Embrionalne matične stanice

Otkriće embrionalnih matičnih stanica - nije bilo slučajno, a pojavio se na pripremljenu istraživanja tla u području razvojne biologije istraživanja. Pojam „matičnih stanica” je uveden u medicini 1908. Na društva za hematologiju kongresu u Berlinu, Aleksandar Maximov primijeniti na hematopoetskih stanica. Davno prije izolacija i priprema stabilne linije pluripotentnih matičnih stanica embrija u ranom razvoju procesa istraživanja koristi matična terato- (stanice embrij karcinoma kojom proučavali nepoznatih mehanizama embriogeneze, uključujući sekvence ekspresije ranih gena i proteinskih produkata njihovog rada.

No, je li totipotencija ljudskog genoma nepopravljivo izgubljena u procesu evolucije? Ne, a embriogeneza je dokaz. Ako je tako, onda kada će, u načelu, biti realiziran drugi put evolucijskog razvoja? Vjerojatno, kad osoba napusti Cosmos, gdje će uvjeti okoliša biti dosta dugo vremena relativno konstantni. Gubitak kosti (kosti demineralizacija u bestežinskom stanju) vrlo polako podvrgnuti pregradnja i obnova može se smatrati kao prvi korak u ljudskoj proces prilagodbe kao vrsta postojanja u prostoru. Međutim, plaćanje za drugi put evolucijskog razvoja bit će drugačije - sterilnost će biti cijena koja će se vratiti na sve stanice totipotentnosti i apsolutne plastičnosti. Tako se razmnožiti u ovom svijetu "evolucijskih kameleona" neće imati meiosis, otpochkovaniem. Ali dugo ćemo živjeti. Besmrtnost telomeraze je besmrtnost amebe. U višestaničnom organizmu matične stanice su supstrat kvantitativne i kvalitativne dugovječnosti.

[1], [2], [3], [4]

Izvori embrionalnih matičnih stanica

Izvori danas embrionalnih matičnih stanica za laboratorijske testove su linija mišjeg teratokarcinom (129 / SV, F19, F8, Zin 40, CGR 86, R, CCE, JM-1 E14TG2a, CGRSb) i humani teratokarcinom (NTERA-2, TERA-2 H-9 klon) i Hess Trauneona. Međutim, prisutnost detaljno mobilne putovnicu pokazuje imunološki fenotip, rezultati kromosom analizu mRNA profila izloženih receptori i proteina unutarstanični signalni ne nadoknaditi značajnih nedostataka teratokartsinomnyh linije ESC - brzi gubitak totipotency i nemogućnosti primjene u kliničkim ispitivanjima, a mješoviti diferencijacije u kulturi je vrlo teško izolirati čisto namjenski vod iz heterogene populacije stanica. Stoga, obično izvor ESC linija proizvedena u kliničke svrhe, služi kao unutarnji stanične mase od blastociste, zametaka pojedinačni blastomeri od 8 stanica fazi razvoja stanice morula kasniji i primarni izvor klica.

Valja napomenuti da stanice teratokarcinoma, iako imaju svojstvo pluripotentnosti, imaju znatno niži pluripotentni potencijal u usporedbi s ESC. Njihova integracija s embrionalnim stanicama rijetko dovodi do formiranja himera, u kojima se, osim toga, gamete s genotipom stanica teratokarcinoma nikada ne formiraju. Vjeruje se da je to zbog čestog pojavljivanja kromosomskih abnormalnosti u kultiviranju teratokarcinskih stanica: gubitkom Y kromosoma, raznih trisomija, delecija ili translokacija.

Pokušaji razlikovanja ljudske ESC linije poduzeti su mnogo puta, ali ovaj zadatak nije mogao biti riješen jer je normalno ljudsko blastociste teško pristupiti objektima. Osim toga, kod ljudi, učestalost kromosomskih abnormalnosti je veća nego kod embriogeneze životinja. Pretežno većina ranih ljudskih embrija dobivenih nakon in vitro oplodnje pokazuju kaotični kromosomski mozaikizam i često postoje numeričke i strukturne aberacije. Čak i kasnije, na blastocističkom stadiju, samo 20-25% ljudskih zametaka sastoji se od stanica s normalnim kariotipom. Bilo je gotovo nemoguće koristiti takve embrije kako bi stvorili ESC, budući da su zigosi obično uzgojeni u stadiju dva ili četiri blastomera, a potom presadili u maternicu. Tek relativno nedavno bila je pouzdana tehnika razvijena za uzgoj oplođenih ljudskih ovula na blastocističku pozornicu. Uvođenje ove tehnike u praksu in vitro oplodnje nije samo povećalo učestalost uspješnog ishoda implantacije već je učinilo normalnim blastocistima pristupačniji objekt.

