Embrionalne matične stanice

Otkriće embrionalnih matičnih stanica nije nastalo slučajno, već se pojavilo na pripremljenom tlu znanstvenih istraživanja u području razvojne biologije. Pojam „matična stanica“ u medicinu je uveo 1908. godine na kongresu hematološkog društva u Berlinu Aleksandar Maksimov u odnosu na hematopoetske stanice. Mnogo prije izolacije i proizvodnje stabilnih linija pluripotentnih embrionalnih matičnih stanica, matične terato-(embrio-karcinomske) stanice korištene su u istraživanjima ranih razvojnih procesa, uz pomoć kojih su proučavani nepoznati mehanizmi embriogeneze, uključujući slijed ekspresije ranih gena i proteinskih produkata njihove aktivnosti.

Ali je li totipotentnost ljudskog genoma nepovratno izgubljena u procesu evolucije? Ne, a embriogeneza je dokaz za to. Ako je to tako, kada će se onda, u principu, ostvariti drugi put evolucijskog razvoja? Vjerojatno, kada čovjek uđe u svemir, gdje će uvjeti okoline biti relativno konstantni dovoljno dugo. Gubitak koštanog tkiva (demineralizacija kostiju u bestežinskom stanju), koje je vrlo sporo podložno preoblikovanju i regeneraciji, može se smatrati prvim korakom u procesu prilagodbe čovjeka, kao vrste, postojanju u svemirskim uvjetima. Međutim, cijena za drugi put evolucijskog razvoja bit će drugačija - cijena za povratak totipotentnosti i apsolutne plastičnosti svim stanicama bit će sterilnost. Dakle, u ovom svijetu „evolucijskih kameleona“ morat ćemo se razmnožavati bez mejoze, pupanjem. Ali živjet ćemo dugo. Besmrtnost telomeraze je besmrtnost amebe. U višećelijskom organizmu matične stanice supstrat supstrata kvantitativne i kvalitativne dugovječnosti.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Izvori embrionalnih matičnih stanica

Danas su izvori embrionalnih matičnih stanica za laboratorijska istraživanja linije mišjeg teratokarcinoma (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) i ljudskog teratokarcinoma (NTERA-2, TERA-2, H-9 klon), kao i Trauneon ESC linije. Međutim, dostupnost detaljne stanične putovnice koja ukazuje na imunološki fenotip, rezultate kromosomske analize, profile ekspresije mRNA, izložene receptore i unutarstanične signalne proteine ne kompenzira značajne nedostatke ESC linija teratokarcinoma - brzi gubitak totipotentnosti i nemogućnost njihove upotrebe u kliničkim ispitivanjima, dok miješana diferencijacija u kulturi uvelike otežava izolaciju čiste specijalizirane linije iz heterogene stanične populacije. Stoga je izvor ESC linija stvorenih u kliničke svrhe obično unutarnja stanična masa blastociste, pojedinačni blastomeri embrija u stadiju 8 stanica, stanice morule kasnijih stadija, kao i primordijalne zametne stanice.

Treba napomenuti da stanice teratokarcinoma, iako imaju svojstvo pluripotentnosti, karakterizira znatno niži pluripotentni potencijal u usporedbi s ESC-ima. Njihova integracija s embrionalnim stanicama rijetko dovodi do stvaranja himera, koje, štoviše, nikada ne stvaraju gamete s genotipom stanica teratokarcinoma. Smatra se da je to zbog česte pojave kromosomskih abnormalnosti tijekom uzgoja stanica teratokarcinoma: gubitak Y kromosoma, razne trisomije, delecije ili translokacije.

Pokušaji izolacije linije ljudskih ESC-a poduzimani su više puta, ali taj zadatak nije riješen, budući da su normalne ljudske blastociste teško dostupne. Osim toga, učestalost kromosomskih abnormalnosti kod ljudi je veća nego u embriogenezi kod životinja. Velika većina ranih ljudskih embrija dobivenih nakon in vitro oplodnje pokazuje kaotičan kromosomski mozaicizam i često imaju numeričke i strukturne aberacije. Čak i kasnije, u fazi blastociste, samo 20-25% ljudskih embrija sastoji se od stanica s normalnim kariotipom. Bilo je praktički nemoguće koristiti takve embrije za stvaranje ESC-a, budući da su se zigote obično uzgajale do stadija s dva ili četiri blastomera, a zatim transplantirale u maternicu. Tek relativno nedavno razvijena je pouzdana tehnika za uzgoj oplođenih ljudskih jajnih stanica do stadija blastociste. Uvođenje ove tehnike u praksu in vitro oplodnje ne samo da je povećalo učestalost uspješnih ishoda implantacije, već je i učinilo normalne blastociste pristupačnijim objektom.

Drugi izvor pluripotentnih matičnih stanica su primordijalne zametne stanice, koje, za razliku od naprednijih progenitornih populacija germinativnog epitela, nemaju beta-integrin na svojoj površini, ali izražavaju visoku aktivnost alkalne fosfataze. Treba napomenuti da se populacije matičnih stanica koje su nastale iz primordijalnih zametnih stanica eksperimentalno proučavaju od 1980-ih. U to vrijeme razvijena je tehnika za izolaciju primordijalnih zametnih stanica iz rudimenta gonada mišjeg embrija. Prvi neuspješni rezultati uzgoja primordijalnih zametnih stanica in vitro sugerirali su uzaludnost tih pokušaja, budući da su stanice, iako su preživjele, nisu proliferirale i uginule su unutar prvog dana. Kasnije je utvrđeno da se mišje primordijalne zametne stanice reproduciraju in vitro samo u prisutnosti topljivih i membranski vezanih specifičnih polipeptidnih faktora rasta u mediju za kulturu. Rezultati brojnih studija pokazali su da je za preživljavanje i proliferaciju primarnih zametnih stanica potrebna prisutnost ne samo LIF-a već i membranski vezanih i topljivih Steel faktora (SIF) u mediju za kulturu. Ove peptide proizvode somatske stanice embrija homozigotnih za Steel mutaciju, a jedan od njih je ligand cKit protoonkogena.

Primarne zametne stanice sisavaca i ljudi imaju ekstragonadalno podrijetlo i izvor su klonskog razvoja linije zametnih stanica. Podrijetlo primordijalne linije zametnih stanica, kao i svih embrionalnih tkiva i ekstraembrionalnog mezoderma, je epiblast (primarni ektoderm) ranih embrija, koji ima mozaičnu strukturnu organizaciju. Korištenjem metode mikrokirurškog uklanjanja različitih dijelova ranog embrija utvrđena je lokalizacijska zona u epiblastu klona predanih prekursora primordijalnih zametnih stanica. Korištenjem rodamin dekstrana, koji je korišten kao stanični marker, utvrđeno je da su prekursori primordijalnih zametnih stanica lokalizirani u proksimalnom području epiblasta, blizu ekstraembrionalnog ektoderma. Primordijalna linija zametnih stanica nastaje iz klona od 45 stanica, čija se alokacija događa na samom početku gastrulacije. Zatim se klon odvaja, a tijekom gastrulacije primarne zametne stanice ulaze u ekstraembrionalni mezoderm i nalaze se u podnožju rudimenta alantoisa, iza primarne pruge. Odatle primarne zametne stanice migriraju prema ventralnom dijelu endoderma stražnjeg crijeva, a zatim se aktivno kreću duž mezenterija, naseljavajući genitalne grebene na kraju migracije. Tijekom migracije, kao i u prva 2-3 dana lokalizacije u rudimentu gonada, primarne zametne stanice aktivno proliferiraju i prolaze kroz osam replikacijskih ciklusa. Ako na početku migracije postoji oko 50 primarnih zametnih stanica, tada u genitalnim grebenima mišjih embrija od dvanaest dana razvoja broj primarnih zametnih stanica prelazi 25 000.

Funkcionalna sličnost ESC-a i primordijalnih zametnih stanica dokazuje se potpunom integracijom potonjih u blastocistu uz zamjenu unutarnje stanične mase i naknadni potpuni razvoj embrija, čija se tkiva sastoje samo od potomaka primordijalnih zametnih stanica. U drugim svojstvima, mišje primordijalne zametne stanice također su se pokazale identičnima ESC-ima, pokazujući sposobnost diferencijacije u različitim smjerovima, stvaranja embrioidnih tijela in vitro i stvaranja teratoma in vivo kada se primjenjuju potkožno imunodeficijentnim miševima, nalikujući spontanim testikularnim teratomima kod 129/ter miševa.

Utvrđeno je da kada se u medij dodaju LIF, membranski vezan i topljivi SIF, izolirane primarne zametne stanice mišjih embrija starih 8 dana preživljavaju i razmnožavaju se u kulturi 4 dana, ali zatim umiru. Štoviše, razdoblje kada se u kulturi opaža smrt primarnih zametnih stanica podudara se sa stadijem razvoja mišjih embrija (12,5-13,5 dana) kada ženske primarne zametne stanice ulaze u mejozu u rudimentima gonada, a mitotičke diobe su blokirane u muškim primarnim zametnim stanicama. Međutim, ako se u medij dodaju ne samo faktori rasta LIF i SIF, već i FGF2, primarne zametne stanice nastavljaju proliferirati, a u subkulturama se formiraju kolonije stanica sposobnih za razmnožavanje čak i nakon uklanjanja faktora rasta (SIF i FGF) iz medija. Takve se stanice mogu dugo uzgajati na supstratu embrionalnih fibroblasta bez dodavanja topljivog faktora rasta LIF. Predloženo je da se ove stabilne stanične linije dobivene iz primordijalnih zametnih stanica nazovu embrionalnim zametnim stanicama. Ovaj termin uopće nije uspješan, budući da je nemoguće dobiti embrionalne zametne stanice sposobne za izvođenje sljedećih faza oogeneze ili spermatogeneze prilikom uzgoja EG stanica. To je zbog činjenice da EG stanične linije, iako potječu od primordijalnih zametnih stanica, ali, stječući svojstva embrionalnih pluripotentnih matičnih stanica u kulturi, gube sposobnost vezanja za zametne loze. Drugim riječima, primordijalne zametne stanice, kada se uzgajaju, gube svojstva prekursora gameta i transformiraju se u pluripotentne stanice slične ESC-u.

Primijećeno je da teratomi ne nastaju kada se EG stanice unesu u imunodeficijentne miševe. Pretpostavlja se da je gubitak sposobnosti ljudskih EG stanica da uzrokuju teratome posljedica činjenice da te linije nisu stvorene izravno iz kultiviranih primarnih zametnih stanica, već su dobivene iz stanica izoliranih iz embrioidnih tijela. Stoga je moguće da su potomci pluripotentnih, ali već determiniranih stanica.

Treba napomenuti da postoje temeljne razlike između EG stanica i primordijalnih zametnih stanica. Potonje ne omogućuju dobivanje himernih mišjih embrija, što ukazuje na nedostatak sposobnosti primordijalnih zametnih stanica da se integriraju u unutarnju staničnu masu ili trofektoderm. Karakteristike populacije primordijalnih zametnih stanica sličnije su posvećenim linijama somatskih stanica kasnijih embrija, čije uvođenje u blastocistu također ne dovodi do stvaranja himernih embrija.

Modifikacija tehnike uzgoja embrioidnih tijela dobivenih agregacijom EG stanica omogućila je dobivanje još jedne populacije pluripotentnih stanica, nazvanih "stanice izvedene iz embrioidnih tijela" (EBD stanice), korištenjem selekcije na selektivnim medijima. Sposobnost EBD stanica da se dugo razmnožavaju u kulturi omogućila je stvaranje stabilnih staničnih linija posvećenih stanica. Dobiveni su klonovi stanica koje eksprimiraju širok raspon mRNA i proteinskih markera specijaliziranih stanica. Ovaj pristup u konačnici je dokazao da su ljudske primarne zametne stanice pluripotentne i da se in vitro diferenciraju u različite tipove stanica: neurone, neurogliju, vaskularni endotel, hematopoetske stanice, mišićne i endodermalne stanice.

Alternativni izvori embrionalnih matičnih stanica

Alternativni izvor linija ljudskih ESC-a mogu biti hibridne stanice. Implantacija u maternicu pseudogravidnih krava heterogenog konstrukta dobivenog fuzijom elektroporacijom somatskih stanica ljudskog fetusa s kravljim jajem iz kojeg je prethodno uklonjen pronukleus omogućuje dobivanje unutarnje stanične mase iz umjetnog embrija predimplantacijskih faza razvoja. U tu svrhu se u prvoj fazi dobiva blastocista iz kravljeg jaja s transplantiranom jezgrom ljudske stanice.

