Eksperimentalni rad na transplantaciji alogenih keratinocita na umjetno stvorene ožiljke bijelih štakora

Želja za korištenjem staničnih potencijala i potrebom traženja novih učinkovitih metoda za poboljšanje estetskog izgleda ožiljaka dovela je do ideje pokušavanja proučavanja mogućnosti transplantacije keratinocita na ožiljke.

Kako bi se dokazalo mogućnost korištenja keratinocita kulture kako bi se poboljšala izgled ožiljaka eksperimentalni rad je učinjeno na bijelim laboratorijskim štakorima, koji su nastali ožiljak površinu. Model buraga štakora dobiven je kao rezultat liječenja umjetno nanesenih rana na leđima, duž kralježnice. Štakori su rezani komada iste kože, veličine 2x3 cm. Nakon 2,5 mjeseca nakon operacije „simulacija ožiljke” štakora je provedeno Dermoabrazija operaciju (uklanjanje gornjih slojeva preko ignioperation buragu) i transplantiranih transplantiranih keratinocita, izoliran od kože mladih štakora 2-4 dana nakon rođenja.

Izolacija i rast epidermocita štakora provedena je u laboratoriju staničnih tehnologija Instituta za citologiju RAS sljedeće tehnologije.

Koža se ispere Hank slanoj otopini koja sadrži 200 U / ml gentamicina, isječen u male komadiće, na površini od 0,2-0,5 cm ². Kubice kože inkubirane su u 0,5% -tnoj otopini disazaze u uravnoteženoj fiziološkoj otopini puferiranoj slanom otopinom fosfata na 37 ° C tijekom jednog sata. Dijelovi su zatim preneseni u Dulbeccoovu fosfatno puferiranu fiziološku otopinu, a epiderma je odvojena od dermisa. Epiderma se inkubira u 0,125% otopine tripsina tijekom 10-15 minuta, uz miješanje pri brzini od 50 okr / min, nakon čega je enzim zaustavljena dodatkom 5% fetalnog goveđeg seruma. Trećina dobivenog suspenzije stanica se koristi u čistom obliku za jednu od opcija transplantirati ožiljaka, drugi treći uzgojene na domaćem biokompatibilnog premaza filma „Polipor”, treći - na petrijevku bez supstrata. Rad Dermabrasion dobiven ožiljke kod štakora s naknadnim prijenos na njih epidermotsitov štakora pod anestezijom je provedeno pomoću ispaljivanje.

Prva grupa štakora nakon dermoabraziji na polirane, isprana sa otopinom soli i osušen na površini sterilne burag preklapaju komada travnjak, koji je pohranjen kodirani kaše alogeničnih štakor epidermotsitov pri koncentraciji od 1,5 milijuna stanica po 1 ml (prema Instituta citologiju). Batist komada naslagani na poliranog ožiljak, tako da se stanice formiraju na površini ožiljak. Zavoj na vrhu nekoliko slojeva gaze, koja je ušivenim na rubovima ožiljak.

Dio rezultirajuće suspenzije stanica stavljen je u Petrijeve posude na sterilnim Polypore filmovima odrezanim u obliku šalica, a drugi dio na Petrijeve posude bez filma. Uzgoj je proveden u FAD mediju koji se sastoji od smjese DMEM i F12 u odnosu 3: 1. S dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma, 5 ug / ml inzulina (Sigma), 0,5 ug / ml hidrokortizon hemisukcinata (Sigma). 10 μg / ml epidermalni faktor rasta EGF (Institut za citologiju RAS, St. Petersburg). Druga i treća skupina štakora s 7 pojedinaca operirana su 6 dana nakon prvog. Do tog se vremena formiraju višeslojni slojevi od suspenzije sjemena keratinocita u Petrijevim posudama, koje su transplantirane u štakore. Druga skupina je transplantirana s epidermocitima na filmu, treću skupinu - s višeslojnim slojem bez supstrata. Nakon 7 dana, višeslojni slojevi alognih keratinocita (MPALK), posijani na Polypore filmovima, transplantirani su kulturom izravno na površinu rane. Iznad, film kako bi se izbjegao njezino kopiranje, bio je fiksiran s višeslojnim gaza i prelivena na kožu štakora.

