti u laboratorij certificiran i akreditiran za te svrhe.

Za skladištenje i transport kožnih režnjeva može se koristiti Eagleov medij ili medij 199 s dodatkom 10% goveđeg seruma, DMEM medij s dodatkom 5% fetalnog goveđeg seruma i antibiotika.

U citološkom laboratoriju, biopsija kože se prvo mehanički dijeli na male komadiće, a zatim se komadići kože obrađuju enzimima: tripsinom, kolagenazom, dispazom itd.

Pod djelovanjem enzima, desmosomi se uništavaju, a keratinociti se oslobađaju u medij u obliku pojedinačnih stanica ili agregata koji se sastoje od različitog broja stanica. Za uzgoj se koriste samo bazalni keratinociti, koji se uzgajaju na posebnim medijima u termostatima koji sadrže 5% CO2, u Petrijevim zdjelicama ili u tikvicama na t = 37 °C. Već nakon 48 sati opaža se stvaranje kolonija keratinocita, koje se postupno spajaju i pretvaraju u monosloj. Nakon što se dobije dovoljan broj stanica, dobivena suspenzija se nasađuje na zavoje za rane pripremljene za tu svrhu i stavlja u Petrijeve zdjelice. Prvo se iz suspenzije formira monosloj, a zatim višeslojni sloj keratinocita. Faze procesa uzgoja keratinocita shematski su prikazane na slici 12 (33,43,54,65).

Formiranje višeslojnog sloja keratinocita pogodnog za transplantaciju obično traje 7-10 dana. Ponekad je to razdoblje dulje, što ovisi o kvaliteti izvornog materijala (dob, zdravstveno stanje darivatelja, ispravnost prikupljanja materijala, kvaliteta korištenog medija itd.). Ako višeslojni sloj preraste, tada se na njegovoj površini mogu pojaviti stanice s pojavama apoptoze neprikladne za transplantaciju. Petrijeve zdjelice s višeslojnim slojevima keratinocita (MLK) uzgojenim u njima na pokrivačima za rane dostavljaju se u kliniku u posebnim spremnicima na temperaturi od najmanje +15° C.

Modificirana Greenova metoda za uzgoj MPC-a

U našem radu koristili smo višeslojni kamabrik kao pokrov za rane, napuštajući "Polypor" filmove s kojima smo započeli rad u eksperimentu sa štakorima. Stoga smo uzgojili višeslojne slojeve keratinocita na prethodno odmašćenom i sterilnom kamabriku, iako ni on nije optimalan pokrov za rane.

Klinička istraživanja provedena su na volonterima uz poštivanje potrebnih etičkih standarda: potpisivanje ugovora i informiranog pristanka.

1. Korištena je kultura pacijentovih vlastitih (autolognih) i pohranjenih (alogenih) keratinocita.
2. Pacijentovi vlastiti keratinociti dobiveni su iz komadića kože izrezanog s unutarnje strane njihovih nadlaktica.
3. Operacija dermoabrazije ožiljaka provedena je termokauterizacijom, rotacijskim diskovima i erbijskim laserom.
4. Uzete su skupine pacijenata s normotrofičnim, hipotrofičnim i hipertrofičnim ožiljcima.

Tehnološki proces primjene stanične tehnologije za poboljšanje izgleda ožiljaka na koži sastojao se od sljedećih faza:

1. Odabir pacijenta.
2. Objašnjenja suštine tretmana, vremenskog okvira za postizanje očekivanih rezultata, potpisivanja ugovora i informiranog pristanka.
3. Pacijentima 2-3 tjedna prije operacije propisati selmevit 1 tabletu 3 puta dnevno, zinktheral 1 tabletu 3 puta dnevno.
4. Uzimanje komadića kože duljine 2,0 cm i širine 0,7-1,0 cm s unutarnje površine ramena, visoko, gotovo u donjem dijelu aksilarne regije, radi dobivanja autolognih keratinocita.
5. U slučajevima gdje su pacijenti odbili izolaciju vlastitih keratinocita zbog mogućnosti linearnog ožiljka na unutarnjoj površini ramena, stanični materijal je uzet iz stanične banke (alogeni keratinociti).
6. Keratinociti su izolirani i uzgojeni u laboratoriju certificiranom za ovu vrstu rada.
7. Nakon što je dobivena dovoljna količina MPC-a za transplantaciju na ožiljke, određen je dan za operaciju u klinici, gdje je materijal donesen u posebnim posudama u Petrijevim zdjelicama.
8. Izvršena je operacija dermoabrazije ožiljka, hemostaza, polirana površina je isprana sterilnom otopinom soli, osušena, nakon čega su na nju transplantirane MPC-e na sterilni kambrik "stanicama prema dolje". To jest, stanice koje su bile gore u MPC-u pokazale su se donjim, uz poliranu površinu.
9. Na vrh je nanesena sterilna folija koja je pričvršćena na kožu elastičnim zavojem ili elastičnim Omnifix flasterom. Umjesto folije mogu se koristiti indiferentni zavoji za rane koji sadrže silikon, na primjer Mepitel, Mepiform, silikonske gel obloge.