U drugoj fazi, embrioblast se izolira iz blastociste, a iz njega se ESC izoliraju Thomsonovom metodom. Vrijedno je napomenuti da su najbolji rezultati u izolaciji ESC linija ovom metodom dobiveni korištenjem jezgri folikularnih stanica ili primarnih zametnih stanica koje ostaju u ljudskom tijelu u stanju hibernacije. To je zbog činjenice da jezgre ljudskih stanica transplantiranih u kravlje jaje moraju imati neskraćene telomere i visoku telomeaznu aktivnost, što pomaže u izbjegavanju preranog starenja ESC klonova dobivenih iz hibridnog jaja (Repin, 2001). Poznato je da su najvažniji unutarstanični marker proteini ESC-a Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, koji pripadaju takozvanim proteinima utišivačima kromatina. Utišivači pružaju posebno kompaktno pakiranje heterokromatina, što sprječava stvaranje eukromatinskih petlji. Pakiranje kromatina posredovano ovim proteinima korelira s totipotentnošću ESC genoma. Do danas je utvrđeno da su zrele goveđe i ljudske oocite jedina vrsta specijaliziranih stanica koje sadrže visoke koncentracije proteina utišivača u citoplazmi. Na temelju toga razvijena je metoda za dobivanje hibridnih ESC-a prijenosom jezgri somatskih stanica u enukleirane goveđe oocite. Preliminarne in vitro studije pokazale su da citoplazma goveđih oocita vraća totipotentnost genoma jezgri ljudskih somatskih stanica nakon 12-24 sata kultivacije.

Posebno su zanimljivi podaci o osobitostima preimplantacijskog razvoja ljudskih embrija, što ukazuje na kasniju zamjenu totipotentnih stanica populacijom pluripotentnih stanica nego kod miševa. Studija staničnih transformacija pokazala je da trofoblastne stanice također nastaju iz stanica unutarnje stanične mase ljudskih blastocista, uz ESC, što ukazuje na njihovu ukupnu potentnost.

Poznato je da u fazi blastociste nastaju dvije različito predane stanične populacije. Jedna od njih tvori vanjski sloj blastociste - trofektoderm, čiji su derivati stanice trofoblasta i druge embrionalne komponente posteljice. Druga populacija stanica grupirana je u gustu masu koja dodiruje unutarnju površinu trofektoderma. Derivati populacije stanica unutarnje stanične mase su sva tkiva i rudimenti organa embrija. U fazi kasne blastociste, iz unutarnje stanične mase nastaje ekstraembrionalni endoderm i formira se epiblast (primarni ektoderm). U ovom slučaju, stanice epiblasta zadržavaju pluripotentnost, dok je sposobnost diferencijacije stanica ekstraembrionalnog endoderma ograničena.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Dobivanje ljudskih embrionalnih matičnih stanica

Do nedavno se vjerovalo da je nemoguće dobiti ESC iz trofoblasta. Međutim, linija diploidnih matičnih stanica trofektoderma izoliranih iz blastociste proliferira i transformira se u matične stanice u mediju koji sadrži FGF2 i heparin umjesto LIF-a. Ako se FGF2 ukloni iz medija, stanice trofektoderma prestaju se množiti, u njima počinje endoreduplikacija kromosoma, a stanični elementi trofektoderma postupno se transformiraju u divovske stanice trofoblasta. Vjerojatno LIF ne stimulira proliferaciju stanica trofektoderma zbog činjenice da FGF2 pokreće drugačiji mehanizam trans-signalizacije, budući da FGF2, vežući se za plazma receptor (FGFR2), aktivira MAP kinaze u citoplazmi - ERK1 i ERK2. Posljedično, kada se u stanicama blastociste uključi jedan signalni put (LIF - gpl30 - JAK kinaza - STAT3), stanice unutarnje stanične mase transformiraju se u pluripotentne ESC, a kada se aktivira drugi mehanizam transmembranske transdukcije signala (FGF2 - FGFR2 - MAP kinaza ERK1/ERK2), u blastocisti se formiraju matične stanice trofektoderma. Izbor signalnog puta, pak, ovisi o aktivnosti gena oct4. Ovaj gen, koji pripada POU domeni, nalazi se u t-lokusu autosoma 17 i eksprimira se tijekom oogeneze, tijekom razdoblja cijepanja, kao i u stanicama unutarnje stanične mase blastociste i u primarnim zametnim stanicama. Funkcionalna uloga gena oct4 je kodiranje transkripcijskog faktora potrebnog za nastanak pluripotentnih stanica, njihovu diferencijaciju i dediferencijaciju.

Ekspresija gena oct4 u embrionalnim stanicama (ESC) varira ovisno o interakciji ovog transkripcijskog faktora s kofaktorima. Usmjerena regulacija ekspresije oct4 u blastocistama pokazala je da kada je njegova aktivnost smanjena, polovica stanica formira trofektoderm, dok kada se inducirana ekspresija oct4 poveća, pretežno nastaju ESC.

U eksperimentu, ESC-i se ne mogu prenijeti u liniju tijekom uzgoja totipotentnih blastomera u fazi cijepanja, kao ni u fazi gastrulacije i kasnijim fazama embrionalnog razvoja. Mišji ESC-i se obično izoliraju 3,5-4,5 dana trudnoće, što odgovara šestom (jednoslojna blastocista) i sedmom stadiju (dvoslojna blastocista - rani jajni cilindar) normalne embriogeneze. Očito je da mišji embriji samo u preimplantacijskom razdoblju sadrže stanične populacije sposobne za transformaciju u ESC-e. Posljedično, izolacija ESC linija moguća je samo u određenim fazama embriogeneze. Zigota i blastomeri koji nastaju tijekom cijepanja su totipotentni, s gledišta mogućnosti razvoja održivog embrija s embrionalnim membranama i posteljicom. Gubitak ukupne potencije zametnih stanica počinje u kasnoj fazi morule, kada daljnje vezanje blastomera ovisi o njihovoj lokaciji. Rani blastomeri morule zadržavaju totipotentnost, budući da eksperimentalne manipulacije s promjenama u njihovoj lokalizaciji, poput inverzije njihove lokacije, ne sprječavaju razvoj punopravnog embrija.

Utvrđeno je da na učinkovitost izolacije embrionalnih matičnih stanica u liniju utječe stanje blastocista u trenutku njihove eksplantacije. Korištenje blastocista nakon modeliranja sedmodnevne dijapauze u reproduktivnom traktu miševa kojima je ovarijektomirana 3,5 dana trudnoće i kojima je dan progesteron olakšava uspješniju izolaciju linija embrionalnih matičnih stanica. Pretpostavlja se da se u takvim uvjetima povećava broj blastomera koji tvore unutarnju staničnu masu. Također je moguće da se stanični ciklus produljuje i većina blastomera ulazi u G0 fazu.

Osim toga, stvaranje stabilnih pluripotentnih ESC linija ovisi o genotipu embrija: ESC se prilično lako izoliraju iz blastocista mišje linije 129, puno ih je teže dobiti korištenjem miševa CS7BL/6, a praktički je nemoguće izolirati ESC liniju iz blastocista miševa CBA/Ca. Očito je da rani embriji imaju neke genetske značajke koje utječu na razvoj pluripotentne ESC linije. Ipak, pri uzgoju izoliranih epiblasta, kao i selektivnom selekcijom diferencirajućih stanica, ESC linije su ipak izolirane iz ranih embrija miševa CBA/Ca.

Dokazana standardna tehnika za dobivanje ESC linija iz blastocista navedena je u laboratorijskim priručnicima o tehnici pokusa s ranim embrijima. Eksperimentalne ESC linije mogu se dobiti i uzgojem izoliranog epiblasta (primarnog ektoderma) mišjih embrija starih 4,5 dana korištenjem prilično složene mikrokirurške tehnike i modificiranih uvjeta uzgoja. Intenzitet rada ovog postupka je opravdan, budući da se učestalost stvaranja ESC linija u ovom slučaju pokazala znatno većom nego u radovima s unutarnjom staničnom masom blastociste.

Za izolaciju ESC linija, svaki klon se prenosi u mikrotitarsku jažicu, uzgaja se agregat od 40-60 stanica, a zatim se ponovno dispergira. Višestruka ponavljanja ovog postupka omogućuju nam dobivanje imortalizirane ESC linije s maksimalnom stopom proliferacije normokariotipskih stanica pričvršćenih na plastiku, koje zadržavaju totipotentnost i visoku telomeraznu aktivnost nakon 50-100 pasaža. U procesu održavanja ESC linija, najveća opasnost je kontaminacija medija ili seruma bakterijskim endotoksinima - čak i tragovi koncentracija endotoksina u mediju za kulturu uzrokuju masovnu smrt nezrelih zametnih stanica. Pažljivim praćenjem linearnog rasta i pravovremenom disperzijom, ESC u kulturi sposobne su za simetričnu diobu, u kojoj obje stanice kćeri ostaju pluripotentne i sposobne za izvođenje neograničenog broja staničnih ciklusa, održavajući diploidni kariotip i ukupnu potentnost.

Selekcija čiste populacije ljudskih ESC-a može se provesti nakon transfekcije njihovog genoma rekombinantnim molekulama DNA koje sadrže gen koji kodira sintezu zelenog fluorescentnog proteina (GFP). Ekspresija GFP-a povećava se kada se ESC-i uzgajaju u uvjetima koji podržavaju njihovu proliferaciju, dok se s početkom diferencijacije razina ekspresije ovog gena smanjuje, što omogućuje selekciju čistih stabilnih pluripotentnih staničnih linija na selektivnom mediju. Prilikom uzgoja ESC-a izoliranih pomoću GFP selekcije, učestalost stvaranja kolonija višestruko se povećava, budući da se snažan antiproliferativni učinak diferenciranih stanica eliminira u uvjetima selekcijskih kultura.

Translacija ljudskih embrionalnih matičnih stanica u liniju provodi se metodom njihove izolacije iz preimplantacijskih embrija (u fazi 80-120 stanica), koji ostaju nakon postupka in vitro oplodnje. U tu svrhu, umjetno dobiveni „višak“ embrija mehanički se dispergira u Delbecco-Eagle mediju. Nakon označavanja stanica selektivnim monoklonskim antitijelima s fluorescentnom oznakom, izoliraju se stanice embrioblasta. Embrioblast se dispergira u pojedinačne stanice pomoću smjese dispaze i kolagenaze. Disocirane stanice uzgajaju se u posebnom mediju (80% Delbeccoov medij + 20% fetalni teleći serum u prisutnosti 500 μg/ml IL-6, LIF i SCF) preko hranidbenog monosloja embrionalnih fibroblasta prva 3 pasaže. U ovom slučaju, preživljavanje i proliferacija matičnih i progenitorskih stanica održava se zbog učinka IL-6, LIF i SCF. U takvom mediju, ESC rastu kao suspenzijski klonovi nepričvršćenih, zgusnutih stanica, koje se moraju disocirati mekim, ponovljenim pipetiranjem. Novi klonovi pojavljuju se u suspendiranoj kulturi 5.-7. dana. Maksimalna brzina rasta ESC postiže se ponovljenom disocijacijom klonova u fazi od 10-15 stanica. Zatim se svaki klon prenosi u mikrotitarsku posudu i uzgaja do agregata od 40-50 stanica. Postupak se ponavlja mnogo puta u pasažama, povećavajući volumen kulture do gustoće od 5-10 milijuna stanica po posudi od 6 cm. Koristeći takvo pasiranje, Thomson je izolirao 10 besmrtnih klonova ljudskih ESC, koji su nakon 100 pasaža zadržali visoku aktivnost telomeraze, sposobnost snažnog razmnožavanja, minimalne fenotipske karakteristike i ukupnu potentnost sa sposobnošću diferencijacije u bilo koju od 350 specijaliziranih staničnih linija izvedenih iz ekto-, mezo- i endoderma. Diferencijacija ljudskih ESC započela je (nakon promjene medija, dodatka seruma i uklanjanja LIF-a) vezanjem stanica za supstrat, što ukazuje na razvoj citoskeleta i ekspresiju adhezijskih receptora. Važno je da su, uz neograničenu proliferaciju, ljudske ESC zadržale normalan kariotip.

Druga metoda izolacije linija ljudskih ESC-a temelji se na korištenju primarnih zametnih stanica. Eksperimentalne studije pokazale su da se linije E stanica mogu dobiti iz genitalnih nabora mišjih embrija starih 12,5 dana. Međutim, u tim slučajevima učestalost stvaranja progenitorskih staničnih linija bila je značajno niža nego u eksperimentima s ranijim embrijima. Istovremeno, primarne zametne stanice iz gonada mišjih embrija gestacijske dobi od 13,5 dana uopće se ne mogu transformirati u linije.