Prije presađivanja keratinociti treću skupinu štakora uzgajati bez podloge, proizvodi odvajanje od PAC dnu Petri posuda dispase liječenja, imaju sposobnost da selektivno probiti Dermo epidermalnog komunikaciju. Pod djelovanjem višeslojnom rezervoara dispase uništava vezu sloja bazalnih stanica na dnu Petrijevoj posudi te u znatno manjoj mjeri, to utječe na međustaničnu komunikaciju, što ga čini moguće da se „ukloniti” cijeli sloj. Odvajanje stanica formiranja višeslojnog dispase provedeno je kako slijedi. Od Petrijevim pomiješan transportni medij, stanične ploče su isprane tri puta s antibioticima medij koji sadrži, posebno - gentamicin (0,2 mg / ml). Višeslojni slojevi prelije 0,125% otopine dispase (Sigma «»), te stavi u inkubator, gdje su inkubirane u t = 37 ° C za 20-30 minuta. Pojava bijelu krunicu, ljuštenje oko oboda spremnika - pokazatelj početka procesa odvaja od rubova i dnu Petri posude. Nekoliko minuta nakon početka postupka razdvajanja, dispase otopina ispražnjen 2-3 puta epitela slojevi isperu s medijem. O je primijenjena površina epidermalnog sloja, izrezati na veličinu cup komad sterilne rane „Leith-boje, koja se cijepa odvoji dispase formaciju, daljnje razdvajanje sloja dnu šalice s lopaticom. Koristeći oftalmoloških pincete sloj, zajedno sa bojenjem ubrusa” Leith-bojom „(Russian ) odvojila od dna Petrijevoj zdjelici i pažljivo prenijeti na pripremljenu površinu ožiljak. Salvete „Lita boje” sadrži u svom sastavu i gentamicin eksolin (ekstrakt kolagen), koji kada je mokro okruženje ostaje izdanak u budućnosti Šem slana otopina popeo i postao moderan rana premaz koji pruža dobru zaštitu od vanjskih infekcija i brzog ozdravljenja zbog početna vlažnost sa strukturom.

Poliprop filmovi i Lita-boja od soje su slojeveni s gaza zavojima koji su šivati na kožu štakora za više izdržljive fiksacije. Svaki štakor bio je zasađen u zasebnom kavezu, kako bi se stvorili optimalni uvjeti za njegovo održavanje i presađivanje transplantiranih keratinocita. Zavoji su štakori koji svakodnevno transplantirane ovjes i višeslojnu rezervoar epidermotsitov shot dispase, nekoliko puta dnevno, navlažene sterilnom fiziološkom otopinom stvoriti najpovoljnije uvjete stanice za presatka. S obzirom da je film "Polypor" bio nepropustan za vodu, štakori druge skupine nisu navlažili zavoje, što je bila jedna od prednosti nad transplantacijama bez filmova. Nakon 10 dana, zavoji su uklonjeni. Klinička slika ožiljaka nakon transplantacije stanica razlikovala se malo od ožiljaka bez transplantacije, osim ružičaste boje (zbog dermoabrazije) i većeg pilinga. Ta činjenica upućuje na to. Da je odmah nakon nestanka rana obloge s IPC-om, u buragu nije došlo do promjena.

Uzimanje biopsije u štakora.

Nakon 1, 2, 5 i 9 mjeseci nakon transplantacije keratinocita na tlo štakora allogichnyh ožiljci bijelih štakora, to proizvedenog materijala za histološku, cytomorphological i mikroskopske studije. Kao kontrolni uzorci normalne štakorske kože i ožiljaka uzeti su bez transplantacije stanica. Anestezija kod štakora provedena je eterskom anestezijom.

Nakon anestezije, iz označenih područja, u koje su transplantirane keratinocite, biopsija bušilac promjera 2 mm. Dijelovi ožiljnog tkiva uzeti su i stavljeni u 2,5% -tnu otopinu glutaraldehida radi pripreme materijala za elektronsku mikroskopiju. Komadi tkiva uzeti za histološki pregled su bili smješteni u 10% otopini neutralnog formalina i zatim se preko ožičenja alkohola i napuni u parafin, nakon čega slijedi rezanje od ultra-tankog dijelova te ih gledate u svijetlo-optički mikroskop.

Kontrola I. Uobičajena koža štakora.

Da bi se vidjela razlika između mikroskopske slike normalne ožiljke promijenjene kože štakora i ožiljaka u određeno vrijeme nakon IPC transplantacije, fotografije i opisi na njima u svim fazama ove studije su pokazali.

Epiderme normalne kože sastoje se od 7-9 slojeva stanica. Horny sloj umjerene debljine. Na mjestima se sastoji od 6-8 slojeva horny skala. Bazalni sloj predstavljaju stanice cilindričnog oblika s velikim svjetlom, redovnim jezgrama i nekoliko nukleola. Desmosomske veze između stanica i bazalne membrane jasno se izražavaju. Pod dobro definiranom bazalnoj membrani koja ima fine izbočenja u potkožnim sloj leže paralelno s blagim snopovima vlakana kolagena i elastina, uključujući izduženih fibroblasta, manjih plovila. U dubljim slojevima, snopovi vlakana kolagena i elastina leže u različitim smjerovima. Među njima postoji mnogo posuda s tankim zidovima istog kalibra, staničnih elemenata (fibroblasti, mastociti, leukociti). U velikom broju folikula dlake, žlijezde lojnice.

