Korinebakterija

Difterija je akutna zarazna bolest koja uglavnom pogađa djecu, a manifestira se kao duboka intoksikacija tijela toksinom difterije i karakteristična fibrinozna upala na mjestu lokalizacije uzročnika. Naziv bolesti dolazi od grčke riječi diftera - koža, film, budući da se na mjestu razmnožavanja uzročnika stvara gusti, sivkastobijeli film.

Uzročnika difterije - Corynebacterium diphtheriae - prvi je put otkrio E. Klebs 1883. u presjecima filma, a u čistoj kulturi ga je 1884. dobio F. Leffler. Godine 1888. E. Roux i A. Yersin otkrili su njegovu sposobnost proizvodnje egzotoksina, koji igra glavnu ulogu u etiologiji i patogenezi difterije. Proizvodnja antitoksičnog seruma od strane E. Behringa 1892. i njegova upotreba od 1894. za liječenje difterije omogućila je značajno smanjenje smrtnosti. Uspješan napad na ovu bolest započeo je nakon 1923. u vezi s razvojem metode za dobivanje anatoksina difterije od strane G. Raiona.

Uzročnik difterije pripada rodu Corynebacterium (klasa Actinobacteria). Morfološki se odlikuje time što su stanice paukovog oblika i zadebljane na krajevima (grčki coryne - paukov), tvore grane, posebno u starim kulturama, te sadrže granularne inkluzije.

Rod Corynebacterium obuhvaća velik broj vrsta, koje su podijeljene u tri skupine.

• Korinebakterije su paraziti ljudi i životinja te su za njih patogene.
• Korinebakterije patogene za biljke.
• Nepatogene korinebakterije. Mnoge vrste korinebakterija su normalni stanovnici kože, sluznica ždrijela, nazofarinksa, očiju, dišnih putova, uretre i genitalija.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Morfologija korinebakterija

C. diphtheriae su ravni ili blago zakrivljeni nepokretni štapići duljine 1,0-8,0 μm i promjera 0,3-0,8 μm; ne tvore spore ni kapsule. Često imaju otekline na jednom ili oba kraja i često sadrže metakromatske granule - volutinska zrna (polimetafosfate), koja bojenjem metilenskim plavilom dobivaju plavkasto-ljubičastu boju. Za njihovo otkrivanje predložena je posebna Neisserova metoda bojenja. U tom slučaju štapići su obojeni slamnatožuto, a volutinska zrna su tamnosmeđa i obično se nalaze na polovima. Corynebacterium diphtheriae se dobro boji anilinskim bojama, gram-pozitivna je, ali u starim kulturama često mijenja boju i ima negativno bojenje prema Gramu. Karakterizira je izražen polimorfizam, posebno u starim kulturama i pod utjecajem antibiotika. Sadržaj G + C u DNA je oko 60 mol %.

Biokemijska svojstva korinebakterija

Bacil difterije je aerob ili fakultativni anaerob, temperaturni optimum za rast je 35-37 °C (granice rasta su 15-40 °C), optimalni pH je 7,6-7,8. Nije jako zahtjevan za hranjive podloge, ali bolje raste na podlogama koje sadrže serum ili krv. Zgrušani serum, Roux ili Loeffler podloge, selektivne su za bakterije difterije, rast na njima se pojavljuje nakon 8-12 sati u obliku konveksnih kolonija veličine glavice pribadače, sivkastobijele ili žućkasto-krem boje. Površina im je glatka ili blago zrnata, na periferiji su kolonije nešto prozirnije nego u središtu. Kolonije se ne spajaju, zbog čega kultura poprima izgled šagrenske kože. Na juhi se rast manifestira kao jednolična zamućenost ili juha ostaje prozirna, a na njezinoj površini se stvara nježni film koji se postupno zgušnjava, mrvi i taloži u pahuljicama na dnu.

Značajka bakterija difterije je njihov dobar rast na krvnim i serumskim medijima koji sadrže takve koncentracije kalijevog telurita da potiskuju rast drugih vrsta bakterija. To je zbog činjenice da C. diphtheriae reducira kalijev telurit u metalni telurij, koji, taložen u mikrobnim stanicama, daje kolonijama karakterističnu tamnosivu ili crnu boju. Korištenje takvih medija povećava postotak zasijavanja bakterija difterije.