Prve stabilne linije pluripotentnih ljudskih EG stanica dobivene su iz primarnih gonocita izoliranih iz gonada embrija starih 5-9 tjedana. Izolirane stanice uzgajane su na supstratu inaktiviranih mišjih embrionalnih fibroblasta u DMEM mediju s fetalnim serumom nadopunjenim merkaptoetanolom, forskolinom i rekombinantnim ljudskim faktorima rasta (FGF i LIF). Nakon 7-12 dana u kulturi su se pojavile višestanične kolonije koje morfološkim značajkama i molekularnim markerima odgovaraju ljudskim EG stanicama. Nakon agregacije, ove stanice su formirale embrioidna tjelešca, čijim daljnjim razvojem su se pojavile specijalizirane stanice karakteristične za derivate sva tri zametna sloja. Tijekom 10-20 pasaža, EG stanične linije zadržale su normalan kariotip i nisu izgubile pluripotentnost.

Također je pokazano da kombinirano djelovanje LIF-a, membranski vezanih i topljivih Steel faktora te TGF-b mijenja razvojni program primordijalnih zametnih stanica. Umjesto prestanka mitotičkih dioba i početka diferencijacije prema oogenezi ili spermatogenezi, primordijalne zametne stanice nastavljaju proliferirati. Nakon nekoliko dodatnih mitotičkih ciklusa, postaju slične stanicama epiblasta i, gubeći svojstva prekursora zametnih stanica, transformiraju se u pluripotentne embrionalne matične EG stanice.

Tako su 1998. godine prvi put izolirane imortalizirane linije primordijalnih zametnih stanica iz genitalnog rudimenta tkiva autopsije ljudskog fetusa. U ljudskoj embriogenezi, primordijalne zametne stanice pojavljuju se u žumanjčanoj vrećici u 3. tjednu razvoja, a u 4.-5. tjednu te stanice migriraju u zonu genitalnog tuberkula, gdje tvore dormantne populacije primarnih gonocita. U neaktivnom stanju, primordijalne zametne stanice ostaju u embriju do rođenja. Linije primordijalnih zametnih stanica izoliraju se iz fetalnog genitalnog tuberkula embrija od 5-9 tjedana, čije se ekstrahirano tkivo ex tempore tretira smjesom kolagenaza tipova IV-V, hijaluronidaze i DNaze kako bi se povećao kvantitativni i kvalitativni prinos stanica. Primordijalne zametne stanice u tkivu fetalnog genitalnog tuberkula okružene su stromalnim (mezenhimskim) Sertolijevim stanicama. Funkcionalna svrha Sertolijevih stanica je proizvodnja antiapoptotičkih faktora (Fas ligand), mitogena i imunosupresiva koji štite zametne stanice od imunološkog napada tijela. Osim toga, stromalno mikrookruženje genitalnog tuberkula igra važnu ulogu u sazrijevanju gameta. Izolirane primarne zametne stanice se sade u kulturu preko hranjivog stromalnog sloja koji se sastoji od fetalnih fibroblasta prva tri pasaže. Najučinkovitija kombinacija mitogena je kompleks koji se sastoji od LIF-a, FGF-a i forskolina (stimulator stvaranja cAMP-a). Proliferacija primarnih zametnih stanica in vitro zahtijeva dodatak fetalnog seruma, u čijoj prisutnosti reprodukciju primarnih gonocita u kulturi prati stvaranje klonova sferičnih stanica koje nisu pričvršćene za supstrat.

U Nacionalnom institutu za zdravlje SAD-a, na temelju sažetka postojećih podataka o metodama izolacije linija ljudskih ESC-a iz blastocista, donesen je preliminarni zaključak da je uspješna izolacija ESC-a najvjerojatnija pri uzgoju blastocista s dobro formiranom unutarnjom staničnom masom (Matične stanice: znanstveni napredak i budući istraživački smjerovi. Nacionalni institut za zdravlje SAD-a). S tog gledišta, optimalni izvor ESC-a za stvaranje linija su ljudske blastociste 5. dana razvoja, iz kojih treba pažljivo ukloniti trofektoderm prilikom izolacije unutarnje stanične mase. Izolirana unutarnja stanična masa, koja se u ovoj fazi sastoji od 30-35 stanica, treba se uzgajati na supstratu embrionalnih mišjih fibroblasta, što je odlučujući uvjet za stvaranje kolonija ESC-a u kulturi.

Analiza fenotipskih značajki embrionalnih matičnih stanica

Od posebnog je interesa interspecijska komparativna analiza fenotipskih značajki ESC-a. Utvrđeno je da su kolonije ljudskih ESC-a gusti nakupini spljoštenih, epitelnih stanica, dok se mišja embrioidna tijela sastoje od labavog konglomerata zaobljenih stanica. U ljudskim ESC-ima, indeks omjera jezgre i plazme niži je nego u mišjim ESC-ima. Embrionalne matične stanice majmuna tvore ravnije kolonije stanica s neravnim rubovima. Pojedinačne stanice lako su vidljive u ranim klonovima ESC-a primata. Proliferirajuće ESC-e svih proučavanih životinjskih vrsta ne eksprimiraju molekule MHC klase I i II. Istovremeno, ljudske ESC-e daju pozitivnu reakciju na antitijela TERA 1-60 i GCTM-2, što ukazuje na prisutnost proteoglikana keratin/kondroitin sulfata na njihovoj površini, karakterističnih za matične stanice embrio-(terato)-karcinoma. Ekspresija gena oct4 u ESC-ima svih životinjskih vrsta sugerira da je, unatoč fenotipskim razlikama, isti skup gena odgovornih za održavanje pluripotentnosti očito aktiviran u ljudskim i mišjim ESC-ima (Peru, 2001). Osim toga, ESC linije izolirane iz embrija štakora, svinje, zeca, primata i goveda imaju slične morfološke karakteristike, sličan skup molekularnih identifikacijskih markera i gotovo identičan molekularni mehanizam za provedbu programa embriogeneze, što nam omogućuje novi pogled na problem ksenotransplantacije.

Za razliku od normalne embriogeneze in vivo, proliferaciju ESC-a in vitro ne prati stvaranje zametnih slojeva i događa se na pozadini blokiranja homeotskih Hox gena, tj. bez organogeneze. Budući da geni segmentacije ne funkcioniraju, nemoguće je reproducirati takva razdoblja embriogeneze kao što su polaganje somita, segmentacija embrija, stvaranje žumanjčane vrećice, alantoisa i drugih privremenih organa i tkiva u kulturi ESC-a. Čini se da su se kultivirane ESC-e zamrznule na početku procesa stvaranja 350 restrikcijskih linija specijaliziranih stanica. Dakle, klon stanica kćeri progenitora i centralno lokalizirana ESC-a predstavljaju samo model embrija, tijekom čijeg razvoja se istovremeno formiraju različite linije specijaliziranih stanica u različitim regijama tkiva, koje, međutim, potječu od zajedničkih prekursora. Unatoč minimalnoj razini receptora na površini ESC-a, one zadržavaju sposobnost provođenja primitivnih morfogenetskih procesa, oponašajući volumetrijske strukture ranog embrija: suspenzija ESC-a u kulturi agregira se i formira strukture koje nalikuju blastocistama ili čak kasnijim embrijima (jajni cilindri). Takvi suspenzijski agregati nazivaju se jednostavnim i složenim embrioidnim tjelešcima.

U miješanoj diferencijaciji, rani geni ektoderma (oct3, fgf-5, nodal), endoderma (gata-4), mezoderma (brachyury), kardiogenog mezoderma (pkh-2.5), neuralne cijevi (msx3) i hematopoeze (elkf) istovremeno se eksprimiraju u različitim stanicama jednog embrioidnog tijela. Korištenjem različitih kombinacija faktora rasta i citokina za ciljano djelovanje na stvaranje stanica zametnog sloja in vitro, u nizu slučajeva bilo je moguće dobiti embrioidna tijela u kojima su se preferencijalno eksprimirali geni ektoderma ili mezoderma, što otvara put modeliranju gastrulacije i početnih faza organogeneze.

Klonski rast ESC-a dokaz je asimetrične stanične diobe, u kojoj samo jedan ESC u središtu klona zadržava neograničen potencijal proliferacije, dok druga stanica kćeri generira generaciju progenitorskih stanica koje već prolaze kroz diferencijaciju. Stoga je stopa proliferacije klona na periferiji embrioidnog tijela veća nego u središtu. Marginalne stanice rastućeg klona prolaze kroz spontanu poremećenu diferencijaciju, migriraju ili umiru apoptotičkim mehanizmima. Ovi događaji određuju sudbinu klona: ako stopa proliferacije premaši stopu migracije i apoptotske stanične smrti, klon nastavlja rasti, stabilizacija se događa kada su stopa apoptoze i stopa stvaranja novih stanica jednake, a regresija se događa kada je omjer tih procesa inverzan. Progenitorske stanice se simetrično dijele, tj. obje stanice kćeri se potom diferenciraju u zrele specijalizirane stanične linije. Omjer ESC-a i progenitorskih stanica varira, ali broj ESC-a uvijek je samo dio postotka populacije progenitorskih stanica. Stoga, samo pažljivo pipetiranje i pravovremena disagregacija klonova mogu povećati broj ESC-a u kulturi. Disagregacija klonova u fazi od 10-12 stanica pokazala se najučinkovitijom za dobivanje maksimalnog prinosa ESC-a. Smjer i stupanj diferencijacije stanica u embrioidnom tijelu ovise o njihovoj lokaciji. Vanjske stanice embrioidnog tijela ne eksprimiraju gen oct4 i podliježu diferencijaciji u stanice primarnog endoderma, iz kojih se naknadno formiraju epitelno slične stanice parijetalnog i visceralnog ekstraembrionalnog endoderma. Unutarnje stanice embrioidnog tijela eksprimiraju gen oct4 i zadržavaju pluripotentnost tijekom 48 sati uzgoja. Međutim, kultura se zatim morfološki restrukturira u epitelni monosloj i započinje ekspresija gena koji kontroliraju razvoj primarnog ektoderma. Zatim započinje proces potpune poremećene citodiferencijacije pojavom različitih tipova stanica koji su derivati sva tri zametna sloja. U procesu spontane diferencijacije stanica embrioidnog tijela, prvi se pojavljuju agregati s endodermnim markerima u obliku fragmenata (cista) žumanjčane vrećice. Zatim se u tim strukturama pojavljuju angioblasti i endotelne stanice rastućih kapilara. U završnim fazama spontane diferencijacije, iz unutarnjih stanica embrioidnog tijela razvijaju se različite terminalno diferencirane stanice, uključujući neurone, glialne elemente, kardiomiocite, makrofage i eritrocite. Do određene mjere (uzimajući u obzir prostornu inverziju formiranja slojeva germinativnog tkiva), korištenjem embrioidnih tijela moguće je proučavati morfogenetske procese in vitro i analizirati molekularne mehanizme početnih razdoblja embrionalne citodiferencijacije,kao i utvrditi ulogu specifičnih gena u provedbi tih procesa.

Dakle, unutar klona postoje stanice u kojima su otkriveni različiti programi genetskog razvoja - ESC, rani progenitori i diferencirajuće populacije progenitora. Uzgoj ESC metodama viseće kapi ili masovne kulture bez hranidbenog sloja i bez dodavanja LIF-a u medij neizbježno dovodi do stvaranja embrioidnih tijela. Morfologija stanica vanjskog i unutarnjeg sloja embrioidnih tijela razlikuje se. Vanjski sloj sastoji se od velikih, razgranatih stanica. Njihova površina okrenuta prema okolini prekrivena je brojnim mikroresicama. Vanjski sloj stanica odvojen je od unutarnjeg sloja bazalnom membranom koja nalikuje Reichertovoj membrani, dok su stanice unutarnjeg sloja embrioidnih tijela stupčasti epitel. Morfološki, unutarnji sloj, iako sadrži mnogo stanica koje se dijele, više nalikuje nediferenciranim kolonijama ESC.

Karakteristike ljudskih embrionalnih matičnih stanica

Odsutnost parenhimatozno-mezenhimalnih signalnih interakcija na pozadini blokiranja gena homeoze dovodi do poremećenog rasta ESC-a u kulturi, budući da to remeti formiranje i razvoj infrastrukture privremenih organa. Neorganizirani rast i poremećena spontana diferencijacija ESC-a u kulturi posljedica su odsutnosti mezenhimalnog označavanja stromalnog okvira budućih organa: in vitro je sasvim moguće formirati milijune hepatocita, ali je nemoguće dobiti jedan lobulus jetre koji uključuje takve strukturne i funkcionalne elemente kao što su sinusi, Disseovi prostori i Kupfferove stanice.