Kontrola 2. Šaren od štakora 2 mjeseca.

Klinička slika. Ožiljci blijedo ružičasti, s pilingom, mjestimično ostaju kore. Njihova površina je smanjena zbog kontrakcije kolagenih vlakana i postaju približno 3,0-3,5 cm ^:. Odsutni su privjesci za kožu.

Mikroskopska slika. Epiderme se sastoji od 3-5 sloja stanica, nabrane, prikazanih zaobljenim bazalnih stanica, jedan red šilo, 1-2 redovi keratohyalin granule sa zrncima u gornji sloj, postoje dijelovi unutarstanične edema. Srž rožnice se heterogeno mijenja od vrlo tankih do zadebljanja. Postoji sklapanje buraga zbog (kontrakcije) ožiljnog tkiva. Pregače prodiru do papilarnog sloja i daju dojam papila. Granica između epiderme i dermisa je ravna linija. Bazalna membrana ne može se pratiti posvuda. U donjem dijelu subepidermalnih i dubljih slojeva - posuda s debelim, rastresenim zidom, mnogo pusta, s fenomenom staza. Oko plovila - klaster makrofaga, fibroblasta. Makrofagi okružuju eritrocite koji izlaze iz kapilara i fagocitiziraju ih. U više površinskih slojeva - male kapilare. Pod epidermom, kolagenska vlakna su labav. U dubljim slojem buraga - grubih vlakana kolagenskih vlakana među kojima postoje mnogi fibroblasti.

Iscjeljivanje štakora mjesec dana nakon presađivanja keratinocita MPAl štakora štakora.

Klinička slika. Ožiljci su bili ružičasti, njihova je površina pala, osobito u promjeru i prosječno 2,5-3 cm ². Odsutne su kose i žlijezde lojnice.

Te mikroskopski pregleda materijala dobivenog iz štakora s transfer MPAlK MPAlK na film i supstrata, bez bitno identični. Međutim, tehnički, rad s MPAlK podržan puno teže i naporan nego kada se uzgaja MPAlK na podlogu, tako da je daljnje istraživanje tog problema na transplantaciju kertainotsitov ožiljci smo koristili kao temelj za uzgoj ( „podloge”) slojevita travnjak.

Mikroskopska slika. Postoji zadebljanje epiderme na 15-20 slojeva, gotovo do sredine kojih keratinociti imaju uski, izduženi, vertikalni oblik i kompaktan raspored. Bazalne stanice su raspoređene u neravnomjernu liniju. Njihove jezgre su lagane, velike, okrugle, s jednim ili dva nukleola, što ukazuje na njihovu visoku sintetičku i proliferativnu aktivnost. Granica između epiderme i dermisa je ravna linija. Trnoviti sloj je dobro razvijen, sastoji se od 3-5 slojeva ćelija okruglog oblika, ima 2 nukleotidne stanice.

Neposredno ispod bazalne membrane - gusto locirane tanke snopove kolagenskih vlakana, paralelno s njima veliki broj praznih posuda, dublji kolagenski vlakovi su grublji, sakupljeni u gustim snopovima. Mnogi veliki fibroblasti, mastociti (2-3 u vidnom polju), makrofagi, leukociti i prazne posude, čije su zidove otpuštene, oko njih su labavi kolagenski vlaknici. U nekim posudama - staza, diapedesis jednolikih elemenata. Oko žila - fibroblasti, pojedinačni limfociti. Odsutni su privjesci za kožu.

Kada je suspenzija keratinocita transplantirana na polirani ožiljak, mikroskopska slika se razlikuje od prethodne. U većini životinja - epiderma je tanka, sastoji se od 5-6 slojeva stanica. Donji sloj se sastoji od stanica nepravilnog, poligonalnog oblika s okruglim neredovitim jezgrama. Stanje subepidermalnog sloja je slično onom u skupini životinja bez transplantacije.

U ovom slučaju, može se govoriti o odgađanju procesa koji prate transplantaciju stanica ili velikog gubitka stanica transplantiranih u obliku suspenzije. Stoga je zaključeno da je korekcija scarringa transplantacijom keratinocita u obliku suspenzije nije poželjno.

Ožiljak štakora 2 mjeseca nakon transplantacije keratinocita MPAl štakora štakora.

