Hematopoetske matične stanice žumanjčane vrećice

Očito je da su različiti proliferativni i diferencijacijski potencijali hematopoetskih matičnih stanica određeni osobitostima njihovog ontogenetskog razvoja, budući da se čak i lokalizacija glavnih područja hematopoeze mijenja kod ljudi tijekom ontogeneze. Hematopoetske progenitorske stanice fetalne žumanjčane vrećice posvećene su formiranju isključivo eritropoetske stanične linije. Nakon migracije primarnih HSC-a u jetru i slezenu, spektar linija posvećenosti širi se u mikrookruženju tih organa. Konkretno, hematopoetske matične stanice stječu sposobnost stvaranja stanica limfoidne loze. U prenatalnom razdoblju, hematopoetske progenitorske stanice dosežu zonu konačne lokalizacije i naseljavaju koštanu srž. Tijekom intrauterinog razvoja, fetalna krv sadrži značajan broj hematopoetskih matičnih stanica. Na primjer, u 13. tjednu trudnoće razina HSC-a doseže 18% ukupnog broja mononuklearnih krvnih stanica. Nakon toga se opaža progresivno smanjenje njihovog sadržaja, ali čak i prije rođenja, količina HSC-a u krvi pupkovine malo se razlikuje od njihove količine u koštanoj srži.

Prema klasičnim konceptima, prirodna promjena lokalizacije hematopoeze tijekom embrionalnog razvoja sisavaca provodi se migracijom i unošenjem u novo mikrookruženje pluripotentnih hematopoetskih matičnih stanica - iz žumanjčane vrećice u jetru, slezenu i koštanu srž. Budući da u ranim fazama embrionalnog razvoja hematopoetsko tkivo sadrži veliki broj matičnih stanica, koji se smanjuje kako fetus sazrijeva, najperspektivnijim za dobivanje hematopoetskih matičnih stanica smatra se hematopoetsko tkivo embrionalne jetre, izolirano iz pobačenog materijala u 5-8 tjednu gestacije.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Pitanja o podrijetlu hematopoetskih matičnih stanica

Nema sumnje da embrionalno stvaranje eritrocita potječe iz krvnih otoka žumanjčane vrećice. Međutim, potencijal diferencijacije in vitro hematopoetskih stanica žumanjčane vrećice vrlo je ograničen (one se uglavnom diferenciraju u eritrocite). Treba napomenuti da transplantacija hematopoetskih matičnih stanica žumanjčane vrećice nije u stanju dugo vremena obnoviti hematopoezu. Pokazalo se da te stanice nisu prekursori odraslih HSC-a. Pravi HSC-ovi pojavljuju se ranije, u 3.-5. tjednu intrauterinog razvoja, u zoni stvaranja želučanog tkiva i endotela krvnih žila (paraaortalna splanhnopleura, P-SP), kao i na mjestu aorte, gonada i primarnih bubrega - u mezonefrosu ili tzv. AGM regiji. Pokazalo se da su stanice AGM regije izvor ne samo HSC-a, već i endotelnih stanica krvnih žila, kao i osteoklasta uključenih u procese stvaranja koštanog tkiva. U 6. tjednu trudnoće, rane hematopoetske progenitorske stanice iz AGM regije sele se u jetru, koja ostaje glavni hematopoetski organ fetusa do rođenja.

Budući da je ova točka izuzetno važna s gledišta transplantacije stanica, problem podrijetla HSC-a u procesu ljudske embriogeneze zaslužuje detaljniji prikaz. Klasične ideje da hematopoetske matične stanice sisavaca i ptica potječu iz ekstraembrionalnog izvora temelje se na istraživanjima Metcalfa i Moorea, koji su prvi koristili metode kloniranja HSC-a i njihovih potomaka izoliranih iz žumanjčane vrećice. Rezultati njihovog rada poslužili su kao osnova za teoriju migracije, prema kojoj HSC-i, nakon što se prvo pojave u žumanjčanoj vrećici, sekvencijalno naseljavaju prolazne i definitivne hematopoetske organe kako se u njima formira odgovarajuće mikrookruženje. Tako je utvrđeno stajalište da stvaranje HSC-a, u početku lokaliziranih u žumanjčanoj vrećici, služi kao stanična osnova za definitivnu hematopoezu.