Smatra se da se pluripotentnost ESC-a ostvaruje isključivo u embriogenezi stvaranjem tkiva i organa embrija, dok su posteljica i pupčana vrpca derivati trofoblasta. ESC-i zatvoreni u trofektodermalnoj membrani sekvencijalno generiraju klonove privremenih stanica koje provode program razvoja putem kombinatorne mRNA volumetrijske topografske matrice Nokhteyova, koja predodređuje prostorni raspored, oblik i veličinu, broj stanica privremenih i konačnih organa, kao i sastavljanje parenhima u strukturne i funkcionalne jedinice. Istovremeno, ESC-i ostaju jedina vrsta stanica u kojima je molekularni mehanizam za provedbu njihovih potencija potpuno odvojen od genetskog programa razvoja, a same ESC-i su lišene sposobnosti interakcije s drugim stanicama zbog blokiranja i percepcije receptora i transsignalnih sustava. Međutim, adekvatna aktivacija ESC-a dovodi do postupnog razvoja programa embriogeneze, završavajući rođenjem potpuno formiranog organizma, koji se sastoji od milijardi stanica, spremnih za izvanmaterični život. Na ovom kratkoročnom, ali nezamislivo dugotrajnom putu u staničnom prostoru, neizbježno se javljaju pogreške kako u molekularnim mehanizmima koji osiguravaju vitalnu aktivnost stanica, tako i u programima koji kontroliraju njihovu proliferaciju, diferencijaciju i specijalizaciju. Stoga se u modernoj farmakogenomici bolesti molekularne strukture i bolesti staničnog programiranja razmatraju odvojeno. Štoviše, djelovanje većine novih lijekova usmjereno je na ispravljanje programa diferencijacije, proliferacije i organogeneze, kao i regeneraciju organa i tkiva. U odraslom organizmu, ESC omogućuju kontrolu ponašanja matičnih/progenitorskih stanica transplantiranih u mozak, jetru, slezenu, koštanu srž i druge ljudske organe kako bi se obnovio oštećeni parenhim organa primatelja diferencijacijom i specijalizacijom donorskih stanica na sačuvanoj mezenhimalnoj matrici. U biti, program totipotentnosti počinje se ostvarivati na razini genoma oocita, zigota i blastomera; međutim, te stanice još nisu klonirane i pasažirane u količinama potrebnim za potrebe eksperimentalne i praktične medicine. Stoga ESC ostaju jedinstven izvor genetskih informacija koje sadrže kodove za trodimenzionalnu mapu embrija i kodove za linearnu restrikciju specijaliziranih staničnih linija tijekom gastrulacije.

Gotovo neograničen regenerativni potencijal ESC-a posljedica je činjenice da njihov genom, za razliku od genetskog aparata diferenciranih somatskih stanica, zadržava pluripotentnost. Jedna od manifestacija mirujućeg stanja genetske informacije ugrađene u ESC je takozvani minimalni fenotip - ograničen broj receptora eksprimira se na površini ESC-a, te se stoga vrlo malo trans-signalnih programa koristi za interakciju nuklearnog aparata stanice s njezinim mikrookruženjem. Na pozadini hibernacije gena odgovornih za restrikciju specijaliziranih staničnih linija i diferencijaciju stanica, aktivira se samo oko 30 od 500 gena, čiji produkti osiguravaju vezu stanice s okolnim mikrookruženjem. Korištenjem metode serijske analize genske ekspresije pokazano je da uz zajednički rad glavnih funkcionalnih okvira genoma koji reguliraju energetiku i metabolizam u somatskim stanicama i ESC-ima, potonji imaju vrlo nisku razinu mRNA receptora, G proteina, sekundarnih glasnika, transkriptaza, kofaktora ekspresije i represije, tj. cijelog sustava transmembranskog prijenosa regulatornog signala u stanicu. To je zbog odsutnosti ili vrlo niske ekspresije transsignalnih gena. Tijekom razdoblja inducirane diferencijacije u genomu ESC-a, 18 funkcionalnih gena sinkrono prestaje s radom na pozadini aktivacije 61 transsignalnog gena koji kontroliraju sintezu receptora stanične adhezije, komponenti izvanstaničnog matriksa, restrikcijskih transkriptaza i glasničkih elemenata sustava prijenosa signala do nuklearnog aparata od receptora stanične plazma membrane. Istovremeno, blokirana je ekspresija gena odgovornih za sintezu proteina utišivača, kao i koinhibitorâ ekspresije gena koji osiguravaju totipotentnost genoma ESC-a.

Genski markeri pronađeni su za stanice sva tri zametna sloja. Identifikacija ektodermalnog staničnog sloja provodi se ekspresijom gena nodal, oct3 i fgf-5, mezodermnih stanica - genima brahiurije i zeta-globina, a endoderma - ekspresijom gena gata-4. U normalnoj embriogenezi tijekom razdoblja gastrulacije opaža se aktivna migracija nezrelih populacija matičnih i progenitorskih stanica, koje lokalno označavaju razvojne zone kostiju lica lubanje, nekih dijelova mozga, perifernog živčanog sustava, srčanog provodnog sustava i timusa, čija se tkiva formiraju od klonova migrirajućih stanica. Označavanje stanica ranim genima zametnih slojeva olakšava zadatak topografske analize procesa migracije prekursorskih stanica u razvoju embrija. Posebno je utvrđeno da u agregatima stanica embriokarcinoma P19 ekspresija prvog mezodermnog gena brahiorija počinje tijekom razdoblja smanjene ekspresije gena aktivatora tkivnog plazminogena, a-fetoproteina, keratina 8 i keratina 19, koji su markeri prvih migrirajućih populacija mezoderma. Posljedično, stvaranje tkiva mezodermalnog podrijetla počinje tek nakon završetka procesa točkaste migracije i raspršivanja mezodermalnih progenitorskih stanica.

Unatoč izuzetno ograničenim fenotipskim značajkama i odsutnosti većine trans-signalnih jedinica, ESC-i još uvijek eksprimiraju neke receptorske molekule koje se mogu koristiti za njihovu identifikaciju. Vrijedno je napomenuti da su se ESC marker antigeni kod ljudi i primata pokazali uobičajenima. Najčešće se za označavanje ESC-a koriste obilježena antitijela na membranski vezane antigene SSEA-3, SSEA-4 (jedinstveni lipidni antigeni koji predstavljaju kompleks glikolipida GL7 sa sijalinskom kiselinom), kao i visokopolimerni glikoproteini TRA-1-81, TRA-1-60. Osim toga, ESC-i eksprimiraju specifični embrionalni antigen SSEA-1 i endogenu alkalnu fosfatazu, kao i specifični transkripcijski faktor Oct4. Potonji je neophodan za održavanje mehanizama proliferacije ESC-a - specifični transkripcijski faktor Oct4 aktivira ekspresiju gena faktora rasta fibroblasta 4 i stabilizira ekspresiju okvira gena odgovornih za neograničenu replikaciju DNA u nezrelim stanicama. Najvažniji unutarstanični marker proteini su Oct3, Oct4, Tcf i Groucho, koji su povezani s proteinima utišivačima kromatina.

Gotovo odmah nakon što su mnogi uspješni pokušaji uzgoja ESC-a izvan tijela i dobivene su prve kulture matičnih stanica izoliranih iz mišjih blastocista i kulture primarnih zametnih stanica, započela je faza istraživanja pluripotentnog potencijala ESC-a kada su one unesene u embrije u ranim fazama razvoja. Pokazalo se da su u stadiju morule i blastociste ESC-i sposobni formirati himerne embrije u kojima se potomci donorskih ESC-a otkrivaju u svim somatskim tkivima, pa čak i u gametama. Tako je u razvojnoj biologiji, korištenjem ESC-a, uspostavljen „most“ između eksperimentalnih studija in vivo i in vitro, što je značajno proširilo mogućnosti proučavanja procesa polaganja primarnih tkiva i organa, njihove diferencijacije i embrionalne organogeneze.

Jasno je utvrđeno da se in vivo tijekom embriogeneze ESC integriraju u staničnu masu ranog embrija, a njihovi derivati nalaze se u svim organima i tkivima. ESC koloniziraju liniju zametnih stanica u himernom embriju, čiji potomci tvore punopravne jajne stanice i spermije. Embrionalne matične stanice su klonogene - jedna ESC sposobna je stvoriti genetski identičnu koloniju stanica s molekularnim markerima, koji uključuju ekspresiju gena oct4 i alkalne fosfataze, visoku aktivnost telomeraze i ekspresiju određenih embrionalnih antigena.

Za proučavanje mehanizama embriogeneze pomoću ESC-a razvijena je metoda himerizacije morule stvaranjem biološkog konstrukta, izvan kojeg se nalazi sloj tetraploidnih blastomera primatelja, a unutra se uvode ESC-ovi donori. Dakle, trofoblast se formira od potomaka tetraploidnih blastomera primatelja, što osigurava implantaciju i placentaciju, a ESC-ovi donori djeluju kao unutarnja stanična masa iz koje se formira tijelo održivog embrija i linija primarnih progenitorskih zametnih stanica. Istraživačka vrijednost ESC-a ne leži samo u činjenici da se pluripotentnost očuva tijekom in vitro manipulacija s njihovim genomom, već i u činjenici da se očuva sposobnost ESC-a da sudjeluju u formiranju primarnih zametnih stanica himernog embrija. Pokazalo se da potomci samo jednog genetski modificiranog ESC-a naseljavaju sve primarne rudimente i tkiva u razvoju himernog embrija dobivenog agregacijom ili kokultivacijom ove stanice s 8-staničnim embrijem. Kada su ESC transficirane genom zelenog fluorescentnog proteina transplantirane u morulu miševa, fluorescentni potomci ove stanice pronađeni su u svim proučavanim tkivima embrija u razvoju (Shimada, 1999.). Transplantacija ESC-a u morulu omogućuje stvaranje održivih miševa čiji se organizam sastoji samo od potomaka ESC-a donora, što otvara perspektive za različite mogućnosti terapijskog kloniranja. Ovaj metodološki pristup sada se uspješno koristi za proučavanje problema razvojne biologije, posebno se koristi za analizu mehanizama genetske inaktivacije X kromosoma ili epigenetske nestabilnosti ESC-a. Transplantacija ESC-a u rani embrij također se koristi u poljoprivrednoj biotehnologiji, kao i u eksperimentima genske terapije.

Transplantacija genetski modificiranih ESC-a koristi se za testiranje ciljnih stanica mutiranih gena. ESC-i uzgojeni in vitro koriste se u biotehnologiji za stvaranje knockout miševa. U tu svrhu, gen koji se proučava uklanja se iz ESC-a homolognom rekombinacijom (knockoutom), a stanice kojima nedostaje taj gen izoliraju se na selektivnim medijima. Knockout ESC-i se zatim uvode u blastocistu ili agregiraju s blastomerima morule. Himerni rani embriji dobiveni na ovaj način transplantiraju se u ženke primateljice, a jedinke s gametama nulizygotnim za određeni gen odabiru se među novorođenim miševima. Ova tehnologija korištena je za stvaranje mnogih linija knockout miševa, koji se široko koriste u eksperimentalnoj biologiji i eksperimentalnoj medicini. Takvi biološki modeli koriste se za proučavanje značaja određenih gena u embrionalnom razvoju, kao i njihove uloge u mehanizmima ljudskih bolesti i patoloških stanja. Osim toga, knockout životinjske linije koriste se u predkliničkom testiranju novih metoda genske terapije. Na primjer, transfekcijom normalnog alela mutiranog gena u genom ESC-a moguće je učinkovito ispraviti mutaciju koja utječe na hematopoetski sustav. Uvođenje stranih gena u ESC omogućuje brzo stvaranje linija homozigotnih transgeničnih laboratorijskih životinja. Međutim, treba napomenuti da je tehnika ciljane rekombinacijske delecije gena do sada pouzdano razvijena samo u odnosu na mišje ESC. Korištenjem dvostruko knockout mišjih ESC utvrđena je funkcionalna uloga regije genskog klastera na kromosomu 7 (kopija genomske regije na ljudskom kromosomu 19) i proksimalne regije kromosoma 11 (kopija ljudskog kromosoma 5g) - delecija ovih gena u mišjim ESC omogućila je procjenu funkcije njihovih analoga u ljudi.

