Uloga kristalnih naslaga u patogenezi osteoartritisa

Kristali bazičnog kalcijevog fosfata (BCP) nalaze se u sinovijalnoj tekućini 30-60% pacijenata s osteoartritisom. Prema A. Swanu i suradnicima (1994.), kristali koji sadrže kalcij nalaze se u sinovijalnoj tekućini mnogo većeg broja pacijenata s osteoartritisom; međutim, zbog izuzetno male veličine kristala ili njihovog malog broja, ne identificiraju se konvencionalnim tehnikama. Prisutnost kristala BCP-a u sinovijalnoj tekućini korelira s radiografskim znakovima degeneracije zglobne hrskavice i povezana je s većim volumenom izljeva u usporedbi s izljevom u zglobovima koljena bez kristala. Studija čimbenika koji utječu na radiografsku progresiju gonartroze pokazala je da je taloženje kristala kalcijevog pirofosfat dihidrata (CPPD) prediktor nepovoljnog kliničkog i radiografskog ishoda. U studiji starijih pacijenata utvrđeno je da je osteoartritis povezan s hondrokalcinozom, posebno u lateralnom tibiofemoralnom odjeljku koljena i prva tri metakarpofalangealna zgloba. Nije neuobičajeno da se obje vrste kristala, OFC i PFC, pronađu kod pacijenata s osteoartritisom.

Klinički, degeneracija zglobne hrskavice uzrokovana taloženjem kalcijevih kristala razlikuje se od one koja se vidi kod primarne osteoartroze. Kad bi kristali bili jednostavan epifenomen degeneracije hrskavice, nalazili bi se u zglobovima koji su najčešće zahvaćeni primarnom osteoartrozom, tj. koljenima, kukovima i malim zglobovima šaka. Nasuprot tome, bolesti taloženja kristala najčešće zahvaćaju zglobove koji nisu tipični za primarnu osteoartrozu, poput ramena, ručnog zgloba i lakta. Prisutnost kristala u zglobnoj (efuzijskoj) tekućini povezana je s težom degeneracijom zglobne hrskavice. Raspravlja se o pitanju što je uzrok, a što posljedica, taloženje kristala ili degeneracija hrskavice. Srednji položaj zauzima sljedeća pretpostavka: primarna anomalija u metabolizmu hrskavice dovodi do njezine degeneracije, a sekundarno taloženje kristala ubrzava njezinu degradaciju (tzv. teorija amplifikacijske petlje).

Točan mehanizam kojim kalcijevi kristali oštećuju zglobnu hrskavicu nije poznat, a sažet je u nastavku. Teoretski, kalcijevi kristali mogu izravno oštetiti hondrocite. Međutim, histološki pregled rijetko otkriva kristale u blizini hondrocita, a još rjeđe ih oni progutaju. Najvjerojatniji mehanizam je fagocitoza kristala stanicama sinovijalne sluznice, nakon čega slijedi oslobađanje proteolitičkih enzima ili lučenje citokina koji stimuliraju oslobađanje enzima iz hondrocita. Ovaj koncept podupire studija uloge sinovitisa induciranog PFKD-om u razvoju brzo progresivnog osteoartritisa kod pirofosfatne artropatije. U ovoj studiji, kristali kalcijevog pirofosfat dihidrata (1 ili 10 mg) ubrizgavani su tjedno u desno koljeno zečeva s osteoartritisom induciranim djelomičnom lateralnom meniscektomijom. Pokazalo se da je nakon 8 injekcija desni koljenski zglob pokazao značajno ozbiljnije promjene u usporedbi s lijevim. Intenzitet sinovijalne upale korelirao je s intraartikularnim injekcijama kristala kalcijevog pirofosfat dihidrata i njihovom dozom. Unatoč činjenici da doze CPPD kristala korištene u ovoj studiji premašuju one in vivo, rezultati ukazuju na ulogu CPPD-inducirane upale u progresiji osteoartritisa kod pirofosfatne artropatije.

Potencijalni mehanizmi indukcije oštećenja zglobne hrskavice kristalima koji sadrže kalcij povezani su s njihovim mitogenim svojstvima, sposobnošću indukcije MMP-a i stimulacije sinteze prostaglandina.