Corynebacterium diphtheriae fermentiraju glukozu, maltozu, galaktozu uz stvaranje kiseline bez plina, ali ne fermentiraju (u pravilu) saharozu, imaju cistinazu, nemaju ureazu i ne stvaraju indol. Prema tim karakteristikama razlikuju se od onih korineformnih bakterija (difteroida) koje se najčešće nalaze na sluznici oka (Corynebacterium xerosus) i nazofarinksa (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum) te od ostalih difteroida.

U prirodi postoje tri glavne varijante (biotipa) difterijskog bacila: gravis, intermedins i mitis. Razlikuju se po morfološkim, kulturnim, biokemijskim i drugim svojstvima.

Podjela bakterija difterije na biotipove izvršena je uzimajući u obzir oblike difterije u bolesnika kod kojih se izoliraju s najvećom učestalošću. Tip gravis najčešće se izolira od bolesnika s teškim oblikom difterije i uzrokuje grupne epidemije. Tip mitis uzrokuje blaže i sporadične slučajeve bolesti, a tip intermedius zauzima međupoložaj između njih. Corynebacterium belfanti, prethodno pripisan biotipu mitis, izoliran je kao neovisni, četvrti, biotip. Njegova glavna razlika od biotipova gravis i mitis je sposobnost redukcije nitrata u nitrite. Sojevi Corynebacterium belfanti imaju izražena adhezivna svojstva, a među njima se nalaze i toksigene i netoksigene varijante.

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Antigena struktura korinebakterija

Corynebacterium je vrlo heterogen i mozaičan. U sva tri tipa uzročnika difterije pronađeno je nekoliko desetaka somatskih antigena, prema kojima su podijeljeni u serotipove. U Rusiji je usvojena serološka klasifikacija prema kojoj se razlikuje 11 serotipova bakterija difterije, od kojih je 7 glavnih (1-7) i 4 dodatnih, rijetko susrećućih serotipova (8-11). Šest serotipova (1, 2, 3, 4, 5, 7) pripadaju gravis tipu, a pet (6, 8, 9, 10, 11) pripadaju mitis tipu. Nedostatak metode serotipizacije je taj što mnogi sojevi, posebno netoksigeni, imaju spontanu aglutinaciju ili poliaglutinaciju.

[ 11 ]

Fag tipizacija Corynebacterium diphtheriae

Za diferencijaciju bakterija difterije predložene su različite sheme fagotipizacije. Prema shemi M. D. Krylova, korištenjem skupa od 9 faga (A, B, C, D, F, G, H, I, K), moguće je tipizirati većinu toksigenih i netoksigenih sojeva gravis tipa. Uzimajući u obzir osjetljivost na navedene fage, kao i kulturna, antigenska svojstva i sposobnost sinteze koricina (baktericidnih proteina), M. D. Krylova identificirala je 3 neovisne skupine korinebakterija gravis tipa (I-III). Svaka od njih sadrži podskupine toksigenih i njihove netoksigene analoge uzročnika difterije.

Otpornost na korinebakterije

Corynebacterium diphtheriae pokazuje visoku otpornost na niske temperature, ali brzo umire na visokim temperaturama: na 60 °C - unutar 15-20 minuta, pri kuhanju - nakon 2-3 minute. Sva dezinficijensa (lizol, fenol, kloramin itd.) u uobičajeno korištenoj koncentraciji uništavaju je za 5-10 minuta. Međutim, uzročnik difterije dobro podnosi sušenje i može dugo ostati održiv u osušenoj sluzi, slini i česticama prašine. U finom aerosolu, bakterije difterije ostaju održive 24-48 sati.

Čimbenici patogenosti korinebakterija

Patogenost Corynebacterium diphtheriae određena je prisutnošću niza čimbenika.