Hematopoetske progenitorske stanice žumanjčane vrećice pripadaju kategoriji najranijih hematopoetskih progenitorskih stanica. Njihov fenotip opisan je formulom AA4.1+CD34+c-kit+. Za razliku od zrelih HSC koštane srži, one ne eksprimiraju Sca-1 antigene i MHC molekule. Čini se da pojava marker antigena na površinskim membranama HSC žumanjčane vrećice tijekom kultivacije odgovara njihovoj diferencijaciji tijekom embrionalnog razvoja s formiranjem predanih hematopoetskih linija: razina ekspresije CD34 i Thy-1 antigena se smanjuje, ekspresija CD38 i CD45RA se povećava, a pojavljuju se HLA-DR molekule. Naknadnom specijalizacijom in vitro induciranom citokinima i faktorima rasta počinje ekspresija antigena specifičnih za hematopoetske progenitorske stanice određene stanične linije. Međutim, rezultati proučavanja embrionalne hematopoeze u predstavnika tri klase kralježnjaka (vodozemci, ptice i sisavci) i, posebno, analiza podrijetla HSC-a odgovornih za definitivnu hematopoezu u postnatalnoj ontogenezi, proturječe klasičnim konceptima. Utvrđeno je da se kod predstavnika svih razmatranih klasa tijekom embriogeneze formiraju dvije neovisne regije u kojima nastaju HSC-ovi. Ekstraembrionalna „klasična“ regija predstavljena je žumanjčanom vrećicom ili njezinim analozima, dok nedavno identificirana intraembrionalna zona lokalizacije HSC-ova uključuje paraaortalni mezenhim i AGM regiju. Danas se može tvrditi da kod vodozemaca i ptica definitivni HSC-ovi potječu iz intraembrionalnih izvora, dok se kod sisavaca i ljudi sudjelovanje HSC-ova žumanjčane vrećice u definitivnoj hematopoezi još ne može u potpunosti isključiti.

Embrionalna hematopoeza u žumanjčanoj vrećici je, zapravo, primarna eritropoeza, koju karakterizira očuvanje jezgre u svim fazama sazrijevanja eritrocita i sinteza hemoglobina fetalnog tipa. Prema najnovijim podacima, val primarne eritropoeze završava u žumanjčanoj vrećici 8. dana embrionalnog razvoja. Slijedi razdoblje nakupljanja definitivnih eritroidnih progenitorskih stanica - BFU-E, koje se formiraju isključivo u žumanjčanoj vrećici i prvi put se pojavljuju 9. dana gestacije. U sljedećoj fazi embriogeneze već su formirane definitivne eritroidne progenitorske stanice - CFU-E, kao i (!) mastociti i CFU-GM. To je osnova za stajalište da definitivne progenitorske stanice nastaju u žumanjčanoj vrećici, migriraju krvotokom, naseljavaju se u jetri i brzo pokreću prvu fazu intraembrionalne hematopoeze. Prema tim konceptima, žumanjčana vrećica može se smatrati, s jedne strane, mjestom primarne eritropoeze, a s druge strane, prvim izvorom konačnih hematopoetskih progenitorskih stanica u embrionalnom razvoju.

Pokazalo se da se stanice koje stvaraju kolonije s visokim proliferativnim potencijalom mogu izolirati iz žumanjčane vrećice već 8. dana gestacije, tj. mnogo prije zatvaranja vaskularnog sustava embrija i žumanjčane vrećice. Štoviše, stanice s visokim proliferativnim potencijalom dobivene iz žumanjčane vrećice in vitro tvore kolonije čija se veličina i stanični sastav ne razlikuju od odgovarajućih parametara kulturnog rasta matičnih stanica koštane srži. Istovremeno, prilikom ponovne transplantacije stanica koje stvaraju kolonije iz žumanjčane vrećice s visokim proliferativnim potencijalom, formira se znatno više stanica kćeri koje stvaraju kolonije i multipotentnih progenitorskih stanica nego kada se koriste progenitorske stanice hematopoeze koštane srži.

Konačan zaključak o ulozi hematopoetskih matičnih stanica žumanjčane vrećice u definitivnoj hematopoezi mogli bi pružiti rezultati rada u kojem su autori dobili liniju endotelnih stanica žumanjčane vrećice (G166) koja je učinkovito podržavala proliferaciju svojih stanica s fenotipskim i funkcionalnim karakteristikama HSC-a (AA4.1+WGA+, niska gustoća i slaba adhezivna svojstva). Sadržaj potonjih povećao se više od 100 puta kada su uzgajane na hranjivom sloju stanica C166 tijekom 8 dana. Makrofagi, granulociti, megakariociti, blastne stanice i monociti, kao i prekursorske stanice B- i T-limfocita identificirani su u miješanim kolonijama uzgojenim na podsloju stanica C166. Stanice žumanjčane vrećice koje rastu na podsloju endotelnih stanica imale su sposobnost samoreprodukcije i izdržale su do tri pasaže u autorovim eksperimentima. Obnova hematopoeze uz njihovu pomoć kod zrelih miševa s teškom kombiniranom imunodeficijencijom (SCID) bila je popraćena stvaranjem svih vrsta leukocita, kao i T- i B-limfocita. Međutim, autori su u svojim studijama koristili stanice žumanjčane vrećice 10 dana starog embrija, kod kojeg su ekstra- i intraembrionski vaskularni sustavi već zatvoreni, što nam ne dopušta isključiti prisutnost intraembrionskih HSC-a među stanicama žumanjčane vrećice.