Klinička slika. Ožiljak izgleda tanak, nježan. Na mjestima postoji ekdicija, ljestvica.

Mikroskopske slike. Sloj kornea je zadebljan, mjestimično - hiperkeratoza. Epiderma je zgusnuta, sastoji se od 12-20 redaka stanica. Granica između epiderme i dermisa je ravna linija. Osjetljiva kolagenska vlakna ispod epiderme leže prilično čvrsto. U dubljim slojevima buraga prikupljaju se u grubim velikim snopovima. U subepidermalnom sloju pojavljuje se nova tvorba posuda. U donjim slojevima ožiljnog tkiva - mnoge prazne posude, smještene paralelno s površinom epiderme. Veliki fibroblasti su ravnomjerno raspoređeni u debljini buraga, postoje divovski, višestruki, mnogi makrofagi.

Ožiljak štakora 5 mjeseci nakon transplantacije MP štakorskih spermocita.

Klinička slika. Ožiljak izgleda glatka, glatka, bez ljuštenja, postoji jedan kosa njihove veće gustoće na periferiji ožiljak, što ukazuje na rub urastao kose folikula u buragu i novotvorina folikula. Područje ožiljaka nastavlja se smanjivati.

Mikroskopska slika. Epiderma je još uvijek gusta (15-20 slojeva, ponekad i do 30) u gornjim slojevima ispunjena keratogialin žitaricama. Bazna membrana je jasno vidljiva. Pod njezinim kolagenskim vlaknima leži. U donjim slojevima - kolagen je snažniji i čvrsto upakiran. Među gredama kolagena postoje mnoge kapilare. U gornjim slojevima smanjen je broj praznih žila. Epidermis i dermis su blago valoviti. Postoje duboki epidermalni outgrowths u ožiljak tkiva. Među kolagenskim vlaknima vidljive su novoformirane posude. Pojavljuju se folikuli kose i sebaceous žlijezde.

Ožiljak štakora 9 mjeseci nakon transplantacije epidermocita štakora IPA štakora.

Klinička slika. Ožiljci su puno manji u odnosu na ranija razdoblja, a njihova površina u prosjeku oko 1,5-2,0 cm ². Ožiljci su neravnomjerno prekriveni tankom kosom, osobito oko periferije. Manja skala malih ploča zadržana su.

Mikroskopska slika.

Epidermis je postao tanji, zastupljen od 6-8 redova ćelija, podsjećajući na epidermalnu strukturu normalne kože štakora, samo gustoću stanica za 1 mm. Veći i manji. Bazalni sloj sastoji se od malih ćelija okruglog-cilindričnog oblika. Bazna membrana je dobro definirana, hemidosomi su jasno vidljivi. Zabilježena je prisutnost epidermalnih outgrowths u subepidermalnom sloju. Papilarni sloj se izražava duž cijele dužine ožiljka. Ove činjenice pokazuju da je za ovo vremensko razdoblje prianjanje transplantiranih keratinocita postalo puno više izdržljivo s temeljnim tkivom buraga. Prema tome, briga o ožiljcima ljudi s transplantacijom MALC 9 mjeseci nakon transplantacije IPC može biti tradicionalna. Pod epidermom su osjetljivija kolagenska vlakna nego u dubokim slojevima. Bilo je mnogo posuda, osobito površno smješteno. U većim posudama, zidovi su zadebljali. Folikuli kose i lojalne žlijezde u velikim količinama. Mikroskopski uzorak nalikuje dermalnom tkivu.

Rezultati eksperimentalnog rada i njihove diskusije.

Tijekom tog rada na umjetne kože ožiljaka štakora nakon operacije dermoabrazija, transplantiranih keratinocita u raznim formah- na rana površinama, kao suspenzija u batist i slojevite formacije bez podloge. Rad je napravljen da se dobiju morfološki podaci o djelovanju transplantiranih allogenskih keratinocita na ožiljke, kao i određivanje optimalnih varijanti transplantata.

Utvrđeno je da su sve tri metode transplantacije stvarne, ali transplantacija IPAA bez supstrata je vrlo naporan postupak, tijekom kojeg IPAC može biti ozlijeđen, što utječe na rezultate transplantacije. Štoviše, ova metoda transplantacije isključuje rad na velikim površinama.