Faktori adhezije, kolonizacije i invazije

Strukture odgovorne za adheziju nisu identificirane, ali bez njih bacil difterije ne bi mogao kolonizirati stanice. Njihovu ulogu obavljaju neke komponente stanične stijenke patogena. Invazivna svojstva patogena povezana su s hijaluronidazom, neuraminidazom i proteazom.

Toksični glikolipid sadržan u staničnoj stijenci patogena. To je 6,6'-diester trehaloze koji sadrži korinemikolnu kiselinu (C32H64O3) i korinemikolnu kiselinu (C32H62O3) u ekvimolarnim omjerima (trehaloza-6,6'-dikorinemikolat). Glikolipid ima destruktivan učinak na stanice tkiva na mjestu razmnožavanja patogena.

Egzotoksin, koji određuje patogenost uzročnika i prirodu patogeneze bolesti. Netoksigene varijante C. diphtheriae ne uzrokuju difteriju.

Egzotoksin se sintetizira kao neaktivni prekursor - jedan polipeptidni lanac molekularne težine 61 kD. Aktivira ga sama bakterijska proteaza, koja cijepa polipeptid na dva peptida povezana disulfidnim vezama: A (mw 21 kD) i B (mw 39 kD). Peptid B obavlja akceptorsku funkciju - prepoznaje receptor, veže se na njega i tvori intramembranski kanal kroz koji peptid A prodire u stanicu i provodi biološku aktivnost toksina. Peptid A je enzim ADP-riboziltransferaza koji osigurava prijenos adenozin difosfat riboze iz NAD-a na jedan od aminokiselinskih ostataka (histidin) faktora elongacije proteina EF-2. Kao rezultat modifikacije, EF-2 gubi svoju aktivnost, što dovodi do supresije sinteze proteina ribosomima u fazi translokacije. Toksin sintetiziraju samo oni C. diphtheriae koji u svom kromosomu nose gene umjerenog konvertirajućeg profaga. Operon koji kodira sintezu toksina je monocistronski, sastoji se od 1,9 tisuća nukleotidnih parova i ima toxP promotor i 3 regije: toxS, toxA i toxB. ToxS regija kodira 25 aminokiselinskih ostataka signalnog peptida (osigurava oslobađanje toksina kroz membranu u periplazmatski prostor bakterijske stanice), toxA - 193 aminokiselinska ostatka peptida A, a toxB - 342 aminokiselinska ostatka peptida B toksina. Gubitak profaga od strane stanice ili mutacije u tox operonu čine stanicu blago toksigenom. Naprotiv, lizogenizacija netoksigenih C. diphtheriae konvertirajućim fagom pretvara ih u toksigene bakterije. To je nedvosmisleno dokazano: toksigenost bakterija difterije ovisi o njihovoj lizogenizaciji toks-konvertirajućim korinefagima. Korinefagi se integriraju u kromosom korinebakterija mehanizmom rekombinacije specifične za mjesto, a sojevi bakterija difterije mogu sadržavati 2 rekombinacijska mjesta (attB) u svojim kromosomima, a korinefagi se integriraju u svako od njih istom učestalošću.

Genetska analiza niza netoksičnih sojeva bakterija difterije, provedena pomoću obilježenih DNA sondi koje nose fragmente korinefagnog tox operona, pokazala je da njihovi kromosomi sadrže DNA sekvence homologne korinefagnom tox operonu, ali one ili kodiraju neaktivne polipeptide ili su u "tihom" stanju, tj. neaktivne. U tom smislu postavlja se vrlo važno epidemiološko pitanje: mogu li se netoksične bakterije difterije transformirati u toksične u prirodnim uvjetima (u ljudskom tijelu), slično onome što se događa in vitro? Mogućnost takve transformacije netoksičnih kultura korinebakterija u toksične korištenjem fagne konverzije dokazana je u pokusima na zamorcima, pilećim embrijima i bijelim miševima. Međutim, događa li se to tijekom prirodnog epidemijskog procesa (i ako da, koliko često) još nije utvrđeno.

S obzirom na činjenicu da difterijski toksin u tijelu pacijenata ima selektivan i specifičan učinak na određene sustave (uglavnom su zahvaćeni simpatički-adrenalni sustav, srce, krvne žile i periferni živci), očito je da ne samo da inhibira biosintezu proteina u stanicama, već uzrokuje i druge poremećaje u njihovom metabolizmu.