Istovremeno, analiza potencijala diferencijacije hematopoetskih stanica ranih stadija razvoja, izoliranih prije ujedinjenja vaskularnih sustava žumanjčane vrećice i embrija (8-8,5 dana gestacije), otkrila je prisutnost prekursora T- i B-stanica u žumanjčanoj vrećici, ali ne i u tijelu embrija. U in vitro sustavu, metodom dvostupanjskog uzgoja na monosloju epitelnih i subepitelnih stanica timusa, mononuklearne stanice žumanjčane vrećice diferencirale su se u pre-T- i zrele T-limfocite. Pod istim uvjetima uzgoja, ali na monosloju stromalnih stanica jetre i koštane srži, mononuklearne stanice žumanjčane vrećice diferencirale su se u pre-B-stanice i zrele IglVT-B-limfocite.

Rezultati ovih studija ukazuju na mogućnost razvoja stanica imunološkog sustava iz ekstraembrionalnog tkiva žumanjčane vrećice, a formiranje primarnih T- i B-staničnih linija ovisi o čimbenicima stromalnog mikrookruženja embrionalnih hematopoetskih organa.

Drugi autori su također pokazali da žumanjčana vrećica sadrži stanice s potencijalom za limfoidnu diferencijaciju, a nastali limfociti se ne razlikuju po antigenim karakteristikama od onih u spolno zrelih životinja. Utvrđeno je da su stanice žumanjčane vrećice embrija starog 8-9 dana sposobne obnoviti limfopoezu u atimocitnom timusu pojavom zrelih CD3+CD4+- i CD3+CD8+-limfocita koji posjeduju formirani repertoar T-staničnih receptora. Dakle, timus može biti naseljen stanicama ekstraembrionalnog podrijetla, ali je nemoguće isključiti vjerojatnu migraciju ranih prekursorskih stanica T-limfocita iz intraembrionalnih izvora limfopoeze u timus.

Istodobno, transplantacija hematopoetskih stanica žumanjčane vrećice odraslim ozračenim primateljima ne rezultira uvijek dugoročnom repopulacijom zona lokalizacije osiromašenog hematopoetskog tkiva, a stanice žumanjčane vrećice in vitro tvore znatno manje slezenskih kolonija od stanica AGM regije. U nekim slučajevima, korištenjem stanica žumanjčane vrećice 9 dana starog embrija, još uvijek je moguće postići dugoročnu (do 6 mjeseci) repopulaciju hematopoetskog tkiva kod ozračenih primatelja. Autori smatraju da se stanice žumanjčane vrećice s fenotipom CD34+c-kit+ ne samo ne razlikuju od onih iz AGM regije po svojoj sposobnosti repopulacije osiromašenih hematopoetskih organa, već i učinkovitije obnavljaju hematopoezu, budući da žumanjčana vrećica sadrži gotovo 37 puta više njih.

Treba napomenuti da su u eksperimentima korištene hematopoetske stanice žumanjčane vrećice s marker antigenima hematopoetskih matičnih stanica (c-kit+ i/ili CD34+ i CD38+), koji su ubrizgani izravno u jetru ili abdominalnu venu potomstva ženki miševa koje su primile injekciju busulfana 18. dana trudnoće. Kod takvih novorođenih životinja, vlastita mijelopoeza bila je oštro potisnuta zbog eliminacije hematopoetskih matičnih stanica uzrokovane busulfanom. Nakon transplantacije hematopoetskih matičnih stanica žumanjčane vrećice, u perifernoj krvi primatelja tijekom 11 mjeseci detektirani su formirani elementi koji sadrže donorski marker - glicerofosfat dehidrogenazu. Utvrđeno je da HSC žumanjčane vrećice obnavljaju sadržaj limfoidnih, mijeloidnih i eritroidnih stanica u krvi, timusu, slezeni i koštanoj srži, a razina himerizma bila je veća u slučaju intrahepatične nego intravenske primjene stanica žumanjčane vrećice. Autori vjeruju da HSC-ovi žumanjčane vrećice embrija u ranoj fazi (do 10 dana) zahtijevaju prethodnu interakciju s hematopoetskim mikrookruženjem jetre kako bi uspješno naselili hematopoetske organe odraslih primatelja. Moguće je da postoji jedinstvena faza razvoja u embriogenezi, kada stanice žumanjčane vrećice, koje u početku migriraju u jetru, zatim stječu sposobnost naseljavanja strome hematopoetskih organa zrelih primatelja.