Mitogeni učinak kristala koji sadrže kalcij. Kod artropatija povezanih s kristalima često se opaža proliferacija stanica sinovijalne sluznice, pri čemu su sami kristali samo djelomično odgovorni za taj proces. Povećanje broja sinovijalnih stanica prati povećano lučenje citokina, koji potiču hondrolizu i induciraju lučenje proteolitičkih enzima. OFC kristali u koncentracijama koje se nalaze u patologiji ljudskih zglobova ovisno o dozi stimuliraju mitogenezu kultura fibroblasta kože u mirovanju i sinovijalnih fibroblasta pasa i miševa. Kristali kalcijevog pirofosfat dihidrata, urata, sulfata, karbonata i kalcijevog fosfata stimuliraju rast stanica. Početak i vrhunac ugradnje ( ^3H )-timidina inducirane ovim kristalima pomaknuti su za 3 sata u usporedbi sa stimulacijom stanica krvnim serumom. Ovo vremensko razdoblje može biti potrebno za fagocitozu i otapanje kristala. Dodavanje kontrolnih kristala iste veličine (npr. dijamantna prašina ili čestice lateksa) nije stimuliralo mitogenezu. Kristali natrijevog urat monohidrata imali su slaba mitogena svojstva i bili su značajno inferiorniji od onih kalcijevog urata, što ukazuje na važnost sadržaja kalcija u kristalima u mitogenezi. Sintetski OFC kristali imali su ista mitogena svojstva kao i kristali dobiveni od pacijenata s hondrokalcinozom. Mitogeni učinak kristala koji sadrže kalcij nije bio rezultat povećanja sadržaja kalcija u okolnom hranjivom mediju in vitro, budući da otapanje bazičnih kristala kalcijevog fosfata u hranjivom mediju nije stimuliralo ugradnju ( ^3H )-timidina u fibroblaste.

Jedan predloženi mehanizam za mitogenezu induciranu OFC-om jest da abnormalna proliferacija sinovijalnih stanica može biti, barem djelomično, posljedica endocitoze i unutarstanične otopine kristala, što povećava citoplazmatske koncentracije Ca2 ⁺ i aktivira kalcij-ovisan put koji vodi do mitogeneze. Ovaj koncept podupire potreba za izravnim kontaktom stanica i kristala kako bi se stimulirala mitogeneza, budući da je izlaganje staničnih kultura kristalima induciralo rast stanica, dok izlaganje stanica lišenih takvog kontakta nije. Kako bi se proučila potreba za fagocitozom kristala nakon interakcije stanica i kristala, stanice su uzgajane s ⁴⁵ Ca-OPC i ( ^3H )-timidinom. Utvrđeno je da stanice koje sadrže ⁴⁵ Ca-OPC ugrađuju značajno više ( ^3H )-timidina od stanica bez označavanja bazičnim kalcijevim fosfatom. U kulturama makrofaga, inhibicija endocitoze kristala citokalazinom rezultirala je inhibicijom otopine kristala, što dodatno naglašava potrebu za fagocitozom.

Kristali koji sadrže kalcij topljivi su u kiselini. Nakon fagocitoze, kristali se otapaju u kiseloj sredini makrofagnih fagolizosoma. Klorokin, amonijev klorid, bafilomicin A1 i svi lizosomotropni agensi koji povećavaju pH lizosoma ovisno o dozi inhibiraju unutarstanično otapanje kristala i unos (3H)-timidina ^u fibroblastima kultiviranim s bazičnim kristalima kalcijevog fosfata.

Dodavanje OFC kristala u monoslojnu kulturu fibroblasta uzrokovalo je trenutno deseterostruko povećanje unutarstanične koncentracije kalcija, koja se vratila na početnu vrijednost nakon 8 minuta. Izvor kalcija bio je pretežno izvanstanični ion, budući da su osnovni kristali kalcijevog fosfata dodani u medij za kulturu bez kalcija. Sljedeće povećanje unutarstanične koncentracije kalcija uočeno je nakon 60 minuta i trajalo je najmanje 3 sata. Ovdje je izvor kalcija bio fagocitirani kristali otopljeni u fagolizosomima.