Transplantacija keratinocita suspenzija - značajno ekonomičnije metode ne zahtijeva dugo kultiviranju stanica i jednostavan je u ovom ostvarenju, kontakt pomoću sterilne fina pripremaka, dimenzija koje odgovaraju vrijednosti ožiljaka. Zakašnjenje terapijskog učinka tijekom presađivanja stanične suspenzije oko mjesec dana u usporedbi s MIC na ovojnici rana nije značajan trenutak s trajnošću liječenja, izračunatog u mnogo mjeseci. Poznato je da tijekom transplantacije IPC-a spali bolesnike, transformacija stanja strukture kože postupno se dogodila nekoliko godina. Transplantacija keratinocitne kulture na obloge rana je najprikladnija i obećavajuća metoda, međutim, ona je također puno skuplja. Osim toga, zahtijevajući za danas traženje sofisticiranih premaza koji moraju biti plastični, higroskopni, imaju bakteriostatska ili baktericidna svojstva i biološki su neutralni za stanice. Film „Polipor” - intermedijer verzija domaćeg pokrivenost filma rane, unatoč nekim nedostacima, nas je dozvoljeno učiti eksperimentalno keratinocitnih transplantacijske štakora na ožiljke i izvući zaključke o učinkovitosti tog smjera atrakcija ožiljaka.

Autori koji su izvršili transplantaciju IPC na spaljene rane primijetili su da je tijekom prvog tjedna nakon presađivanja višeslojnog keratinocitnog sloja na sterilizirane rane epiderme zadebljane i stratificirane. Svi slojevi epiderme bili su dobro definirani. Zanimljivo je da je broj staničnih slojeva u transplantacijama 10-30% veći nego kod uzoraka biopsije kože. Autori su zabilježili pojavu granula keratogiinina 5. Dan nakon transplantacije MPA, bazalne membrane i hemidesmosoma - već treći dan.

J.Rives i suradnici (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) su utvrdili da je u ranoj perioda nakon transplantacije BMD pacijenata s polnosloynymi oštećenja kože nakon opeklina, komunikacija između dermisa i epidermisa je vrlo slab i ravna linija, papilarni sloj je odsutan. Do kraja drugog mjeseca počinje formiranje plitkog papila i prstena kože, veza između dermisa i epiderme postaje trajnija. Podaci o literaturi govore o presađivanju allogenskih keratinocita na rane spaljenih bolesnika, kao obećavajuće metode. Unatoč činjenici da je odbacivanje alogeničnih keratinocita događa podnijela različitih autora u razdoblju od 10 dana do 3 mjeseca, međutim, oni imaju ulogu u ozdravljenje površinu rane, objavljivanju faktore rasta i mehanički zatvaranje defekta. Vjeruje se da MPALK ima smanjenu antigensku aktivnost jer tijekom kultiviranja in vitro Langerhansove stanice gube, što im omogućuje da dugo postoje u organizmu primatelja. Osim toga, alogenijska kultura dobivena iz kože mladih zdravih ljudi ima neusporedivo veći biološki potencijal od autologne kulture pacijenata nakon traume.

Glavni cilj našeg istraživanja bio je utvrditi hoće li alogeni keratinociti preživjeti na ožiljcima i što će biti promjene ožiljnog tkiva pod utjecajem takvog biološki aktivnog "rana prevlaka". U slučaju pozitivnog rezultata, izradite najučinkovitije i najmanje radno intenzivne tehnologije u ovom području medicinske rehabilitacije.

Podaci dobiveni od nas u mnogim aspektima pokazali su se sličnima literaturnim podacima o morfološkim promjenama koje se javljaju u ljudskoj epidermisu nakon prijenosa allogenskih keratinocita u plućne ozljede. No, postoje značajne razlike, kako u morfološkoj podlozi, koja je transplantirana, tako iu pogledu tehnologije. So. Proces formiranja bazalne membrane i dermo-epidermalnih veza (hemidosomi, papillae) pojavljuje se kasnije nego u transplantaciji keratinocita na rane površine bez promjena ožiljaka. Čini se da to izgleda zbog slabe hranjivosti buraznog tkiva u usporedbi s dermisom ili mišićnom fascijom. Ožiljak, osobito stari, je gusto vezivno tkivo s vrlo malim brojem krvnih sudova, a dno plastične rane je granulacijsko tkivo bogato krvnim žilama. Stoga je očito da su uvjeti pod kojima se transplantacija i prerastanje keratinocita potpuno razlikuju. Što više vaskularizira područje presađivanja stanica, to je lakše obraditi ih. Iz ovog postulata postoji zaključak o sklonosti radu s mladim ožiljcima, u kojima je vezivno tkivo još dovoljno slobodno i bogato krvnim žilama.