U tom smislu, treba napomenuti da se himerizam stanica imunološkog sustava prilično često opaža nakon transplantacije stanica koštane srži ozračenim zrelim primateljima - u krvi potonjih, stanice donorskog fenotipa nalaze se u prilično velikim količinama među B-, T-limfocitima i granulocitima primatelja, što traje najmanje 6 mjeseci.

Hematopoetske stanice u sisavaca prvi se put otkrivaju morfološkim metodama 7. dana embrionalnog razvoja i predstavljene su hematopoetskim otocima unutar krvnih žila žumanjčane vrećice. Međutim, prirodna hematopoetska diferencijacija u žumanjčanoj vrećici ograničena je na primarne eritrocite koji zadržavaju jezgre i sintetiziraju fetalni hemoglobin. Ipak, tradicionalno se vjerovalo da žumanjčana vrećica služi kao jedini izvor HSC-a koji migriraju u hematopoetske organe embrija u razvoju i osiguravaju konačnu hematopoezu u odraslih životinja, budući da se pojava HSC-a u tijelu embrija podudara sa zatvaranjem vaskularnih sustava žumanjčane vrećice i embrija. Ovo stajalište podupiru podaci da stanice žumanjčane vrećice, kada se kloniraju in vitro, daju granulocite i makrofage, a in vivo - slezenske kolonije. Zatim je tijekom transplantacijskih eksperimenata utvrđeno da hematopoetske stanice žumanjčane vrećice, koje su u samoj žumanjčanoj vrećici sposobne diferencirati se samo u primarne eritrocite, u mikrookruženju jetre novorođenih i odraslih SCID miševa, osiromašenog timusa ili stromalnog hranitelja, stječu sposobnost repopulacije hematopoetskih organa s obnovom svih hematopoetskih linija čak i kod odraslih životinja primatelja. U načelu, to nam omogućuje da ih klasificiramo kao prave HSC-ove - kao stanice koje funkcioniraju u postnatalnom razdoblju. Pretpostavlja se da žumanjčana vrećica, zajedno s AGM regijom, služi kao izvor HSC-ova za definitivnu hematopoezu kod sisavaca, ali njihov doprinos razvoju hematopoetskog sustava još uvijek nije jasan. Biološko značenje postojanja dvaju hematopoetskih organa sa sličnim funkcijama u ranoj embriogenezi sisavaca također nije jasno.

Potraga za odgovorima na ova pitanja se nastavlja. In vivo je bilo moguće dokazati prisutnost u žumanjčanoj vrećici embrija starih 8-8,5 dana stanica koje obnavljaju limfopoezu kod subletalno ozračenih SCID miševa s izraženim nedostatkom T- i B-limfocita. Hematopoetske stanice žumanjčane vrećice injektirane su i intraperitonealno i izravno u tkivo slezene i jetre. Nakon 16 tjedana, u primatelja su detektirani TCR/CD34 CD4+ i CD8+ T-limfociti te B-220+IgM+ B-limfociti obilježeni donorskim MHC antrxgenima. Istodobno, autori nisu pronašli matične stanice sposobne za takvu obnovu imunološkog sustava u tijelu embrija starih 8-8,5 dana.

Hematopoetske stanice žumanjčane vrećice imaju visok proliferativni potencijal i sposobne su za dugotrajnu samoreprodukciju in vitro. Neki autori identificiraju ove stanice kao HSC-ove na temelju produljenog (gotovo 7 mjeseci) stvaranja eritroidnih progenitorskih stanica, koje se od progenitorskih stanica koštane srži eritroidne loze razlikuju po duljem razdoblju pasažiranja, većim veličinama kolonija, povećanoj osjetljivosti na faktore rasta i duljoj proliferaciji. Osim toga, pod odgovarajućim uvjetima uzgoja stanica žumanjčane vrećice in vitro, formiraju se i limfoidne progenitorske stanice.