Mogućnosti proučavanja funkcije gena ljudske embriogeneze su se proširile, čija je transfekcija u genom ESC-a laboratorijskih životinja omogućila, posebno, razjašnjenje uloge kripto gena u formiranju i razvoju kardiogenog mezoderma, gena pax-6 - u embriogenezi oka. Sastavljaju se prve karte ekspresije gena u nezrelim proliferirajućim ESC-ima teratokarcinoma i blastocista miševa, a potvrđena je i supresivna represija transsignalnih gena u ESC-ima. Kombinacija 60-80 mutiranih ESC-a i 20-30 stanica normalnih preimplantacijskih mišjih embrija dovodi do razvoja himernih embrija u kojima se primordije organa sastoje od donorskih i primateljskih stanica, što omogućuje razjašnjenje uloge nepoznatih gena u gastrulaciji i organogenezi. Funkcionalna karta gena mišjih embrija u razvoju nadopunjena je informacijama o ulozi gena sf-1 u stvaranju nadbubrežne žlijezde i gonada, gena wt-1 u stvaranju bubrega, gena obitelji myoD u stvaranju skeletnih mišića i gena obitelji gata-1-4 u restrikcijskom sazrijevanju rudimenta eritropoeze i limfopoeze.

Usmjereno isključivanje majčinskih i očinskih alela gena u ESC-ima pomoću vektorskih rekombinaza omogućilo je razjašnjenje funkcija različitih gena u ranom razdoblju embriogeneze, a tehnologija usmjerenog prijenosa nepoznatih ljudskih gena u mišje ESC-e doprinosi otkriću novih mutantnih gena odgovornih za razvoj teške nasljedne patologije. Korištenjem metode knockout, utvrđen je obvezni značaj nekih gena za stvaranje embrionalnih tkiva: gata-4 - za miokard, gata-1 - za eritroidnu lozu hematopoetskog tkiva, myoD - za skeletne mišiće, brahiurija - za mezoderm, restrikcijske transkriptaze hnf3 i hnf4 - za matične stanice jetre, rag-2 - za stvaranje klonova T- i B-limfocita (Repin, 2001). Dvostruko brisanje gena u ESC-ima otvorilo je pristup proučavanju funkcionalne uloge gena zametnog sloja, segmentacije i homeoze, a transplantacija ESC-a omogućila je dobivanje održivih međuvrsnih hibridnih embrija. Korištenjem poboljšane tehnike transplantacije ESC-a jednog donora u 8-stanični embrij, dokazana je činjenica kimerizacije na staničnoj razini mnogih organa embrija primatelja. Treba napomenuti da su stanični klice ljudskog tkiva pronađene u organima miševa primatelja nakon unošenja ljudskih hematopoetskih matičnih stanica u blastocistu. Utvrđeno je da pluripotentne ESC cirkuliraju u krvi mišjih embrija tijekom razdoblja formiranja organa. Moguće je da njihova biološka funkcija leži u embrionalnoj organizaciji budućeg imunološkog sustava. Uz pomoć ESC-a, u laboratorijskim uvjetima reproducirani su adekvatni modeli ljudske genetske patologije: dvostruki nokaut gena distrofina modelira Duchenneovu mišićnu distrofiju kod miševa i gašenje gena atm (kontrola sinteze kromatinske signalne kinaze) - ataksija-telangektazija. Kod ove fatalne nasljedne bolesti kod djece, degeneracija Purkinjeovih stanica u malom mozgu razvija se zbog defekata u reparaciji DNA, što je popraćeno involucijom timusa zbog smrti proliferirajućih stanica. Klinička slika, patofiziologija i patomorfologija ataksije-telangektazije, reproducirane unošenjem patoloških genetskih informacija u ESC, kod himera miševa odgovaraju onima kod ljudi. Osim ataksije-telangektazije, korištenjem ESC i knockout miševa razvijeni su eksperimentalni modeli nekih nasljednih homozigotnih ljudskih bolesti povezanih s patologijom metabolizma ugljikohidrata i lipida, katabolizmom aminokiselina te izlučivanjem bakra i bilirubina, što je značajno proširilo mogućnosti eksperimentalne medicine u fazi predkliničkog ispitivanja novih metoda liječenja odgovarajućih ljudskih bolesti.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Upotreba citohibrida matičnih stanica

Hibridne stanice dobivene spajanjem ESC-a sa somatskim stanicama adekvatan su i obećavajući model za proučavanje pluripotentnosti matičnih stanica i reprogramiranje kromosoma diferenciranih stanica. Citohibridi dobiveni spajanjem ESC-a s diferenciranim stanicama odrasle životinje omogućuju proučavanje odnosa između genoma različite „dobi“: jedinstvena situacija nastaje kada se homologni kromosomi koji potječu iz stanica u različitim fazama diferencijacije i različitim stupnjevima zrelosti nalaze u istoj jezgri, gdje mogu lako izmjenjivati trans-aktivne regulatorne signale. Teško je predvidjeti kako će cisregulacijski epigenetski sustavi homolognih kromosoma, nastali tijekom individualnog razvoja, reagirati na utjecaj trans-aktivnih signala koji proizlaze iz embrionalno srodnih genoma. Osim toga, u hibridnim stanicama dolazi do segregacije roditeljskih kromosoma, što nam omogućuje proučavanje interakcije genoma na razini pojedinačnih kromosoma, odnosno potencijalno identificiranje sudjelovanja specifičnih kromosoma u održavanju pluripotentnosti ili, obrnuto, izlasku u diferencijaciju.

Citohibridi dobiveni spajanjem pluripotentnih teratokarcinoma i diferenciranih somatskih stanica korišteni su kao prvi eksperimentalni model za proučavanje interakcije genoma s različitim „razvojnim povijestima“. U nekim slučajevima, takve hibridne stanice zadržale su pluripotentna svojstva na prilično visokoj razini. Konkretno, in vivo hibridne stanice teratokarcinoma i somatske stanice inducirale su razvoj pravih teratoma koji sadrže derivate sva tri zametna sloja, a in vitro u suspenzijskim kulturama formirale su embrioidna tijela. Čak i kod interspecifičnih citohibrida ovog tipa, prisutnost embrionalnih antigena uočena je u slučajevima kada su somatski partneri u fuziji sa stanicama teratokarcinoma bili limfociti ili timociti. Vrijedno je napomenuti da su citohibridi nastali spajanjem stanica teratokarcinoma s fibroblastima odgovarali fibroblastima po fenotipu.

Najvažnija utvrđena činjenica jest da su se u hibridnim stanicama teratokarcinoma i somatskih stanica pojavili znakovi reprogramiranja diferenciranog staničnog genoma, što je karakterizirano reaktivacijom ili pojedinačnih gena ili neaktivnog X kromosoma somatskog partnera. Dakle, rezultati studija na citohibridima staničnog tipa teratokarcinoma i somatskih stanica ukazuju na to da je pluripotentnost često očuvana u hibridnim stanicama te da postoje znakovi reprogramiranja genoma somatskog partnera.

U eksperimentima dobivanja intraspecifičnih embrionalnih hibridnih stanica spajanjem mišjih ESC-a s odraslim splenocitima, proučavane su karakteristike takvih citohibrida, analizirana je segregacija roditeljskih kromosoma i procijenjena je pluripotentnost hibridnog genoma. Intraspecifične hibridne stanice dobivene spajanjem stanica teratokarcinoma sa somatskim stanicama obično karakterizira niska razina segregacije kromosoma s tetraploidnim ili gotovo tetraploidnim kariotipom. Sličan kromosomski sastav uočen je kod citohibrida tijekom spajanja primarnih zametnih stanica s limfocitima. Istovremeno, interspecifične hibridne stanice dobivene spajanjem stanica teratokarcinoma miša s limfocitima nerca pokazale su intenzivnu segregaciju kromosoma somatskog partnera.

Kvalitativno nova faza u proučavanju segregacije roditeljskih kromosoma u intraspecifičnim hibridima započela je nakon razvoja metode za analizu mikrosatelita pomoću lančane reakcije polimeraze, zahvaljujući kojoj je pronađeno nekoliko stotina markera za svaki mišji kromosom, što omogućuje pouzdano razlikovanje bilo kojeg para homolognih kromosoma u hibridnim stanicama.

Spajanjem ESC-a (HM-1 stanice s nedostatkom aktivnosti hipoksantin fosforiboziltransferaze, 2n = 40, XY, izolirane iz blastocista miševa 129/01a) sa splenocitima kongeničnih DD/c miševa, bilo je moguće dobiti skup hibridnih klonova morfološki sličnih ESC-ima. Svi klonovi su izolirani na selektivnom mediju u kojem mogu rasti samo stanice s aktivnom hipoksantin fosforiboziltransferazom. Elektroforetska analiza pokazala je da svi klonovi imaju alelnu varijantu hipoksantin fosforiboziltransferaze karakterističnu za DD/c miševe. Citogenetska analiza pokazala je da tri od četiri hibridna klona imaju gotovo diploidni skup kromosoma. Jedan gotovo tetraploidni klon sadržavao je dvije populacije hibridnih stanica, od kojih je jedna bila tetraploidna, a druga, manja, diploidna.

Mikrosatelitska analiza, koja omogućuje razlikovanje bilo kojeg para homolognih kromosoma miševa 129/01a i DD/c, u hibridnim klonovima s gotovo diploidnim skupom pokazala je da je u dva klona postojala jasna preferencijalna eliminacija autosoma somatskog partnera. Većina autosoma u klonovima HESS2 i HESS3 imala je markere linije 129/01a, tj. pluripotentnog partnera. Iznimka su bili kromosomi 1 i I: u klonovima HESS2 i HESS3, uz markere HM-1 stanica, markeri somatskog partnera bili su prisutni u malim količinama. Takvi rezultati mogu odražavati nepotpunu segregaciju kromosoma 1 i I somatskog partnera i u skladu su s citogenetskim podacima da se trisomija za ove kromosome opaža u 30-40% stanica klonova HESS2 i HESS3. Klon HESS4 značajno se razlikovao u svom kromosomskom sastavu: mnogi autosomi u ovom klonu potječu iz ESC genoma (kromosomi 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 i 17), ali kromosomi 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 i 19 bili su predstavljeni homolozima oba roditelja. Kvantitativni omjer mikrosatelita koji označavaju ove homologne kromosome bio je približno 1:1. To je autorima omogućilo pretpostavku da jedan homolog potječe iz ESC genoma, a drugi iz diferenciranih stanica. U nekim subklonovima klona HESS4 bili su prisutni samo markeri kromosoma 18 i 19 somatskog partnera. Dobiveni rezultati ukazuju na to da je u stanicama HESS4 klona, osim segregacije kromosoma somatskog partnera, došlo i do eliminacije jednog ili oba homologa gore navedenih kromosoma pluripotentnog genoma, odnosno došlo je do bilateralne segregacije kromosoma oba roditelja - vrlo neobičan fenomen, budući da je segregacija kromosoma samo jednog od roditelja karakteristična za citohibride.

Osim toga, nakon 20. pasaže, svi klonovi hibridnih stanica sadržavali su samo markere X kromosoma somatskog partnera, tj. ESC X kromosom je u klonovima zamijenjen X kromosomom somatskog partnera. Ovu važnu činjenicu potvrđuju podaci in situ hibridizacije korištenjem FITC-obilježene sonde specifične za mišji X kromosom: pozitivan signal detektiran je samo na jednom kromosomu. Treba napomenuti da su u ranijim fazama uzgoja (prije 15. pasaže), prema citogenetskim podacima, mnoge stanice sadržavale dva X kromosoma. Stoga, korištenje selektivnih medija omogućuje manipuliranje kromosomskim sastavom hibridnih stanica i selektivni odabir klonova koji nose pojedinačne kromosome somatskog partnera na pozadini ESC genoma.

Budući da je jedinstvena značajka citohibridnog genoma lokalizacija roditeljskih genoma u jednoj jezgri, prirodno se postavlja pitanje o očuvanju pluripotentnih svojstava embrionalnog genoma u hibridima ESC-somatskih stanica pod uvjetima njegovog bliskog kontakta s genomom diferencirane stanice. Morfološki, citohibridi ESC-a i somatskih stanica bili su slični roditeljskoj liniji ESC-a. Evaluacija pluripotentnosti pokazala je da su svi klonovi s gotovo diploidnim skupom kromosoma sposobni formirati embrioidna tijela u suspenzijskim kulturama, u kojima su prisutni derivati triju zametnih slojeva.

Većina hibridnih stanica sadržavala je antigen ECMA-7, marker karakterističan za rane mišje embrije, a imala je i visoku aktivnost alkalne fosfataze. Najuvjerljiviji podaci o visokim pluripotentnim svojstvima hibridnih stanica dobiveni su u eksperimentima dobivanja serije injekcijskih himera koje uključuju hibridne stanice HESS2 klona. Analiza biokemijskih markera pokazala je da su potomci donorskih hibridnih stanica prisutni u većini tkiva himera. Stoga hibridne stanice dobivene spajanjem ESC-a i somatski diferenciranih stanica zadržavaju pluripotentnost na visokoj razini, uključujući sposobnost stvaranja himera kada se ubrizgaju u šupljinu blastociste.