Utvrđeno je da je mitogeni učinak OFC kristala sličan učinku PDGF-a kao faktora rasta; poput potonjeg, OFC kristali pokazuju sinergizam s IGF-1 i krvnom plazmom. Blokada IGF-1 smanjuje staničnu mitogenezu kao odgovor na OFC. PG Mitchell i sur. (1989.) pokazali su da indukcija mitogeneze u Balb/c- ₃ T3 fibroblastima OFC _kristalima zahtijeva prisutnost serin/treonin protein kinaze C (PKC), jednog od glavnih medijatora signala generiranih tijekom vanjske stimulacije stanica hormonima, neurotransmiterima i faktorima rasta. Smanjenje aktivnosti PKC u Balb/c-3 T3 stanicama _inhibiraOFC -om posredovanu indukciju protoonkogena c-fos i c-myc, ali ne utječe na stimulaciju tih onkogena posredovanu PDGF-om.

Povećanje unutarstanične razine kalcija nakon otapanja fagocitiziranih kristala nije jedini signalni put za mitogenezu. Kada se faktori rasta poput PDGF vežu za svoj membranski receptor, stimulira se fosfolipaza C (fosfodiesteraza), koja hidrolizira fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat i tvori unutarstanične glasnike inozitol-3-fosfat i diacilglicerol. Prvi oslobađa kalcij iz endoplazmatskog retikuluma modulirajući aktivnost enzima ovisnih o kalciju i ovisnih o kalciju/kalmodulinu, poput protein kinaza i proteaza.

R. Rothenberg i H. Cheung (1988.) izvijestili su o povećanoj razgradnji fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfata fosfolipazom C u sinovijalnim stanicama zeca kao odgovor na stimulaciju kristalima OFC-a. Potonji su značajno povećali sadržaj inozitol-1-fosfata u stanicama s obilježenim ( ^3H )-inozitolom; vrh je dosegnut unutar 1 minute i trajao je oko 1 sat.

Diacilglicerol je potencijalni aktivator kalcijevog pirofosfat dihidrata. Budući da OFC kristali povećavaju aktivnost fosfolipaze C, što dovodi do akumulacije diacilglicerola, posljedično se može očekivati povećanje aktivacije PKC. PG Mitchell i sur. (1989.) usporedili su učinke OFC kristala i PDGF-a na sintezu DNA u _{fibroblastima Balb/c-3T3}. U staničnoj kulturi, PKC je inaktiviran inkubacijom stanica s forbol diesterom (TPD) koji podržava tumor, analogom diacilglicerola. Dugotrajna stimulacija niskim dozama TPD-a smanjila je aktivnost PKC, dok ju je jednokratna stimulacija visokom dozom aktivirala. Stimulacija sinteze DNA OFC kristalima bila je potisnuta nakon inaktivacije PKC, što ukazuje na važnost ovog enzima u mitogenezi induciranoj OFC-om. Prethodno su GM McCarthy i sur. (1987.) pokazali vezu između mitogenog odgovora ljudskih fibroblasta na OFC kristale i aktivacije PKC. Međutim, OFC kristali ne aktiviraju fosfatidilinozitol 3-kinazu ili tirozin kinaze, što potvrđuje da je mehanizam aktivacije stanica OFC kristalima selektivan.

Proliferaciju stanica kontrolira skupina gena koji se nazivaju proto-onkogeni. Proteini foe i mye, produkti proto-onkogena c-fos i c-myc, lokalizirani su u staničnoj jezgri i vezani za specifične DNA sekvence. Stimulacija 3T3 fibroblasta OFC kristalima rezultira ekspresijom c-fos unutar nekoliko minuta, koja doseže maksimum 30 minuta nakon stimulacije. Indukcija transkripcije c-myc OFC kristalima ili PDGF-om događa se unutar 1 sata i doseže maksimum 3 sata nakon stimulacije. Stanice održavaju povišenu razinu transkripcije c-fos i c-myc najmanje 5 sati. U stanicama s inaktiviranim PCD-om, stimulacija c-fos i c-myc OFC ili TFD kristalima je značajno potisnuta, dok se indukcija ovih gena PDGF-om ne mijenja.

Članovi obitelji mitogenom aktiviranih protein kinaza (MAP K) ključni su regulatori različitih unutarstaničnih signalnih kaskada. Jedna podklasa ove obitelji, p42/p44, regulira proliferaciju stanica mehanizmom koji uključuje aktivaciju protoonkogena c-fos i c-jun. Kristali OFC i PFKD aktiviraju signalni put protein kinaze koji uključuje i p42 i p44, što sugerira ulogu ovog puta u mitogenezi induciranoj kristalima koji sadrže kalcij.