Prikazani podaci općenito nam omogućuju da žumanjčanu vrećicu smatramo izvorom HSC-a, manje vezanih i stoga posjedujući veći proliferativni potencijal od matičnih stanica koštane srži. Međutim, unatoč činjenici da žumanjčana vrećica sadrži pluripotentne hematopoetske progenitorske stanice koje in vitro održavaju različite linije hematopoetske diferencijacije dulje vrijeme, jedini kriterij za cjelovitost HSC-a je njihova sposobnost dugoročne repopulacije hematopoetskih organa primatelja, čije su hematopoetske stanice uništene ili genetski defektne. Stoga je ključno pitanje mogu li pluripotentne hematopoetske stanice žumanjčane vrećice migrirati i naseliti hematopoetske organe te je li preporučljivo revidirati poznate radove koji pokazuju njihovu sposobnost repopulacije hematopoetskih organa odraslih životinja s formiranjem glavnih hematopoetskih linija. Intraembrionalni izvori definitivnih GSC-ova identificirani su u ptičjim embrijima još 1970-ih, što je već tada dovelo u sumnju ustaljene ideje o ekstraembrionalnom podrijetlu GSC-ova, uključujući i kod predstavnika drugih klasa kralježnjaka. U posljednjih nekoliko godina pojavile su se publikacije o prisutnosti sličnih intraembrionalnih područja koja sadrže GSC-ove u sisavaca i ljudi.

Treba još jednom napomenuti da je temeljno znanje u ovom području izuzetno važno za praktičnu transplantaciju stanica, jer će pomoći ne samo u određivanju preferiranog izvora HSC-a, već i u utvrđivanju značajki interakcije primarnih hematopoetskih stanica s genetski stranim organizmom. Poznato je da unošenje hematopoetskih matičnih stanica ljudske fetalne jetre u embrion ovce u fazi organogeneze dovodi do rođenja himera životinja, u čijoj krvi i koštanoj srži je stabilno određeno 3 do 5% ljudskih hematopoetskih stanica. Istovremeno, ljudske HSC-e ne mijenjaju svoj kariotip, održavajući visoku stopu proliferacije i sposobnost diferencijacije. Osim toga, transplantirane ksenogene HSC-e ne sukobljavaju se s imunološkim sustavom i fagocitima organizma domaćina i ne transformiraju se u tumorske stanice, što je bila osnova za intenzivan razvoj metoda intrauterine korekcije nasljedne genetske patologije korištenjem HSC-a ili ESC-a transficiranih nedostatnim genima.

Ali u kojoj je fazi embriogeneze prikladnije provesti takvu korekciju? Po prvi put, stanice određene za hematopoezu pojavljuju se kod sisavaca odmah nakon implantacije (6. dan gestacije), kada još uvijek nema morfoloških znakova hematopoetske diferencijacije i pretpostavljenih hematopoetskih organa. U ovoj fazi, raspršene stanice mišjeg embrija sposobne su ponovno naseliti hematopoetske organe ozračenih primatelja stvaranjem eritrocita i limfocita koji se od stanica domaćina razlikuju po vrsti hemoglobina, odnosno glicerofosfat izomeraze, kao i dodatnog kromosomskog markera (Tb) donorskih stanica. Kod sisavaca, kao i kod ptica, istovremeno sa žumanjčanom vrećicom, prije zatvaranja zajedničkog vaskularnog korita, hematopoetske stanice pojavljuju se izravno u tijelu embrija u paraaortalnoj splanhnopleuri. Hematopoetske stanice AA4.1+ fenotipa izolirane su iz AGM regije i karakterizirane kao multipotentne hematopoetske stanice koje tvore T- i B-limfocite, granulocite, megakariocite i makrofage. Fenotipski, ove multipotentne progenitorske stanice vrlo su bliske HSC-ima koštane srži odraslih životinja (CD34+c-kit+). Broj multipotentnih AA4.1+ stanica među svim stanicama AGM regije je malen - čine ne više od 1/12 njezina dijela.

U ljudskom embriju identificirana je i intraembrionalna regija koja sadrži HSC homologne AGM regiji životinja. Štoviše, kod ljudi se više od 80% multipotentnih stanica s visokim proliferativnim potencijalom nalazi u tijelu embrija, iako su takve stanice prisutne i u žumanjčanoj vrećici. Detaljna analiza njihove lokalizacije pokazala je da su stotine takvih stanica skupljene u kompaktnim skupinama koje se nalaze u neposrednoj blizini endotela ventralne stijenke dorzalne aorte. Fenotipski su to CD34CD45+Lin stanice. Naprotiv, u žumanjčanoj vrećici, kao i u drugim hematopoetskim organima embrija (jetra, koštana srž), takve su stanice pojedinačne.