Klonovi HESS2 i HESS4 značajno su se razlikovali u sastavu roditeljskih kromosoma, ali su imali slična pluripotentna svojstva. Moglo bi se pretpostaviti da se pluripotentnost u hibridnom genomu manifestira kao dominantna osobina, ali moguće je da nisu svi kromosomi embrionalnog genoma uključeni u proces održavanja pluripotentnosti. Ako je ova pretpostavka točna, tada se može očekivati da eliminacija nekih kromosoma pluripotentnog partnera iz genoma hibridnih stanica neće biti popraćena promjenom njihovog pluripotentnog statusa. U ovom slučaju, analiza segregacije roditeljskih kromosoma u embrionalnim hibridnim stanicama omogućila bi nam da se približimo identifikaciji kromosoma odgovornih za kontrolu pluripotentnosti embrionalnih stanica.

O. Serov i sur. (2001.) nisu pronašli potomke među 50 potomaka dobivenih križanjem himera s normalnim miševima koji su imali mišji genotip 129/01a i nosili X kromosom DD miševa. Autori smatraju da je to zbog smanjenja pluripotentnosti u hibridnim stanicama pod utjecajem somatskog genoma. Alternativno objašnjenje može biti negativan učinak trisomije na neke autosome i neravnoteža spolnih kromosoma (XXY su uočeni u stanicama do 15. pasaže) u hibridnim stanicama tijekom mejoze. Poznato je da XXY stanice nisu sposobne proći mejozu i formirati gamete. Trisomija također može uzrokovati smanjenje proliferativne aktivnosti hibridnih stanica, zbog čega selektivna prednost u razvoju himera može pripasti stanicama embrija primatelja. Iz toga slijedi da je za adekvatnu procjenu pluripotentnog potencijala hibridnih stanica potrebno dobiti hibridne klonove s normalnim diploidnim skupom kromosoma.

U eksperimentima O. Serova i koautora (2001.) prvi put je demonstrirana mogućnost reprogramiranja X kromosoma somatske stanice u genomu hibridnih stanica. Ovaj zaključak autora proizlazi iz analize ekspresije gena hprt (marker X kromosoma) u himerama: prisutnost alelne varijante hprt DD/c miševa otkrivena je u svim analiziranim himernim tkivima. Prikladno je naglasiti da nakon unošenja hibridnih stanica u šupljinu blastociste, citohibridi spadaju u neselektivne uvjete, a očuvanje X kromosoma u genomu hibridnih stanica znači da je on postao njegova obligatna komponenta i genom ga ne razlikuje od Y kromosoma pluripotentnog partnera.

Sumirajući rezultate analize interakcije somatskih i pluripotentnih genoma u hibridnim embrionalnim stanicama, autori zaključuju da se kod nekih citohibrida pluripotentnost manifestira kao dominantna osobina. Hibridni genom sposoban je reprogramirati pojedinačne kromosome diferenciranih stanica, što, međutim, ne isključuje mogućnost obrnutog učinka somatskog genoma na pluripotentnost embrionalnog genoma. Prilikom uzgoja hibridnih stanica, indukcija diferencijacije događa se znatno češće nego u izvornoj roditeljskoj liniji ESC HM-1. Sličan učinak opažen je tijekom formiranja primarnih kolonija: mnoge primarne kolonije embrionalnih hibridnih stanica diferenciraju se u ranim fazama formiranja s velikim gubicima klonova tijekom njihove selekcije i reprodukcije.

Dakle, citohibridi nastali fuzijom ESC-a sa somatskim stanicama, unatoč bliskom kontaktu s genomom diferenciranih stanica, zadržavaju pluripotentnost kao jedinstveno svojstvo embrionalnog genoma. Štoviše, u takvim hibridnim stanicama moguće je reprogramiranje pojedinačnih kromosoma koji potječu iz diferenciranih stanica. Ostaje nejasno u kojoj mjeri su pluripotentna svojstva embrionalnog genoma zadržana u hibridnim stanicama, posebno njihova sposobnost sudjelovanja u formiranju zametne linije u himerama. To zahtijeva dobivanje embrionalnih hibridnih stanica s normalnim kariotipom. U svakom slučaju, pluripotentne embrionalne hibridne stanice mogu postati pravi genetski model za identifikaciju kromosoma uključenih u održavanje pluripotentnosti ili njezinu kontrolu, budući da bilateralna segregacija roditeljskih kromosoma potencijalno pruža takvu priliku.

Ništa manje atraktivno nije proučavanje fenomena koji O. Serov i suradnici (2001.) definiraju kao „kromosomsko pamćenje“. U hibridnom genomu, homologni kromosomi nalaze se u dvije alternativne konfiguracije: homolozi somatskog partnera već su prošli diferencijaciju, dok kod homologa pluripotentnog partnera taj proces tek počinje. Posljedično, očuvanje visokih pluripotentnih svojstava hibridnih stanica ukazuje na to da je „pluripotentna“ konfiguracija ESC homologa dovoljno stabilna u hibridnom genomu, unatoč utjecaju transaktivnih čimbenika koji proizlaze iz somatskog partnera. Gore opisani znakovi reprogramiranja homolognih kromosoma diferenciranog genoma tijekom razvoja himera ne isključuju mogućnost da u prvim fazama formiranja i uzgoja citohibrida in vitro zadržavaju svoj status stečen tijekom diferencijacije in vivo. Prema nedavno dobivenim podacima, kada se embrionalne hibridne stanice prenesu u neselektivno okruženje, pokazuju intenzivnu eliminaciju kromosoma samo somatskog partnera, tj. genom hibridnih stanica lako diskriminira homologe nakon uzgoja in vitro tijekom 10-15 pasaža. Dakle, embrionalne hibridne stanice predstavljaju obećavajući eksperimentalni model za proučavanje ne samo temeljnog svojstva embrionalnog genoma kao što je pluripotentnost, već i njegove alternative - embrionalne diferencijacije.

Terapijska učinkovitost transplantacije embrionalnih matičnih stanica

Prije analize terapijske učinkovitosti transplantacije embriogeneze matičnih stanica (EMS) i njihovih derivata, sažimamo gore navedeni materijal. Mogućnosti ESC-a u smislu pune provedbe embriogeneze in vitro su nedovoljne, budući da su razvojni defekti u ovom slučaju posljedica odsutnosti mezenhimalnih matičnih stanica, koje nastaju u tijelu autonomno i neovisno o ESC-ima. Genetski potencijal ESC-a je manji od genetskog potencijala zigote, stoga se ESC-i ne koriste izravno za kloniranje embrija. Jedinstveni biološki potencijal ESC-a kao jedinih stanica u kojima su razvojni programi u potpunosti raspoređeni u dosljednoj provedbi koristi se u studijama genske funkcije. Uz pomoć ESC-a dekodiraju se prve kombinacije signala koji aktiviraju ekspresiju ranih i kasnih gena koji kodiraju razvoj triju zametnih slojeva. Očuvanje pluripotentnosti genoma ESC-a in vitro čini ih jedinstvenim alatom za reparativnu regeneraciju, sposobnim automatski nadoknaditi stanične gubitke u slučaju oštećenja organa i tkiva. U idealnom hipotetskom scenariju, može se pretpostaviti da „... prilikom transplantacije donorskih ESC-a, kompaktno zbijeni programi se prenose u tijelo primatelja, koji se, pod povoljnim uvjetima, ostvaruju u izgradnji novog tkiva'7, sposobnog „... da se učinkovito integrira u tijelo primatelja i na morfološkoj i na funkcionalnoj razini.“

Naravno, nakon razvoja metoda za monodiferencijaciju ESC-a, započela su in vivo istraživanja funkcionalne aktivnosti stanica dobivenih in vitro iz jednog specijaliziranog klona. Proliferirajući ESC klon generira populacije migrirajućih progenitorskih stanica koje su zaista sposobne aktivno se integrirati u područja oštećenja tkiva primatelja, što se koristi u regenerativno-plastičnoj medicini. Utvrđeno je da transplantacija DOPA neurona u substantia nigra smanjuje kliničke manifestacije kod eksperimentalnog hemiparkinsonizma. Regionalne transplantacije donorskih živčanih matičnih stanica smanjuju stupanj motoričkih poremećaja uzrokovanih traumom ili kontuzijom leđne moždine i mozga. Također su dobiveni prvi pozitivni rezultati transplantacije matičnih stanica kod demijelinizirajućih bolesti. Čini se da regenerativno-plastični potencijal ESC-a otvara neograničene mogućnosti za korištenje transplantacije stanica u praktičnoj medicini. Međutim, kada se transplantiraju u ektopične zone, ESC-i neizbježno se transformiraju u tumore. Teratomi nastaju kada se ESC-i potkožno injektiraju imunodeficijentnim miševima. Kada se suspenzije ESC transplantiraju ispod kapsule testisa kod singenetskih miševa, također se formiraju teratomi, koji se sastoje od različitih tkiva, čije su stanice derivati sva tri zametna sloja. U takvim teratomima procesi smanjene organogeneze izuzetno su rijetki.

Brojne studije pružaju informacije o pozitivnim rezultatima transplantacije ranih ESC derivata životinjama s eksperimentalnom patologijom. Stanična neurotransplantacija korištenjem ESC derivata dalje se razvija u eksperimentima i prvim kliničkim ispitivanjima za ispravljanje funkcionalnih poremećaja kod ozljeda mozga i kralježnice te za liječenje siringomijelije i multiple skleroze (Repin, 2001.). Pojavom tehnike in vitro neurogeneze iz ESC-a, umjesto korištenja embrionalnog moždanog tkiva, razvijaju se metode za transplantaciju derivata neurosfere dobivenih iz kultura embrionalnog živčanog tkiva. Takve transplantacijske suspenzije su znatno homogenije i sadrže predane prekursore neurona i neuroglije.

Redovitim dodavanjem retinoične kiseline u dozi od 10 μg/ml u medij za uzgoj tijekom 6 tjedana, u liniji humanog embrio-(terato)-karcinoma NTERA-2 formira se više od 80% postmitotskih neurona. Potpuna homogenost neuronske populacije postiže se protočnim sortiranjem zrelih neurona označenih imunofenotipskim markerima, što omogućuje uklanjanje ostataka teratokarcinoma i nezrelih stanica. Nakon transplantacije u različite regije mozga eksperimentalnih životinja, takvi neuroni ne samo da preživljavaju, već se i integriraju u regionalne neuronske mreže. Kod životinja s eksperimentalnim modelima lokalnih defekata CNS-a, neurotransplantacija smanjuje kliničke manifestacije ljudskih patologija kao što su posljedice traumatske ozljede mozga, moždani udar, demijelinizirajuće bolesti, nasljedni defekti u razvoju malog mozga, bolesti taloženja lipida i polisaharida.

Kako bi se optimizirali procesi regeneracije kod degenerativnih bolesti središnjeg živčanog sustava, razvijaju se tehnologije za dobivanje oligodendrocita koji proizvode mijelin iz embrionalnih stanica (ESC). Prva faza tradicionalno uključuje proliferaciju ESC s reprodukcijom broja stanica potrebnih za transplantaciju. U drugoj fazi provodi se ciljana diferencijacija stanica u populaciju prekursora oligodendrocita koji proizvode mijelin, što je kontrolirano selektivnim marker antigenima.

Otvaraju se određeni izgledi za korištenje ESC derivata za razvoj metoda za ispravljanje imunodeficijencija uzrokovanih genetskim defektima u sazrijevanju timusa. U studijama na knockout (rag 1) miševima s induciranim genskim defektom - poremećajem mehanizma rekombinacije V(D)J lokusa TCR gena, što dovodi do gubitka funkcije T-limfocita, transplantacija ranih ESC derivata u timus životinja vraća sazrijevanje normalnih populacija imunoloških klonova odgovornih za stanični imunitet. Klinička ispitivanja transplantacije in vitro preformiranih ESC za liječenje fatalnih nasljednih anemija u djece su u tijeku.

Prigovori na brzo uvođenje transplantacije matičnih stanica u kliniku temelje se na ograničenom broju stabilnih linija ljudskih embrionalnih matičnih stanica i potrebi za njihovom standardizacijom. Kako bi se povećala čistoća standardiziranih ESC linija, kao i odraslih ljudskih matičnih stanica, predlaže se korištenje metode selekcije linija temeljene na molekularno-genetskoj analizi kratkih tandemskih ponavljanja DNA. Također je potrebno testirati ESC linije na prisutnost malih kromosomskih preuređenja i genetskih mutacija, čiji je potencijal za pojavu u uvjetima stanične kulture prilično visok. Iznosi se teza o obveznom testiranju svojstava svih vrsta ESC i regionalnih pluripotentnih matičnih stanica, budući da njihova reprodukcija in vitro može dovesti do pojave novih karakteristika koje nisu svojstvene embrionalnim matičnim stanicama ili definitivnim tkivima. Posebno se pretpostavlja da dugotrajni uzgoj u medijima s citokinima približava ESC linije tumorskim stanicama, budući da prolaze kroz slične promjene u putovima regulacije staničnog ciklusa stjecanjem sposobnosti provođenja neograničenog broja staničnih dioba. Neki autori, na temelju potencijala za razvoj tumora, smatraju transplantaciju ranih derivata embrionalnih matičnih stanica u ljude nepromišljenom. Po njihovom mišljenju, puno je sigurnije koristiti predane potomke ESC-a, tj. linije diferenciranih staničnih progenitora. Međutim, trenutno još nije razvijena pouzdana tehnika za dobivanje stabilnih ljudskih staničnih linija koje se diferenciraju u željenom smjeru.