Nakon 5-7 dana, film ili silikonski premaz se uklanja. Do tada bi svi keratinociti trebali dospjeti na polirani ožiljak i pričvrstiti se za njegovu površinu.

10. Vlažna okolina stvorena ispod filma i silikonskog premaza aktivno doprinosi tome. Kambrik koji od ove točke dalje ostaje na ožiljku može se natopiti kuriozinom ili kitozanskim gelom. Kao rezultat toga, drugog dana stvara se gusta kora koju je, radi udobnosti pacijenta, najbolje fiksirati elastičnim, prozračnim flasterom, poput Omnifixa. Prozračna kora omogućuje formiranoj epidermi da se diferencira i pretvori u zrelu.

Ovisno o vrsti ožiljka i dubini brušenja, zavoj se odbacuje nakon 8-10 dana. U ovom trenutku epiderma ima 30-40% više staničnih slojeva nego u normalnoj koži. Bazalna membrana nije formirana. Keratinociti zadebljane epiderme luče mnogo biološki aktivnih molekula u ožiljno tkivo.

Uspjeh biotehnološkog liječenja ožiljaka uvelike ovisi o načinu njege u postoperativnom razdoblju. Stanične kulture su "nježan" tip pokrivanja rana i u ranim fazama nakon transplantacije, IPC-i se lako mogu odlijepiti od temeljnih tkiva. Stoga se pacijentima savjetuje da nakon operacije pažljivo rukuju ožiljkom. Tijekom 8-9 mjeseci ne trljati i nježno tretirati hladnom prokuhanom vodom kako bi se izbjeglo kidanje tanke, novostvorene epiderme, koja nema čvrstu vezu s temeljnim tkivima.

Bilješka.

Prije operacije i tijekom dermabrazije dopuštena je upotreba halogeniranih antiseptika i oksidansa (jodopiron, suliodopiron, jodinol, jodinat, klorheksidin, vodikov peroksid), prije transplantacije stanica - strogo je kontraindicirana zbog njihovog citotoksičnog učinka. Metilensko plavo i briljantno zeleno također su toksični za stanice.

Kako bi se izbjegla infekcija, posebno pri radu s hipertrofičnim ožiljcima, kirurško polje može se tretirati neomicin sulfatom, polimiksinom ili gentamicinom. Oni nemaju citotoksični učinak na keratinocite.

Kao rezultat takvog tretmana postiže se trostruki učinak.

1. Izravnavanje površine ožiljka.
2. Stvaranje sloja nove epiderme normalne debljine iznad njega.
3. Transformacija ožiljnog tkiva u tkivo slično dermi zbog djelovanja citokina, faktora rasta i drugih biološki aktivnih molekula koje luče transplantirane stanice, a stimuliraju keratinocite, fibroblaste i makrofage.

Ožiljak postaje manje uočljiv, elastičniji, u njemu se pojavljuju pore i velus dlake, a pigmentacija se može obnoviti zbog prisutnosti melanocita u IPC-u.

Međutim, svi ovi pozitivni aspekti ožiljka ne javljaju se odmah. U tom smislu, potrebno je upozoriti pacijente da se proces transformacije ožiljnog tkiva u dermalno tkivo odvija sporo i optimalni rezultat takvog liječenja može se očekivati najranije za 10-14 mjeseci. Odmah nakon odbacivanja obloga, polirane površine imaju izraženu polikromiju, što su svjetlije što je poliranje dublje provedeno. Najmanje oštećenje kože primjećuje se pri poliranju normotrofičnih ožiljaka erbijskim laserom. Boja ožiljaka i okolne kože obnovljena je unutar 3 do 8 tjedana. Unatoč takvim mjerama opreza, ponekad se javlja postoperativna hiperpigmentacija koja može sama nestati unutar nekoliko mjeseci.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]