Posljedično, u ljudskom embriju AGM regija sadrži nakupine hematopoetskih stanica usko povezanih s ventralnim endotelom dorzalne aorte. Taj se kontakt prati i na imunokemijskoj razini - i stanice hematopoetskih nakupina i endotelne stanice eksprimiraju faktor rasta vaskularnog endotela, Flt-3 ligand, njihove receptore FLK-1 i STK-1, kao i transkripcijski faktor matičnih stanica leukemije. U AGM regiji, mezenhimski derivati predstavljeni su gustim nizom zaobljenih stanica smještenih duž cijele dorzalne aorte i eksprimirajući tenascin C - glikoprotein osnovne tvari aktivno uključen u procese međustanične interakcije i migracije.

Multipotentne matične stanice AGM regije nakon transplantacije brzo obnavljaju hematopoezu u zrelih ozračenih miševa i osiguravaju učinkovitu hematopoezu dulje vrijeme (do 8 mjeseci). Autori nisu pronašli stanice s takvim svojstvima u žumanjčanoj vrećici. Rezultate ove studije potvrđuju podaci drugog rada, koji je pokazao da je u embrijima ranih faza razvoja (10,5 dana) AGM regija jedini izvor stanica koje odgovaraju definiciji HSC-a, obnavljajući mijeloidnu i limfoidnu hematopoezu u zrelih ozračenih primatelja.

Stromalna linija AGM-S3 izolirana je iz AGM regije, čije stanice podržavaju stvaranje predanih progenitorskih stanica CFU-GM, BFU-E, CFU-E i jedinica koje formiraju kolonije miješanog tipa u kulturi. Sadržaj potonjih tijekom uzgoja na hranjivom podsloju stanica linije AGM-S3 povećava se od 10 do 80 puta. Dakle, mikrookruženje AGM regije sadrži bazne stromalne stanice koje učinkovito podržavaju hematopoezu, tako da sama AGM regija može djelovati kao embrionalni hematopoetski organ - izvor definitivnih HSC-a, odnosno HSC-a koji tvore hematopoetsko tkivo odrasle životinje.

Proširena imunofenotipizacija staničnog sastava AGM regije pokazala je da ona sadrži ne samo multipotentne hematopoetske stanice, već i stanice posvećene mijeloidnoj i limfoidnoj (T- i B-limfociti) diferencijaciji. Međutim, molekularna analiza pojedinačnih CD34+c-kit+ stanica iz AGM regije korištenjem lančane reakcije polimeraze otkrila je aktivaciju samo gena beta-globina i mijeloperoksidaze, ali ne i limfoidnih gena koji kodiraju sintezu CD34, Thy-1 i 15. Djelomična aktivacija gena specifičnih za liniju karakteristična je za rane ontogenetske faze stvaranja HSC-a i progenitorskih stanica. S obzirom na to da je broj posvećenih progenitorskih stanica u AGM regiji 10-dnevnog embrija 2-3 reda veličine manji nego u jetri, može se tvrditi da 10. dana embriogeneze hematopoeza u AGM regiji tek počinje, dok su se u glavnom hematopoetskom organu fetusa tijekom tog razdoblja hematopoetske linije već razvile.

Doista, za razliku od ranijih (9-11 dana) hematopoetskih matičnih stanica žumanjčane vrećice i AGM regije, koje ponovno naseljavaju hematopoetsko mikrookruženje novorođenčeta, ali ne i odraslog organizma, hematopoetske progenitorske stanice 12-17-dnevne embrionalne jetre više ne zahtijevaju rano postnatalno mikrookruženje i naseljavaju hematopoetske organe odrasle životinje ništa lošije od novorođenčeta. Nakon transplantacije embrionalnih HSC-a jetre, hematopoeza u ozračenim odraslim miševima primateljima imala je poliklonski karakter. Osim toga, korištenjem označenih kolonija pokazano je da je funkcioniranje usađenih klonova u potpunosti podložno klonskoj sukcesiji otkrivenoj u odrasloj koštanoj srži. Posljedično, embrionalne HSC-e jetre, označene pod najnježnijim uvjetima, bez prethodne stimulacije egzogenim citokinima, već posjeduju glavne atribute odraslih HSC-a: ne zahtijevaju rano postembrionalno mikrookruženje, ulaze u stanje duboke dormancije nakon transplantacije i sekvencijalno se mobiliziraju u klonsku formaciju u skladu s modelom klonske sukcesije.