Konačno, mitogeneza inducirana OFC-om uključuje transkripcijski faktor nuklearni faktor κB (NF-κB), koji je prvi put opisan kao gen lakog lanca imunoglobulina κ (IgK). To je inducibilni transkripcijski faktor važan u mnogim signalnim putovima jer regulira ekspresiju različitih gena. Indukcija NF-κB obično je povezana s oslobađanjem inhibitornih proteina zvanih IκB iz citoplazme. Indukciju NF-κB slijedi translokacija aktivnog transkripcijskog faktora u jezgru. Kristali OFC-a induciraju NF-κB u fibroblastima Balb/c- _3T3 i fibroblastima ljudske kože.

Nekoliko puteva može biti uključeno u prijenos signala nakon aktivacije NF-κB, ali svi uključuju protein kinaze koje fosforiliraju (i time razgrađuju) IκB. Na temelju in vitro studija, prije se smatralo da IκB služi kao supstrat za kinaze (npr. PKC i protein kinazu A). Međutim, nedavno je identificiran kompleks IκB kinaze velike molekularne težine. Ove kinaze specifično fosforiliraju serinske ostatke IκB. Aktivacija NF-κB pomoću TNF-α i IL-1 zahtijeva učinkovito djelovanje NF-κB-inducirajuće kinaze (NIK) i IκB kinaze. Molekularni mehanizam aktivacije NIK-a trenutno je nepoznat. Iako OFC kristali aktiviraju i PKC i NF-κB, nije poznato u kojoj mjeri ta dva procesa mogu biti povezana. Budući da se modifikacija GκB kinaze događa putem fosforilacije, ne može se isključiti uloga PKC u indukciji NF-κB OFC kristalima putem fosforilacije i aktivacije GκB kinaze. Ovaj koncept podupire inhibicija mitogeneze inducirane kristalima OFC-a i ekspresije NF-κB inhibitorom PKC-a, staurosporinom. Slično tome, staurosporin može inhibirati GκB kinazu, a time i protein kinazu A i druge protein kinaze.

Dakle, mehanizam mitogeneze inducirane OFC kristalima u fibroblastima uključuje najmanje dva različita procesa:

• brzi membranski vezan događaj koji rezultira aktivacijom PKC i MAP K, indukcijom NF-κB i protoonkogena,
• sporije unutarstanično otapanje kristala, što dovodi do povećanja unutarstanične količine Ca2 ⁺, a zatim do aktivacije niza procesa ovisnih o kalciju koji stimuliraju mitogenezu.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Indukcija kristalima koji sadrže MMP-kalcij

Medijatori oštećenja tkiva kristalima koji sadrže kalcij su MMP-ovi - kolagenaza-1, stromelizin, 92 kD želatinaza i kolagenaza-3.

S obzirom na odnos između sadržaja kristala OFC-a i uništavanja zglobnog tkiva, postavljena je hipoteza da sinovijalne stanice fagocitiraju kristale OFC-a, a moguće i neke kolagene. Stimulirani sinovociti proliferiraju i luče proteaze. Ova je hipoteza testirana in vitro dodavanjem prirodnih ili sintetskih OFC-a, PFCD-a i drugih kristala kultiviranim ljudskim ili psećim sinovocitima. Aktivnost neutralnih proteaza i kolagenaza povećavala se ovisno o dozi i bila je približno 5-8 puta veća od one u kontrolnoj staničnoj kulturi uzgojenoj bez kristala.

U stanicama uzgajanim u mediju koji sadrži kristale, detektirana je koindukcija mRNA kolagenaze-1, stromelizina i želatinaze-92 kDa, nakon čega je slijedila sekrecija enzima u medij.

OFC kristali su također inducirali nakupljanje mRNA kolagenaze-1 i kolagenaze-2 u zrelim svinjskim hondrocitima, nakon čega je slijedilo izlučivanje enzima u medij.

GM McCarty i suradnici (1998.) proučavali su ulogu unutarstanične otapanja kristala u kristalima induciranoj proizvodnji MMP-a. Povišenje pH lizosoma bafilomicinom A inhibiralo je unutarstanično otapanje kristala, a također je oslabilo proliferativni odgovor ljudskih fibroblasta na kristale OFC-a, ali nije inhibiralo sintezu i lučenje MMP-a.