Stoga se u literaturi pojavljuje sve više podataka o pozitivnom terapijskom učinku transplantacije derivata ljudskih embrionalnih matičnih stanica. Međutim, mnoge od tih studija se pregledavaju i kritiziraju. Neki istraživači smatraju da su rezultati ranih kliničkih ispitivanja preliminarne prirode i samo ukazuju na to da su matične stanice sposobne povoljno utjecati na klinički tijek određene bolesti. Stoga je potrebno dobiti podatke o udaljenim rezultatima transplantacije stanica. Kao argument navode se faze razvoja kliničke neurotransplantologije. Doista, u početku su u literaturi prevladavale publikacije o visokoj učinkovitosti transplantacije embrionalnih fragmenata mozga kod Parkinsonove bolesti, ali su se potom počela pojavljivati izvješća koja negiraju terapijsku učinkovitost embrionalnog ili fetalnog živčanog tkiva transplantiranog u mozak pacijenata.

Prva klinička ispitivanja provedena su kako bi se procijenila sigurnost transplantacije neuroblasta dobivenih iz ESC-a teratokarcinoma NTERA-2, čije su nezrele stanice podvrgnute proliferaciji u kulturi do akumulacije od 100 milijuna stanične mase. Neke od stanica dobivenih na ovaj način korištene su za karakterizaciju fenotipa i određivanje staničnih nečistoća, kao i za testiranje moguće kontaminacije virusima i bakterijama. LIF i hranidbeni sloj fetalnih stromalnih stanica uklonjeni su iz podloge za uzgoj, te su stvoreni uvjeti za ciljanu diferencijaciju ESC-a u neuroblaste korištenjem kombinacije citokina i faktora rasta. Zatim su neuroblasti pročišćeni iz nezrelih stanica teratokarcinoma na protočnom sorteru stanica. Nakon sekundarnog pročišćavanja i karakterizacije fenotipa transplantiranih stanica, suspenzija neuroblasta (10-12 milijuna) ubrizgana je u bazalnu jezgru mozga pacijenata (u sedmom mjesecu nakon hemoragijskog moždanog udara) pomoću posebne mikrokanile i štrcaljke pod stereotaksičnom i kompjuteriziranom tomografskom kontrolom. Jednogodišnji probir posljedica transplantacije neurona u zonu moždanog udara nakon transplantacije nije otkrio nikakve nuspojave ili neželjene učinke. Polovica pacijenata pokazala je poboljšanje motoričke funkcije u razdoblju od 6 do 12 mjeseci nakon transplantacije. Pozitivne kliničke promjene pratila je povećana opskrba krvlju zone moždanog udara nakon transplantacije stanica: prosječno povećanje apsorpcije fluorescentno obilježene 2-deoksiglukoze, prema pozitronskoj emisijskoj tomografiji, doseglo je 18%, a kod nekih pacijenata - 35%.

Međutim, američki Nacionalni institut za zdravlje proveo je neovisnu studiju o kliničkoj učinkovitosti neurotransplantacije kod pacijenata s Parkinsonovom bolešću. Pacijentima u prvoj skupini transplantirani su dijelovi embrionalnog živčanog tkiva koji proizvode dopamin, dok je druga skupina pacijenata podvrgnuta lažnoj operaciji. Rezultati ukazuju na nultu kliničku učinkovitost takve neurotransplantacije, unatoč činjenici da su embrionalni neuroni koji proizvode dopamin preživjeli u mozgu primatelja. Štoviše, 2 godine nakon transplantacije embrionalnog živčanog tkiva, 15% pacijenata razvilo je perzistentnu diskineziju, koja je bila odsutna kod pacijenata u placebo skupini (Matične stanice: znanstveni napredak i budući istraživački smjerovi. Nacionalni institut za zdravlje. SAD). Promatranja daljnjeg razvoja bolesti kod ovih pacijenata su u tijeku.

Neki autori povezuju kontradiktorne podatke iz literature o procjeni kliničke učinkovitosti neurotransplantacije s različitim pristupima odabiru skupina pacijenata, neadekvatnim izborom metoda za objektivnu procjenu njihovog stanja i, što je najvažnije, različitim razdobljima razvoja embrionalnog živčanog tkiva i različitim područjima mozga iz kojih je to tkivo dobiveno, različitim veličinama transplantata i metodološkim značajkama kirurške intervencije.

Treba napomenuti da su pokušaji izravne transplantacije pluripotentnih embrionalnih matičnih stanica u striatumsku regiju mozga štakora s eksperimentalnim hemiparkinsonizmom bili popraćeni proliferacijom ESC-a i njihovom diferencijacijom u dopaminergičke neurone. Treba pretpostaviti da su novonastali neuroni učinkovito integrirani u neuronske mreže, budući da je nakon transplantacije ESC-a uočena korekcija anomalija u ponašanju i motoričke asimetrije u testu s apomorfinom. Istodobno, neke su životinje uginule zbog transformacije transplantiranih ESC-a u tumore mozga.

Stručnjaci iz Nacionalne i Medicinske akademije SAD-a, specijalisti Nacionalnog instituta za zdravlje SAD-a smatraju da klinički potencijal ESC-a zaslužuje najozbiljniju pozornost, ali inzistiraju na potrebi detaljnog proučavanja njihovih svojstava, vjerojatnosti komplikacija i dugoročnih posljedica u eksperimentima na adekvatnim biološkim modelima ljudskih bolesti (Matične stanice i buduća regenerativna medicina National Academy Press.; Matične stanice i budući istraživački pravci. Nat. Inst, of Health USA).

S ovog gledišta, važno je da je komparativna histološka analiza eksperimentalnih teratoma dobivenih transplantacijom suspenzije ESC-a u testis s teratomima nastalim kao rezultat transplantacije ranog embrija, koji također sadrži ESC, pokazala da ESC, bez obzira na njihov izvor podrijetla ili interakciju s određenim okolnim stanicama, ostvaruju svoj tumorigeni potencijal na isti način. Dokazano je da takvi teratomi imaju klonsko podrijetlo, budući da tumori koji se sastoje od derivata sva tri zametna sloja mogu nastati iz jednog ESC-a (Rega, 2001). Vrijedno je napomenuti da su, kada su klonirani ESC-i s normalnim kariotipom transplantirani u imunodeficijentne miševe, također nastali teratomi koji se sastoje od različitih tipova diferenciranih somatskih stanica. Ovi eksperimentalni podaci besprijekoran su dokaz klonskog podrijetla teratoma. S gledišta razvojne biologije, oni ukazuju na to da ne višestruke predane progenitorske stanice, već jedna pluripotentna matična stanica djeluje kao izvor diferenciranih derivata sva tri zametna sloja koji čine teratom. Međutim, na putu prema praktičnoj transplantaciji stanica, rezultati ovih studija su, ako ne i prepreka, onda znak upozorenja na potencijalnu opasnost, budući da inokulacija ESC-a ili primordijalnih zametnih stanica u različita tkiva odraslih imunodeficijentnih miševa neizbježno uzrokuje razvoj tumora iz transplantiranih matičnih stanica. Neoplastična degeneracija ektopijski transplantiranih ESC-a popraćena je pojavom satelitskih populacija diferenciranih stanica - zbog djelomične diferencijacije ESC-a i progenitorskih klonova u specijalizirane linije. Zanimljivo je da se, kada se ESC-i transplantiraju u skeletne mišiće, neuroni najčešće formiraju pored stanica teratokarcinoma. Međutim, uvođenje ESC-a u jajnu stanicu koja se dijele ili blastocistu popraćeno je potpunom integracijom stanica u embrij bez stvaranja neoplastičnih elemenata. U ovom slučaju, ESC-i se integriraju u gotovo sve organe i tkiva embrija, uključujući genitalni primordij. Takve alofenske životinje prvi put su dobivene uvođenjem stanica teratokarcinoma 129 u rane embrije u stadiju 8-100 stanica. U alofenskim miševima, populacije heterogenih stanica dobivenih iz donorskih ESC integrirane su u tkiva koštane srži, crijeva, kože, jetre i genitalija, što omogućuje stvaranje čak i međuvrsnih staničnih himera u eksperimentu. Što je kraće razdoblje razvoja ranog embrija, to je veći postotak stanične kimerizacije, s najvećim stupnjem kimerizacije uočenim u hematopoetskom sustavu, koži, živčanom sustavu, jetri i tankom crijevu alofenskog embrija. U odraslom organizmu, tkiva zaštićena od imunološkog sustava primatelja histohematskim barijerama podložna su kimerizaciji:Transplantacija primarnih zametnih stanica u parenhim testisa popraćena je ugradnjom donorskih matičnih stanica u sloj zametnog tkiva primatelja. Međutim, prilikom transplantacije ESC-a u blastocistu, ne dolazi do stvaranja himernih rudimenta spolnih organa s generiranjem donorskih primarnih zametnih stanica. Pluripotentnost ESC-a, kada se stvore posebni uvjeti, može se koristiti i za kloniranje: presađivanje mišjih ESC-a u mišji embrij od 8-16 stanica, u kojem su stanične mitoze blokirane citokalsinom, potiče provedbu normalne embriogeneze s razvojem embrija iz donorskih ESC-a.

Stoga je alternativa alogenoj transplantaciji ESC-a terapijsko kloniranje temeljeno na transplantaciji jezgri somatskih stanica u enukleiranu jajnu stanicu kako bi se stvorila blastocista, iz čije unutarnje stanične mase se zatim izoliraju linije ESC-a genetski identičnih donoru somatske jezgre. Tehnički, ova ideja je sasvim izvediva, budući da je mogućnost stvaranja linija ESC-a iz blastocista dobivenih nakon transplantacije somatskih jezgri u enukleirane jajne stanice više puta dokazana u pokusima na laboratorijskim životinjama (Nagy, 1990.; Munsie, 2000.). Konkretno, kod miševa homozigotnih za mutaciju gena rag2, fibroblasti dobiveni uzgojem stanica subepidermalnog tkiva korišteni su kao donori jezgri, koje su transplantirane u enukleirane oocite. Nakon aktivacije oocita, „zigota“ je uzgajana do stvaranja blastociste, iz čije unutarnje stanične mase su izolirane ESC-e i prenesene u liniju stanica nulizignih za mutirani gen (rag2~/~). Mutacija jednog alelnog gena ispravljena je u takvim ESC-ima metodom homologne rekombinacije. U prvoj seriji eksperimenata, embrioidna tijela dobivena su iz ESC-a s rekombinantnim obnovljenim genom, njihove stanice su transficirane rekombinantnim retrovirusom (HoxB4i/GFP) i, nakon reprodukcije, injektirane su u venu miševa rag2~/~. U drugoj seriji, tetraploidni blastomeri agregirani su s genetski modificiranim ESC-ima i transplantirani u ženke primateljice. Dobiveni imunokompetentni miševi poslužili su kao donori koštane srži za transplantaciju u miševe mutante rag2~/~. U obje serije rezultat je bio pozitivan: nakon 3-4 tjedna u svim miševima pronađene su zrele normalne mijeloidne i limfoidne stanice sposobne za proizvodnju imunoglobulina. Dakle, transplantacija jezgri somatskih stanica u oocite može se koristiti ne samo za dobivanje ESC linija, već i za citogenoterapiju - korekciju nasljednih anomalija, koristeći ESC kao vektor za transport korektivnih genetskih informacija. Ali ovaj smjer transplantacije stanica, osim bioetičkih problema, ima svoja ograničenja. Nije jasno koliko će sigurna biti transplantacija terapijski kloniranih stanica s genotipom identičnim genotipu određenog pacijenta, budući da takve stanice mogu uvesti mutacije koje stvaraju predispoziciju za druge bolesti. Normalne ljudske jajne stanice ostaju teško dostupan objekt, dok se čak i transplantacijom somatskih jezgri u enukleirana životinjska jajna stanica samo 15-25% konstruiranih "zigota" razvija do stadija blastociste. Još nije utvrđeno koliko je blastocista potrebno za dobivanje jedne linije pluripotentnih kloniranih ESC-a. Također vrijedi napomenuti visoku razinu financijskih troškova povezanih sa složenošću metodologije terapijskog kloniranja.