Kao rezultat ovog eksperimentalnog rada, dokazano je da:

1. Moguća je transplantacija MALK-a na ožiljke. 
2. Optimalna metoda transplantacije je transplantacija keratinocita na poklopcu rane.
3. Površinu ožiljka trebalo bi mljeti pomoću operativne dermoabrazije pomoću Schumannovog lasera ili rezača.
4. Pod utjecajem MPALK pojavljuje se brzu epitelizaciju površine zemlje buraga.
5. Bolje vaskularizirano ožiljno tkivo, tj. Mlađi ožiljak, to su bolji rezultati transplantacije keratinocita.
6. Tkivo ožiljka pod utjecajem transplantiranih keratinocita postupno se transformira i pretvara u kožni oblik (više lomljiv ožiljak s dodacima kože).
7. Postupno labavljenje ožiljnog tkiva započinje subepidermalnim slojem. Poboljšava svoju vaskularizaciju, snop kolagenskih vlakana u gornjim i donjim dijelovima buraga zauzima lomljiviji položaj nego u ožiljak bez transplantacije stanica. Postoje folikuli dlačica i žlijezde lojnice. Epidermis u svojoj strukturi, nakon što prolazi kroz fazu hipertrofije, približava se epidermi normalne kože.
8. Uočene promjene se odnose na keratinocita izlučenih faktora rasta, citokini koji poboljšava trofizmu ožiljnog tkiva pridonosi njegovoj transformaciji iz krute vezivnog tkiva u blazi, što dovodi do poboljšanja ožiljak.

Stoga se na temelju ove studije može zaključiti da je blagotvoran učinak transplantiranih keratinocita na ožiljak, što može biti od praktičnog značaja za rehabilitaciju bolesnika s različitim vrstama ožiljaka.

Ovaj rad na štakorima omogućio je i formuliranje zahtjeva. Za obloge na ranu, na kojima se uzgajaju keratinociti.

Rana obloge trebaju biti:

• biokompatibilno sa stanicama,
• prozračna,
• imaju elastičnu bazu za oblikovanje,
• biti hidrofilni,
• jer medicinski aditivi sadrže antibakterijske lijekove i antioksidanti nisu toksični za uzgojene stanice.

Klinički rezultati biotehnološkog liječenja ožiljaka.

Ranije, N. Carver i sur. (1993) utvrdili su da su okluzivne vezice najbolje pričvrstiti na ranu i opstanak keratinocita, ali ne dopuštaju stvaranje slojevitog (zrele) epiderme. Da bi se oblikovala slojevita epidermisa, potrebno je zračno okruženje. Stoga, nakon pričvršćivanja višeslojnog sloja, nakon 7-10 je predloženo okluzivno rano prekrivanje radi uklanjanja i provođenja rana pod suhim zavojima ili u vodi topivim mastima. Možemo reći da je kvaliteta i svojstva za „podlogu” na kojem se uzgajaju stanice je vrlo važan trenutak za učinkovitost transplantacije staničnog materijala, a time i za rezultate rada liječnika. No danas nema idealnog rana, unatoč brojnosti predloženih opcija (umjetna koža, netkana tkanina karboksimetilceluloze, fibrinske prevlake, polupropusne poliuretanske folije). Nije nebitan trenutak u ovom slučaju je trošak "podloge" (posebni premazi za ranu), budući da njihovi visoki troškovi povećavaju ukupne troškove biotehnološkog tretmana.

Učinkovitost staničnih tehnologija dokazano je dosad, ali, nažalost, te tehnologije su vrlo skupe, posebno u zemljama u kojima industrijska proizvodnja staničnih kompozicija nije uspostavljena. Ipak, zemlje poput Sjedinjenih Država dugo su uspostavile industriju za proizvodnju staničnog materijala za transplantaciju spaljene. Konkretno, tvrtka BioSurface Technology Inc, od 1989. Godine, podigao 37.000 laminiranih slojeva keratinocita, koji su se koristili za liječenje od 240 pacijenata u 79 zemalja diljem svijeta (R.Odessey, 1992) sa 1 cm ² kulturi stanica košta oko 7-8 $ US.

Tehnologija liječenja raznih bolesti i problema s kožom ima brojne razlike, ali u srcu svakog tretmana sa stanicama je proizvodnja kvalitetnog staničnog materijala i transplantacije.

Ovaj se postupak sastoji od sljedećih koraka:

• odabir kože zahvaćene (ili od donatora),
• transport kožnih poklopaca u biotehnološki centar,
• izolacija stanica bazalnog sloja i njihova množenja,
• nakupljanje višeslojnih slojeva keratinocita (IPC).
• presađivanje staničnih kultura.

Glavni problem u liječenju presađivanjem višeslojnih keratinocitnih slojeva je potreba za održivim stanicama u svim fazama transplantacije stanica. Komadi kože za izolaciju autolognih ili alogenih stanica trebaju biti što je tanji, jer se u ovom slučaju lakše odvajaju mehaničkim i enzimskim metodama i dobivaju suspenziju živih stanica za rast. Oni se mogu dobiti rezanjem dermatoma ili pomoću kože kapaka, prepucija, unutarnje površine ramena. S obzirom da su stanice osjetljive na halogene (klor, jod), vodikov peroksid, ne mogu se koristiti u liječenju kože u trenutku uzimanja materijala.