Sljedeće metode mogu se koristiti za otkrivanje toksičnosti bakterija difterije:

• Biološka ispitivanja na životinjama. Intradermalna infekcija zamoraca filtratom jušne kulture bakterija difterije uzrokuje nekrozu na mjestu injekcije. Jedna minimalna letalna doza toksina (20-30 ng) ubija zamorca težine 250 g kada se injicira potkožno 4.-5. dana. Najkarakterističnija manifestacija djelovanja toksina je oštećenje nadbubrežnih žlijezda, koje su povećane i oštro hiperemične.
• Infekcija pilećih embrija. Toksin difterije uzrokuje njihovu smrt.
• Infekcija staničnih kultura. Toksin difterije uzrokuje izrazit citopatogeni učinak.
• Imunoenzimski test na čvrstoj fazi s antitoksinima obilježenim peroksidazom.
• Upotreba DNA sonde za izravno otkrivanje tox operona u kromosomu bakterija difterije.

Međutim, najjednostavnija i najčešća metoda za određivanje toksičnosti bakterija difterije je serološka - metoda gel precipitacije. Njena je bit sljedeća. Traka sterilnog filter papira dimenzija 1,5 x 8 cm navlaži se antitoksičnim antidifterijskim serumom koji sadrži 500 AE u 1 ml i nanese na površinu hranjive podloge u Petrijevoj zdjelici. Zdjelica se suši u termostatu 15-20 minuta. Testne kulture se zasijuju plakovima s obje strane papira. Na jednu zdjelicu se zasijuje nekoliko sojeva, od kojih jedan, očito toksičan, služi kao kontrola. Ploče s kulturama inkubiraju se na 37 °C, rezultati se uzimaju u obzir nakon 24-48 sati. Zbog suprotne difuzije antitoksina i toksina u gelu, na mjestu njihove interakcije formira se jasna linija precipitacije koja se spaja s linijom precipitacije kontrolnog toksigenog soja. Nespecifične precipitacijske vrpce (nastaju ako su, osim antitoksina, u serumu u malim količinama prisutna i druga antimikrobna antitijela) pojavljuju se kasno, slabo su izražene i nikada se ne spajaju s precipitacijskom vrpcom kontrolnog soja.

Postinfektivni imunitet

Jaki, uporni, praktički doživotni, ponovljeni slučajevi bolesti rijetko se opažaju - kod 5-7% onih koji su preboljeli bolest. Imunitet je uglavnom antitoksične prirode, antimikrobna antitijela su od manje važnosti.

Schickov test se prethodno široko koristio za procjenu razine imuniteta protiv difterije. U tu svrhu djeci je intradermalno ubrizgana 1/40 toksina zamorca u volumenu od 0,2 ml. U nedostatku antitoksičnog imuniteta, na mjestu ubrizgavanja nakon 24-48 sati pojavljuju se crvenilo i oteklina promjera većeg od 1 cm. Takva pozitivna Schickova reakcija ukazuje ili na potpunu odsutnost antitoksina ili da je njegov sadržaj manji od 0,001 AE/ml krvi. Negativna Schickova reakcija opaža se kada je sadržaj antitoksina u krvi veći od 0,03 AE/ml. Ako je sadržaj antitoksina niži od 0,03 AE/ml, ali veći od 0,001 AE/ml, Schickova reakcija može biti pozitivna ili, ponekad, negativna. Osim toga, sam toksin ima izraženo alergeno svojstvo. Stoga je za određivanje razine imuniteta protiv difterije (kvantitativni sadržaj antitoksina) bolje koristiti RPGA s eritrocitnim dijagnostikumom senzibiliziranim difterijskim toksoidom.