Zaključno, treba napomenuti da se kod ESC-a pluripotentnost genoma s hipometiliranom DNA kombinira s visokom aktivnošću telomeraze i kratkom C^ fazom staničnog ciklusa, što osigurava njihovu intenzivnu i potencijalno beskonačnu reprodukciju, tijekom koje ESC-i zadržavaju diploidni skup kromosoma i „juvenilni“ skup fenotipskih karakteristika. Klonalni rast ESC-a u kulturi ne ometa njihovu diferencijaciju u bilo koju specijaliziranu staničnu liniju organizma kada se proliferacija zaustavi i dodaju odgovarajući regulatorni signali. Restrikcijska diferencijacija ESC-a u somatske stanične linije in vitro ostvaruje se bez sudjelovanja mezenhima, zaobilazeći Nochtey, izvan organogeneze i bez stvaranja embrija. Ektopično uvođenje ESC-a in vivo neizbježno dovodi do stvaranja teratokarcinoma. Transplantacija ESC-a u blastocistu ili rani embrij popraćena je njihovom integracijom s embrionalnim tkivima i stabilnom kimerizacijom njegovih organa.

Regenerativno-plastične tehnologije temeljene na transplantaciji stanica točka su presjeka interesa predstavnika stanične biologije, razvojne biologije, eksperimentalne genetike, imunologije, neurologije, kardiologije, hematologije i mnogih drugih grana eksperimentalne i praktične medicine. Najvažniji rezultati eksperimentalnih studija dokazuju mogućnost reprogramiranja matičnih stanica s ciljanom promjenom njihovih svojstava, što otvara perspektive za kontrolu procesa citodiferencijacije korištenjem faktora rasta - za regeneraciju miokarda, obnovu lezija CNS-a i normalizaciju funkcije otočnog aparata gušterače. Međutim, za široko uvođenje transplantacije derivata ESC-a u praktičnu medicinu potrebno je detaljnije proučiti svojstva ljudskih matičnih stanica i nastaviti eksperimente s ESC-ima na eksperimentalnim modelima bolesti.

Bioetička pitanja i problem odbacivanja alogene transplantacije stanica mogli bi se riješiti otkrivenom plastičnošću genoma regionalnih matičnih stanica odraslog organizma. Međutim, početna informacija da se prilikom transplantacije izoliranih i pažljivo karakteriziranih hematopoetskih autolognih stanica u jetru, iz kojih nastaju novi hepatociti, integrirajući se u režnjeve jetre, sada revidira i kritizira. Ipak, objavljeni su podaci da transplantacija živčanih matičnih stanica u timus uzrokuje stvaranje novih donorskih T- i B-limfocitnih klica, a transplantacija moždanih živčanih matičnih stanica u koštanu srž dovodi do stvaranja hematopoetskih klica s dugoročnom donorskom mijelo- i eritropoezom. Posljedično, pluripotentne matične stanice sposobne reprogramirati genom u potencijal ESC-a mogu perzistirati u organima odraslog organizma.

Izvor dobivanja matičnih stanica (EMS) u medicinske svrhe ostaje ljudski embrij, što predodređuje neizbježnost novog presjeka moralnih, etičkih, pravnih i religijskih pitanja u točki nastanka ljudskog života. Otkriće ESC dalo je snažan poticaj nastavku teških rasprava o tome gdje je granica između živih stanica i materije, bića i osobnosti. Istovremeno, ne postoje univerzalne norme, pravila i zakoni u vezi s korištenjem ESC u medicini, unatoč ponovljenim pokušajima njihovog stvaranja i usvajanja. Svaka država, u okviru svog zakonodavstva, samostalno rješava ovaj problem. Sa svoje strane, liječnici diljem svijeta i dalje pokušavaju regenerativno-plastičnu medicinu izvući izvan okvira takvih rasprava, prvenstveno korištenjem rezervi odraslih matičnih stanica, a ne embrionalnih matičnih stanica.

Malo povijesti izolacije embrionalnih matičnih stanica

Stanice terato(embrio)karcinoma izolirane su iz spontano nastalih teratoma testisa miševa 129/ter-Sv, spontanih teratoma jajnika miševa Lt/Sv i iz teratoma dobivenih iz ektopično transplantiranih embrionalnih stanica ili tkiva. Među stabilnim staničnim linijama mišjeg terato(embrio)karcinoma dobivenim na ovaj način, neke su bile pluripotentne, druge su se diferencirale samo u jedan specifični tip stanica, a neke su bile potpuno nesposobne za citodiferencijaciju.

U jednom trenutku fokus je bio na studijama čiji su rezultati ukazivali na mogućnost vraćanja stanica terato-(embrio)-karcinoma u normalan fenotip nakon njihovog unošenja u tkiva embrija u razvoju, kao i rad na in vitro stvaranju genetski modificiranih stanica terato-(embrio)-karcinoma, uz pomoć kojih su dobiveni mutirani miševi za biološko modeliranje ljudske nasljedne patologije.

Za izolaciju staničnih linija terato-(embrio)-karcinoma korištena je uvjetovana suspenzijska kultivacija. U kulturi, stanice terato-(embrio)-karcinoma, poput ESC-a, rastu i formiraju embrioidna tijela te zahtijevaju obveznu disocijaciju za prijenos linije, održavajući pluripotentnost na hranjivom sloju embrionalnih fibroblasta ili tijekom suspenzijske kultivacije u uvjetovanom mediju. Stanice pluripotentnih linija terato-(embrio)-karcinoma su velike, sferne, karakterizirane visokom aktivnošću alkalne fosfataze, tvore agregate i sposobne su za višesmjernu diferencijaciju. Kada se unesu u blastocistu, agregiraju se s morulom, što dovodi do stvaranja himernih embrija, u čijim se sastavu različitih organa i tkiva nalaze derivati stanica terato-(embrio)-karcinoma. Međutim, velika većina takvih himernih embrija umire in utero, a u organima preživjelih novorođenih himera, strane stanice se rijetko otkrivaju i niske su gustoće. Istodobno, učestalost tumora (fibrosarkom, rabdomiosarkom, druge vrste malignih tumora i adenom gušterače) naglo se povećava, a degeneracija tumora često se javlja tijekom razdoblja intrauterinog razvoja himernih embrija.

Većina stanica terato-(embrio)-karcinoma u mikrookruženju normalnih embrionalnih stanica gotovo prirodno poprima maligne neoplastične karakteristike. Smatra se da je ireverzibilna malignost posljedica aktivacije proto-onkogena u procesu strukturnih preuređenja. Jedna od iznimki su stanice linije embriokarcinoma SST3, dobivene iz mišjih testikularnih teratoma (linija 129/Sv-ter), koje pokazuju visoku sposobnost integracije u tkiva i organe embrija bez naknadnog stvaranja tumora u himernih miševa. Derivati staničnih linija terato-(embrio)-karcinoma u himernim miševima praktički ne sudjeluju u stvaranju primarnih gonocita. Očito je to zbog visoke učestalosti kromosomskih aberacija karakterističnih za većinu linija terato-(embrio)-karcinoma, u čijim se stanicama opažaju i aneuploidija i kromosomske abnormalnosti.

U laboratorijskim uvjetima dobiveno je nekoliko stabilnih linija stanica ljudskog terato-(embrio)-karcinoma karakteriziranih pluripotencijom, visokom proliferativnom aktivnošću i sposobnošću diferencijacije tijekom rasta u kulturama. Posebno je linija stanica ljudskog terato-(embrio)-karcinoma NTERA-2 korištena za proučavanje mehanizama neuronske citodiferencijacije. Nakon transplantacije stanica ove linije u subventrikularnu regiju prednjeg mozga novorođenih štakora, uočena je njihova migracija i neurogeneza. Čak su učinjeni pokušaji transplantacije neurona dobivenih uzgojem stanica linije terato-(embrio)-karcinoma NTERA-2 pacijentima s moždanim udarom, što je, prema autorima, dovelo do poboljšanja kliničkog tijeka bolesti. Istodobno, nije bilo slučajeva malignosti transplantiranih stanica linije terato-(embrio)-karcinoma NTERA-2 kod pacijenata s moždanim udarom.

Prve linije nediferenciranih pluripotentnih mišjih embrionalnih matičnih stanica dobivene su početkom 1980-ih od strane Evansa i Martina, koji su ih izolirali iz unutarnje stanične mase blastociste - embrioblasta. Izolirane ESC linije dugo su zadržavale pluripotentnost i sposobnost diferencijacije u različite tipove stanica pod utjecajem čimbenika u posebnom mediju za uzgoj.

Sam termin „embrionalna pluripotentna matična stanica“ pripada Leroyu Stevensu, koji je, proučavajući učinak duhanskog katrana na učestalost razvoja tumora, skrenuo pozornost na spontanu pojavu teratokarcinoma testisa u linearnih (129/v) miševa kontrolne skupine. Stanice teratokarcinoma testisa karakterizirala je visoka stopa proliferacije, a u prisutnosti tekućine iz trbušne šupljine spontano su se diferencirale stvaranjem neurona, keratinocita, hondrocita, kardiomiocita, kao i fragmenata kose i kostiju, ali bez ikakvih znakova uređene citoarhitekture odgovarajućeg tkiva. Kada su stavljene u kulturu, stanice teratokarcinoma rasle su kao pluripotentni klonovi neovisni o supstratu i formirali embrioidna tijela, nakon čega su prestale s dijeljenjem i podvrgnule se spontanoj poremećenoj diferencijaciji u neurone, gliju, mišićne stanice i kardiomiocite. Stevens je otkrio da mišji teratokarcinom 129/v sadrži manje od 1% stanica sposobnih za diferencijaciju u razne specijalizirane somatske linije, a sama diferencijacija ovisi o čimbenicima koji na njih utječu (sastav peritonealne tekućine, produkti zrelih stanica ili tkiva dodanih u kulturu). Potvrđena je hipoteza Leroya Stevensona o prisutnosti embrionalnih progenitorskih stanica zametne linije među stanicama teratokarcinoma: suspenzija embrioblastnih stanica iz preimplantacijskih embrija u tkivima odraslih miševa formirala je teratokarcinome, a čiste stanične linije izolirane iz njih nakon intraperitonealne primjene životinjama primateljima diferencirale su se u neurone, kardiomiocite i druge somatske stanice izvedene iz sva tri zametna sloja. U in vivo eksperimentima, transplantacija ESC-a (dobivenih iz embrioblasta, ali ne i trofoblasta) u mišje embrije druge linije u stadijima blastomera 8-32 rezultirala je rođenjem himernih životinja (bez razvoja tumora), u čijim su organima pronađeni klice donorskog tkiva. Himerizam je uočen čak i u zametnoj staničnoj liniji.

Primarne progenitorske zametne stanice izolirane iz genitalnog rudimenta mišjeg embrija odgovarale su morfologijom, imunološkim fenotipom i funkcionalnim karakteristikama ESC-ima koje je Stevenson dobio iz teratokarcinoma i embrioblasta. Kod himera rođenih nakon što su ESC-i uneseni u blastocistu, alofenska morfogeneza organa bila je karakterizirana mozaičnim izmjenom strukturnih i funkcionalnih jedinica donora i primatelja - jetre, pluća i bubrega. U nekim slučajevima uočeno je stvaranje crijevnih kripti ili režnjeva jetre koji se sastoje i od stanica primatelja i od stanica donora. Međutim, morfogeneza se uvijek ostvarivala prema genetskom programu vrste kojoj je primatelj pripadao, a himerizam je bio ograničen isključivo na staničnu razinu.

Tada je utvrđeno da se proliferacija ESC-a bez citodiferencijacije na hranjivom sloju stanica izvedenih iz mezenhima (fetalni fibroblasti) događa uz obveznu prisutnost LIF-a u selektivnim hranjivim medijima, koji selektivno osiguravaju preživljavanje samo matičnih i progenitorskih stanica, dok velika većina specijaliziranih staničnih elemenata umire. Koristeći takve metode, James Thomson je 1998. godine izolirao pet imortaliziranih linija embrionalnih matičnih stanica iz unutarnje stanične mase ljudske blastociste. Iste godine, John Gerhart razvio je metodu za izolaciju besmrtnih linija ESC-a iz genitalnog tuberkula ljudskih embrija starih četiri do pet tjedana. Zbog svojih jedinstvenih svojstava, samo dvije godine kasnije, embrionalne matične stanice i matične stanice definitivnih tkiva počele su se koristiti u praksi regenerativne medicine i genske terapije.