Ni bazični kalcijev fosfat ni kristali PFCD-a nisu inducirali proizvodnju IL-1 in vitro, ali kristali natrijevog urata jesu.

Trenutni podaci jasno ukazuju na izravnu stimulaciju proizvodnje MMP-a od strane fibroblasta i hondrocita nakon kontakta s kristalima koji sadrže kalcij.

Simptomi osteoartritisa ukazuju na značajnu ulogu MMP-a u progresiji bolesti. Prisutnost kristala koji sadrže kalcij povećava degeneraciju tkiva zahvaćenih zglobova.

Stimulacija sinteze prostaglandina

Uz stimulaciju rasta stanica i lučenje enzima, kristali koji sadrže kalcij uzrokuju oslobađanje prostaglandina iz staničnih kultura sisavaca, posebno PGE2 _. Oslobađanje PGE2 _{u svim slučajevima događa se unutar prvog sata nakon izlaganja stanica kristalima. R. Rothenberg (1987.) utvrdio je dasu} glavni izvori arahidonske kiseline za sintezu PGE2 fosfatidilkolin i fosfatidiletanolamin, a također je potvrdio da su fosfolipaza A2 _i NOX dominantni putevi za _proizvodnju PGE2.

PGE1 se također može osloboditi kao odgovor na kristale OFA. GM McCarty i suradnici (1993., 1994.) proučavali su učinke PGE2 _, PGE i njegovog analoga misoprostola na mitogeni odgovor ljudskih fibroblasta na kristale OFA. Sva tri agensa inhibirala su mitogeni odgovor na način ovisan o dozi, pri čemu su PGE i misoprostol pokazali izraženiju inhibitornu aktivnost. PGE2 i misoprostol, ali ne i PGE2 _, inhibirali su nakupljanje mRNA kolagenaze kao odgovor na kristale OFA.

MG McCarty i H. Cheung (1994.) istraživali su mehanizam aktivacije stanica posredovane OFC-om pomoću PGE. Autori su pokazali da PGE, snažniji induktor unutarstanične cAMP od PGE2 _i PGE, inhibira OFC-induciranu mitogenezu i proizvodnju MMP-a putem cAMP-ovisnog puta prijenosa signala. Moguće je da povećanje proizvodnje PGE inducirano OFC kristalima slabi njihove druge biološke učinke (mitogenezu i proizvodnju MMP-a) putem mehanizma povratne sprege.

Kristalno izazvana upala

Kristali koji sadrže kalcij često se nalaze u sinovijalnoj tekućini pacijenata s osteoartrozom, međutim, epizode akutne upale s leukocitozom rijetke su i kod osteoartroze i kod artropatija povezanih s kristalima (na primjer, Milwaukeejev sindrom ramena). Flogistički potencijal kristala može biti modificiran nizom inhibitornih čimbenika. R. Terkeltaub i sur. (1988.) pokazali su sposobnost krvnog seruma i plazme da značajno inhibiraju odgovor neutrofilnih granulocita na kristale bazičnog kalcijevog fosfata. Čimbenici koji uzrokuju takvu inhibiciju su proteini koji vežu kristale. Studija jednog od ovih proteina, ₂ -HS glikoproteina (AHSr), pokazala je da je AHSr najpotentniji i specifični inhibitor odgovora neutrofilnih granulocita na kristale OFC-a. AHSr je serumski protein jetrenog podrijetla; Poznato je da se, u usporedbi s drugim serumskim proteinima, nalazi u relativno visokim koncentracijama u kostima i mineralizirajućem tkivu. Osim toga, AHSr je prisutan u "neupaljenoj" sinovijalnoj tekućini, a također je otkriven na kristalima bazičnog kalcijevog fosfata u nativnoj sinovijalnoj tekućini. Stoga se ne može isključiti mogućnost da AHSr modulira flogogeni potencijal bazičnih kristala kalcijevog fosfata in vivo.

Da sumiramo sve gore navedeno, predstavljamo dvije sheme patogeneze osteoartritisa koje su predložili WB van den Berg i sur. (1999) i M. Carrabba et al. (1996), koji kombiniraju mehaničke, genetske i biokemijske čimbenike.