Epidemiologija difterije

Jedini izvor zaraze je osoba - bolesna osoba, osoba u oporavku ili zdravi nositelj bakterije. Infekcija se događa putem kapljica u zraku, prašine u zraku te putem raznih predmeta koje koriste bolesni ili zdravi nositelji: posuđe, knjige, posteljina, igračke itd. U slučaju kontaminacije prehrambenih proizvoda (mlijeko, kreme itd.), infekcija je moguća alimentarnim putem. Najmasovnije izlučivanje uzročnika događa se u akutnom obliku bolesti. Međutim, osobe s latentnim, atipičnim oblicima bolesti imaju najveći epidemiološki značaj, budući da često nisu hospitalizirane i ne otkrivaju se odmah. Bolesnik s difterijom je zarazan tijekom cijelog razdoblja bolesti i dijela razdoblja oporavka. Prosječno razdoblje prijenosa bakterija kod osoba u oporavku varira od 2 do 7 tjedana, ali može trajati i do 3 mjeseca.

Zdravi nosioci imaju posebnu ulogu u epidemiologiji difterije. U uvjetima sporadične morbidnosti, oni su glavni distributeri difterije, doprinoseći očuvanju uzročnika u prirodi. Prosječno trajanje nošenja toksigenih sojeva je nešto kraće (oko 2 mjeseca) nego netoksigenih (oko 2-3 mjeseca).

Razlog nastanka zdravog nosioca toksigenih i netoksigenih bakterija difterije nije u potpunosti otkriven, budući da čak ni visoka razina antitoksičnog imuniteta ne osigurava uvijek potpuno oslobađanje tijela od patogena. Možda razina antibakterijskog imuniteta ima određeno značenje. Od primarnog epidemiološkog značaja je nosilac toksigenih sojeva bakterija difterije.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Simptomi difterije

Difteriji su podložne osobe bilo koje dobi. Uzročnik može prodrijeti u ljudsko tijelo kroz sluznice različitih organa ili kroz oštećenu kožu. Ovisno o lokalizaciji procesa, razlikuju se difterija ždrijela, nosa, grkljana, uha, oka, genitalija i kože. Mogući su mješoviti oblici, na primjer, difterija ždrijela i kože itd. Inkubacija je 2-10 dana. U klinički izraženom obliku difterije, na mjestu lokalizacije uzročnika razvija se karakteristična fibrinska upala sluznice. Toksin koji proizvodi uzročnik prvo utječe na epitelne stanice, a zatim na obližnje krvne žile, povećavajući njihovu propusnost. Izlazni eksudat sadrži fibrinogen, čija koagulacija dovodi do stvaranja sivkastobijelog filmskog premaza na površini sluznice, koji je čvrsto srasao s temeljnim tkivom i, kada se otkine, uzrokuje krvarenje. Posljedica oštećenja krvnih žila može biti razvoj lokalnog edema. Difterija ždrijela je posebno opasna jer može uzrokovati difteritični krup zbog edema sluznice grkljana i glasnica, od kojeg je 50-60% djece s difterijom umiralo kao posljedica gušenja. Toksin difterije, ulaskom u krv, uzrokuje opću duboku intoksikaciju. Uglavnom utječe na kardiovaskularni, simpatički-adrenalni sustav i periferne živce. Dakle, simptomi difterije sastoje se od kombinacije lokalnih znakova ovisno o lokalizaciji ulaznih vrata i općih simptoma uzrokovanih trovanjem toksinom, a manifestiraju se u obliku adinamije, letargije, blijede kože, niskog krvnog tlaka, miokarditisa, paralize perifernih živaca i drugih poremećaja. Difterija kod cijepljene djece, ako se i primijeti, obično prolazi u blagom obliku i bez komplikacija. Stopa smrtnosti u razdoblju prije upotrebe seroterapije i antibiotika bila je 50-60%, sada je 3-6%.

Laboratorijska dijagnostika difterije

Jedina metoda mikrobiološke dijagnostike difterije je bakteriološka, uz obvezno testiranje izolirane kulture korinebakterija na toksičnost. Bakteriološke pretrage za difteriju provode se u tri slučaja:

• za dijagnozu difterije kod djece i odraslih s akutnim upalnim procesima u ždrijelu, nosu i nazofarinksu;
• prema epidemiološkim indikacijama osoba koje su bile u kontaktu s izvorom uzročnika difterije;
• osobe novoprimljene u sirotišta, vrtiće, internate i druge posebne ustanove za djecu i odrasle, kako bi se među njima identificirali mogući nositelji bacila difterije.