Očito je potrebno detaljnije se osvrnuti na fenomen klonske sukcesije. Eritropoezu provode hematopoetske matične stanice koje imaju visoki proliferativni potencijal i sposobnost diferencijacije u sve linije predanih prekursorskih stanica krvnih stanica. Pri normalnom intenzitetu hematopoeze, većina hematopoetskih matičnih stanica nalazi se u stanju mirovanja i mobilizirane su za proliferaciju i diferencijaciju, sekvencijalno formirajući klonove koji se međusobno zamjenjuju. Taj se proces naziva klonska sukcesija. Eksperimentalni dokazi o klonskoj sukcesiji u hematopoetskom sustavu dobiveni su u studijama s HSC-ima obilježenim retrovirusnim prijenosom gena. Kod odraslih životinja hematopoezu održavaju mnogi istovremeno funkcionirajući hematopoetski klonovi, derivati HSC-a. Na temelju fenomena klonske sukcesije razvijen je repopulacijski pristup identifikaciji HSC-a. Prema ovom načelu, razlikuje se dugotrajna hematopoetska matična stanica (LT-HSC), koja je sposobna obnavljati hematopoetski sustav tijekom cijelog života, i kratkotrajna HSC, koja tu funkciju obavlja ograničeno vrijeme.

Ako hematopoetske matične stanice promatramo s gledišta repopulacijskog pristupa, onda je osobitost hematopoetskih stanica embrionalne jetre njihova sposobnost stvaranja kolonija koje su znatno veće od onih u rastu HSC-a iz pupkovine ili koštane srži, i to se odnosi na sve vrste kolonija. Sama ta činjenica ukazuje na veći proliferativni potencijal hematopoetskih stanica embrionalne jetre. Jedinstveno svojstvo hematopoetskih progenitorskih stanica embrionalne jetre je kraći stanični ciklus u usporedbi s drugim izvorima, što je od velike važnosti s gledišta učinkovitosti repopulacije hematopoetskih organa tijekom transplantacije. Analiza staničnog sastava hematopoetske suspenzije dobivene iz izvora zrelog organizma ukazuje na to da su u svim fazama ontogeneze nuklearne stanice pretežno predstavljene konačno diferenciranim stanicama, čiji broj i fenotip ovise o ontogenetskoj dobi darivatelja hematopoetskog tkiva. Posebno, suspenzije mononuklearnih stanica koštane srži i krvi iz pupkovine sastoje se od više od 50% zrelih stanica limfoidne serije, dok hematopoetsko tkivo embrionalne jetre sadrži manje od 10% limfocita. Osim toga, stanice mijeloidne loze u embrionalnoj i fetalnoj jetri predstavljene su uglavnom eritroidnom serijom, dok u krvi iz pupkovine i koštanoj srži prevladavaju granulocitno-makrofagni elementi.

Također je važno da embrionalna jetra sadrži kompletan set najranijih hematopoetskih prekursora. Među potonjima treba istaknuti eritroidne, granulopoetske, megakariopoetske i multilinijske stanice koje formiraju kolonije. Njihovi primitivniji prekursori - LTC-IC - sposobni su za proliferaciju i diferencijaciju in vitro tijekom 5 tjedana ili više, a također zadržavaju funkcionalnu aktivnost nakon usađivanja u tijelo primatelja tijekom alogene, pa čak i ksenogene transplantacije imunodeficijentnim životinjama.

Biološka svrsishodnost prevlasti eritroidnih stanica u embrionalnoj jetri (do 90% ukupnog broja hematopoetskih elemenata) posljedica je potrebe da se brzo rastući volumen krvi fetusa u razvoju opskrbi eritrocitnom masom. U embrionalnoj jetri eritropoezu predstavljaju nuklearni eritroidni prekursori različitog stupnja zrelosti koji sadrže fetalni hemoglobin (a2u7), koji zbog svog većeg afiniteta za kisik osigurava učinkovitu apsorpciju potonjeg iz majčine krvi. Intenziviranje eritropoeze u embrionalnoj jetri povezano je s lokalnim povećanjem sinteze eritropoetina (EPO). Važno je napomenuti da je sama prisutnost eritropoetina dovoljna za ostvarenje hematopoetskog potencijala hematopoetskih stanica u embrionalnoj jetri, dok je za eritropoezu HSC-a koštane srži i pupkovine potrebna kombinacija citokina i faktora rasta koji se sastoje od EPO, SCF, GM-CSF i IL-3. Istodobno, rane hematopoetske progenitorske stanice izolirane iz embrionalne jetre, koje nemaju receptore za EPO, ne reagiraju na egzogeni eritropoetin. Za indukciju eritropoeze u suspenziji mononuklearnih stanica embrionalne jetre potrebna je prisutnost naprednijih stanica osjetljivih na eritropoetin s fenotipom CD34+CD38+, koje eksprimiraju EPO receptor.