Kvantitativni i kvalitativni prinos stanica od presadnica kože i učinkovitost njihova uzgoja također ovise o zdravstvenom stanju i dobi donatora. Uz to, uzorke biopsije kože trebaju se isporučiti u laboratorij što je prije moguće iu odgovarajućim uvjetima (okoliš, temperatura) isporučene ovlaštenom i akreditiranom laboratoriju.

Eagleov medij ili medij 199 uz dodatak 10% goveđeg seruma, DMEM medij koji se nadopunjuje s 5% fetalnog goveđeg seruma i antibiotici može se koristiti za pohranu i transport kožnih poklopaca.

U citološkom laboratoriju, kožna biopsija prvo se mehanički dijeli na male komadiće, a zatim se obradi fragmenata kože uz pomoć enzima: tripsina, kolagenaze, dispezije itd.

Pod djelovanjem enzima odvija se destrukcija pomoću desmosoma i keratinociti se oslobađaju u medij kao zasebne stanice ili agregati koji se sastoje od različitih brojeva stanica. Za kulturu se koriste samo bazalni keratinociti koji se uzgajaju na posebnim medijima u inkubatorima koji sadrže 5% CO., U Petrijevim posudama ili u bočicama pri t = 37 ° C. U roku od 48 sati dolazi do stvaranja keratinocitnih kolonija, koje se postupno konvergiraju u monosloj. Nakon dobivanja dovoljnog broja stanica, dobivena suspenzija se širi na pokrivače rane pripravljene u tu svrhu i stavljaju u Petrijeve posude. Iz suspenzije se prvo stvara jednolični sloj i zatim višeslojni sloj keratinocita. Shematski, faze procesa kultiviranja keratinocita prikazane su na slici. 12 (33,43,54,65).

Formiranje višeslojne keratinocitne formacije prikladne za transplantaciju obično traje 7-10 dana. Ponekad je ovo razdoblje dulje, što ovisi o kvaliteti izvornog materijala (dob, zdravlje donatora, ispravnost materijala, kvalitetu korištene medije itd.). Ako se višeslojni sloj nakuplja, onda na njegovoj površini mogu postojati stanice apoptoze koje nisu prikladne za transplantaciju. Petrijeva jela, uzgojena u njima na ranu pokrivenost višeslojnim slojevima keratinocita (IPC), isporučuju se u kliniku u posebnim spremnicima na temperaturi nižoj od + 15 ° C.

Modificirana Greenova metoda za rast IPC-a

U našem radu kao ranu premazu koristili smo višeslojni kamečer, napuštajući polipore filmove s kojima smo počeli raditi u eksperimentu sa štakorima. Dakle, višeslojni keratinocitni slojevi uzgojeni su na prefatu i sterilnom batistu, iako to nije optimalno pokrivanje rana.

Kliničke studije provedene su na volonterima uz poštivanje potrebnih etičkih normi: potpisivanje ugovora i informirani pristanak.

1. Primijenjena je kultura vlastitih (autolognih) i uzeta iz bananskih stanica (allogena) keratinocita.
2. Vlastiti keratinociti su dobiveni iz komadića kože izrezane iz unutrašnjosti ramena pacijenata.
3. Djelovanje dermabrasije ožiljaka provedeno je uz pomoć termo-spajanja, rotacijskih diskova i erbium lasera.
4. Skupine bolesnika s normotrofnim, hipotrofnim i hipertrofnim ožiljcima.

Tehnološki proces za primjenu stanične tehnologije za poboljšanje vrste kožnih ožiljaka sastoji se od sljedećih faza:

1. Odabir pacijenata.
2. Objašnjavanje suštine liječenja, vrijeme dobivanja očekivanih rezultata, potpisivanje ugovora i informirani pristanak.
3. Imenovanje pacijenata 2-3 tjedna prije operacije selmevit za 1t. 3 puta dnevno, zinkteral na 1t. 3 puta dnevno.
4. Uzimajući komad kože dužine 2,0 cm i širine 0,7-1,0 cm od unutarnje površine ramena, visok, gotovo na dnu aksilarne regije, kako bi se dobio autologni keratinociti.
5. U slučaju pacijenata koji odbijaju izolirati vlastite keratinocite zbog mogućnosti dobivanja linearnog ožiljka na unutarnjoj površini ramena, stanični materijal je preuzet iz stanične banke (allogeni keratinociti).
6. Keratinociti su izolirani i uzgajani u uvjetima laboratorijskog certifikata za ovu vrstu posla.
7. Nakon primitka IPC dovoljnog za transplantaciju, dan kirurškog zahvata bio je primijenjen na ožiljke na klinici, gdje je materijal doveo u posebne posude u Petrijevim posudama.
8. Dermabrasion operacija izvedena burag hemostaza tlo površina se ispere sterilnom fiziološkom otopinom, sušen, pri čemu je transplantirani u sterilnim MKP fina „stanice se”. To jest, stanice koje su bile gornje u MIC bile su niže, u blizini polirane površine.
9. Na vrhu je postavljen sterilni film koji je fiksiran na kožu s elastičnim zavojem ili Omnifix elastičnim trakom. Umjesto filma mogu se također upotrijebiti indiferentni premazi za ranu koji sadrže silikon, na primjer Mepitel, Mepiform, silikonski gel ploče.

Nakon 5-7 dana uklanja se film ili silikonski premaz. Do tog vremena svi keratinociti moraju puzati na polirani ožiljak i pričvrstiti na njegovu površinu.

10. Vlažno okruženje stvoreno pod filmom i silikonskim premazom aktivno pridonosi tome. Baptist koji ostaje na ožiljku iz ove točke može se impregnirati s kurioznim ili kitozinskim gelom. Kao rezultat toga, 2. Dana, stvara se gusta kora, koja je, radi pogodnosti pacijenta, bolje popraviti s elastičnom, propusnom zrakom, na primjer Omnifix. Prozračna kora omogućava novoformiranu epidermu da se razlikuje i pretvori u zrelo.

Ovisno o vrsti ožiljka i dubini mljevenja, odijevanje se odbacuje nakon 8-10 dana. Epidermis u ovom trenutku ima 30-40% više staničnih slojeva nego u normalnoj koži. Osnovna membrana nije formirana. Keratinociti od zadebljane epiderme oslobađaju masu biološki aktivnih molekula u ožiljak.

Uspjeh biotehnološkog liječenja ožiljaka u velikoj mjeri ovisi o načinu na koji se brinu o postoperativnom razdoblju. Stanične kulture su "natječajna" vrsta rana i u ranoj fazi nakon transplantacije BMD se lako može odvojiti od temeljnih tkiva. Stoga se bolesnicima preporučuje briga o ožiljku nakon operacije. Za 8-9 mjeseci, ne trljati i lako radite s hladnom vodom kako biste izbjegli skidanje tanke, novo stvorene epiderme koja nema čvrsto stisak s temeljnim tkivom.

Napomena.

Prije operacije i za vrijeme upotrebe halogeniranih Dermabrasion oksidansa i konzervansa (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, klorheksidin, vodikov peroksid) je prije presađivanja kletok- apsolutno kontraindicirana uslijed svojih citotoksičnih učinaka dopuštena. Otrovne za stanice su također metilen plavi. Sjajno zeleno.

Da bi se izbjegla infekcija, naročito kada se radi s hipertrofnim ožiljcima, moguće je tretirati područje djelovanja s neomicin sulfatom, polimiksinom ili gentamicinom. Oni ne pokazuju citotoksični učinak na keratinocite.

Kao rezultat ovog tretmana postiže se trostruki učinak.

1. Usklađivanje površine buraga.
2. Izradite sloj iznad nje nove epiderme, normalne debljine.
3. Pretvorba ožiljak tkiva u dermopodobnuyu djelovanjem citokina, faktora rasta i drugih bioaktivnih molekula koje luče transplantiranih stanica i keratinocita stimuliranih njih, fibroblaste i makrofage.

Ožiljak postaje manje vidljiv, elastičniji, pora se pojavljuju u njoj, dlačica, pigmentacija se može obnoviti zbog prisutnosti melanocita u MPC.

Međutim, svi ti pozitivni trenuci u kicatriji ne dolaze odmah. U tom smislu potrebno je upozoriti pacijente. Da je proces transformacije ožiljnog tkiva u dermis spor i optimalni rezultat takvog liječenja može se očekivati najranije u razdoblju od 10-14 mjeseci. Neposredno nakon odstranjivanja odjeće, polirane površine imaju izraženu polikromiju, to je svjetlije proces brušenja. Najmanje oštećenje kože dolazi kada brušenje normotrofnih ožiljaka erbium lasera. Boja ožiljaka i okolne kože restaurirana je u razdoblju od 3 do 8 tjedana. Unatoč takvim mjerama opreza, ponekad postoji postoperativna hiperpigmentacija, koja može ići neovisno nekoliko mjeseci.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]