Materijal za proučavanje je sluz iz ždrijela i nosa, film s tonzila ili drugih sluznica, koje su ulazna točka za patogen. Sjetva se vrši na teluritni serum ili krvne podloge te istovremeno na koagulirani serum Roux (koagulirani konjski serum) ili Loeffler (3 dijela goveđeg seruma + 1 dio šećerne juhe) podloge, na kojima se rast korinebakterija pojavljuje nakon 8-12 sati. Izolirana kultura identificira se kombinacijom morfoloških, kulturnih i biokemijskih svojstava, koristeći metode sero- i fagotipizacije kad god je to moguće. U svim slučajevima, test toksičnosti korištenjem jedne od gore navedenih metoda je obavezan. Morfološke značajke korinebakterija najbolje se proučavaju korištenjem tri metode bojenja razmaza: Gram, Neisser i metilensko plavo (ili toluidinsko plavo).

Liječenje difterije

Specifičan tretman za difteriju je primjena antitoksičnog seruma protiv difterije koji sadrži najmanje 2000 IU na 1 ml. Serum se primjenjuje intramuskularno u dozama od 10 000 do 400 000 IU, ovisno o težini bolesti. Učinkovita metoda liječenja je primjena antibiotika (penicilina, tetraciklina, eritromicina itd.) i sulfonamida. Za poticanje proizvodnje vlastitih antitoksina može se koristiti anatoksin. Za uklanjanje bakterijskog nosioca treba koristiti antibiotike na koje je određeni soj korinebakterija vrlo osjetljiv.

Specifična profilaksa difterije

Glavna metoda suzbijanja difterije je masovno planirano cijepljenje stanovništva. U tu svrhu koriste se različite opcije cjepiva, uključujući kombinirana, tj. usmjerena na istovremeno stvaranje imuniteta protiv nekoliko uzročnika. Najraširenije cjepivo u Rusiji je DPT. To je suspenzija bakterija hripavca adsorbiranih na aluminijev hidroksid, ubijenih formalinom ili timerosalom (20 milijardi u 1 ml), a sadrži toksoid difterije u dozi od 30 flokulirajućih jedinica i 10 jedinica toksoida tetanusa koji se veže u 1 ml. Djeca se cijepe od 3 mjeseca starosti, a zatim se provode revakcinacije: prva nakon 1,5-2 godine, sljedeće u dobi od 9 i 16 godina, a zatim svakih 10 godina.

Zahvaljujući masovnom cijepljenju, koje je u SSSR-u započelo 1959. godine, incidencija difterije u zemlji do 1966. godine, u usporedbi s 1958. godinom, smanjena je 45 puta, a njezin pokazatelj u 1969. godini iznosio je 0,7 na 100 000 stanovnika. Naknadno smanjenje obujma cijepljenja u 1980-ima dovelo je do ozbiljnih posljedica. U razdoblju 1993.-1996. Rusiju je zahvatila epidemija difterije. Oboljeli su odrasli, uglavnom oni koji nisu bili cijepljeni, i djeca. Godine 1994. registrirano je gotovo 40 tisuća pacijenata. U vezi s tim nastavljeno je masovno cijepljenje. Tijekom tog razdoblja cijepljeno je 132 milijuna ljudi, uključujući 92 milijuna odraslih. U razdoblju 2000.-2001. obuhvat djece cijepljenjem u utvrđenom roku bio je 96%, a revakcinacijom - 94%. Zbog toga se incidencija difterije 2001. godine smanjila za 15 puta u usporedbi s 1996. godinom. Međutim, kako bi se incidencija svela na izolirane slučajeve, potrebno je cijepiti najmanje 97-98% djece u prvoj godini života i osigurati masovno revakciniranje u sljedećim godinama. Malo je vjerojatno da će se difterija u potpunosti iskorijeniti u nadolazećim godinama zbog široko rasprostranjenog prijenosa toksigenih i netoksigenih bakterija difterije. Također će trebati neko vrijeme da se ovaj problem riješi.