U literaturi još uvijek ne postoji konsenzus o razvoju hematopoeze u embrionalnom razdoblju. Funkcionalni značaj postojanja ekstra- i intraembrionalnih izvora hematopoetskih progenitorskih stanica nije utvrđen. Međutim, nema sumnje da je u ljudskoj embriogenezi jetra središnji organ hematopoeze i u 6. do 12. tjednu trudnoće služi kao glavni izvor hematopoetskih matičnih stanica koje naseljavaju slezenu, timus i koštanu srž. GDR-ovi osiguravaju obavljanje odgovarajućih funkcija u pre- i postnatalnom razdoblju razvoja.

Treba još jednom napomenuti da embrionalna jetra, u usporedbi s drugim izvorima, karakterizira najveći sadržaj HSC-a. Otprilike 30% CD344 stanica embrionalne jetre ima fenotip CD38. Istodobno, broj limfoidnih progenitorskih stanica (CD45+) u ranim fazama hematopoeze u jetri nije veći od 4%. Utvrđeno je da se, kako se fetus razvija, od 7. do 17. tjedna trudnoće, broj B-limfocita progresivno povećava s mjesečnim "korakom" od 1,1%, dok se razina HSC-a trajno smanjuje.

Funkcionalna aktivnost hematopoetskih matičnih stanica također ovisi o razdoblju embrionalnog razvoja njihovog izvora. Proučavanje aktivnosti stvaranja kolonija stanica jetre ljudskih embrija u 6-8 i 9-12 tjedana trudnoće tijekom uzgoja u polutekućem mediju u prisutnosti SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 i EPO pokazalo je da je ukupan broj kolonija 1,5 puta veći kada se HSC-i embrionalne jetre siju u ranim fazama razvoja. Istodobno, broj mijelopoetskih progenitorskih stanica poput CFU-GEMM u jetri u 6-8 tjedana embriogeneze više je od tri puta veći od njihovog broja u 9-12 tjedana trudnoće. Općenito, aktivnost stvaranja kolonija hematopoetskih stanica jetre embrija u prvom tromjesečju trudnoće bila je značajno veća od aktivnosti fetalnih stanica jetre u drugom tromjesečju trudnoće.

Gore navedeni podaci ukazuju na to da se embrionalna jetra na početku embriogeneze odlikuje ne samo povećanim sadržajem ranih hematopoetskih progenitorskih stanica, već se njezine hematopoetske stanice odlikuju širim spektrom diferencijacije u različite stanične linije. Ove značajke funkcionalne aktivnosti hematopoetskih matičnih stanica embrionalne jetre mogu imati određeni klinički značaj, budući da nam njihove kvalitativne karakteristike omogućuju očekivati izražen terapijski učinak pri transplantaciji čak i malog broja stanica dobivenih u ranim fazama gestacije.

Ipak, problem količine hematopoetskih matičnih stanica potrebnih za učinkovitu transplantaciju ostaje otvoren i relevantan. Pokušava se riješiti korištenjem visokog potencijala samoreprodukcije hematopoetskih stanica embrionalne jetre in vitro kada su stimulirane citokinima i faktorima rasta. Konstantnom perfuzijom ranih embrionalnih HSC-ova jetre u bioreaktoru, nakon 2-3 dana, moguće je dobiti količinu hematopoetskih matičnih stanica u učinku koji je 15 puta veći od njihove početne razine. Za usporedbu, treba napomenuti da su potrebna najmanje dva tjedna za postizanje 20-strukog povećanja učinka ljudskih HSC-ova iz pupkovine pod istim uvjetima.

Dakle, embrionalna jetra razlikuje se od drugih izvora hematopoetskih matičnih stanica po većem sadržaju i predanih i ranih hematopoetskih progenitorskih stanica. U kulturi s faktorima rasta, embrionalne stanice jetre s fenotipom CD34+CD45Ra1 CD71l0W tvore 30 puta više kolonija od sličnih stanica iz pupkovine i 90 puta više od HSC-a koštane srži. Najizraženije razlike u navedenim izvorima su u sadržaju ranih hematopoetskih progenitorskih stanica koje tvore miješane kolonije - količina CFU-GEMM u embrionalnoj jetri premašuje onu u krvi iz pupkovine i koštanoj srži za 60 odnosno 250 puta.

Također je važno da je do 18. tjedna embrionalnog razvoja (razdoblje početka hematopoeze u koštanoj srži) više od 60% stanica jetre uključeno u provedbu hematopoetske funkcije. Budući da ljudski fetus nema timus i, prema tome, timocite do 13. tjedna razvoja, transplantacija hematopoetskih stanica iz embrionalne jetre od 6-12 tjedana gestacije značajno smanjuje rizik od razvoja reakcije „graft versus host“ i ne zahtijeva odabir histokompatibilnog donora, budući da omogućuje relativno lako postizanje hematopoetskog himerizma.