Drugi pluripotentne izvor matičnih stanica primarne spolne stanice, koja, za razliku od naprednijih ishodišne populacije germenativnogo epitel, nisu na površini beta-integrin, ali izražavaju visoku aktivnost shelochnoy fosfataza. Treba napomenuti da je u eksperimentu populacije matične stanice koje nastaju iskonskim zametnih stanica su proučavali s 80-tih godina prošlog stoljeća. Istodobno je razvijena tehnika za izolaciju primarnih zametnih stanica iz prerade mišjeg embrijskog gonada. Prvi neuspješni rezultati uzgoja iskonsko zametne stanice in vitro pokazuje uzaludnost tih napora, kao i stanice, iako je preživio, ali ne razmnožavaju i umro u roku od prvog dana. Kasnije je utvrđeno da primarne mišje zametne stanice rastu u uvjetima in vitro u prisutnosti samo u mediju kulture topljivog i membranski vezanog faktora rasta specifični polipeptid. Brojna istraživanja su pokazala da je potrebno prisustvo u mediju za uzgoj, ne samo LIF, ali membrannosvyazannyh i čelik topljivi faktor (SIF) za opstanak i širenje primordijalnih zametnih stanica. Ovi peptidi su proizvedeni pomoću stanica embrija somatskih homozigotni za mutacije čelika, a jedna od njih je ligand protoonkogen cKit.

Primarne zametne stanice sisavaca i ljudi su ekstragonadalnog podrijetla i izvor su klonalnog razvoja spolne stanične linije. Startnoj liniji iskonska zametne stanice, kao i svih tkiva zametka i extraembryonic mesoderm daje epiblast (primarni ektoderm) ranih embrija imaju mozaik strukturnu organizaciju. Mikrokirurško odstranjivanje različitih dijelova ranog embrija uspostavilo je lokalizacijsku zonu u epiblastu klona počinjenih prekursora primarnih zametnih stanica. S rodamindekstrana koja je služila kao marker stanica utvrdio je da su prekursori primordijalne zametne stanice nalazi u proksimalnom dijelu epiblast, u blizini extraembryonic ektoderm. Primarna spolna stanična linija izlazi iz klonova od 45 stanica, čija se raspodjela javlja na samom početku gastrulacije. Zatim dolazi segregaciju klon, te u procesu gastrulacije, primarni zametne stanice ulaze u extraembryonic mesoderm i nalaze se na dnu rudimentima od alantoisu, iza od primitivne pruge. Od tamo primarne zametne stanice migriraju prema ventralnom kraju endodermalnog endoderma, a zatim se aktivno kreću kroz mesenteriju, populirajući genitalne valjke na kraju migracije. U procesu migracije, kao iu prva 2-3 dana lokalizacije u gonadnom primitu, primarne seksualne stanice aktivno proliferiraju i prolaze kroz osam replikacijskih ciklusa. Ako na početku migracije ima oko 50 primarnih zametnih stanica, u reproduktivnim cistima mišjih embrija 12-dnevnog razvoja, broj primarnih spolnih stanica premašuje 25.000.

Funkcionalna Sličnost ESCs i primordijalnih zametnih stanica pokazuje potpunu integraciju potonjeg u zamjena blastociste unutarnje stanične mase i zatim puni razvoj embrija, tkivo koje se sastoje samo od potomaka primordijalnih zametnih stanica. Prema drugim karakteristikama mišjih primarnih zametnih stanica PGCs bili su identični, na kojoj je sposobnost diferencijacije u različitim smjerovima, da bi se formirale embryoid tijela in vitro, a in vivo oblik teratoma kada se injektira subkutano u imunodeficijentne miševima sliče spontano teratoma testisa miševa linija 129 / ter.

Utvrđeno je da, kada se dodaju u medij LIF i topljivog membrannosvyazannogo SIF izolira primarnih zametne stanice 8 dana mišjeg embrija preživio i proliferacije u kulturi tijekom 4 dana a tada umrijeti. Osim toga, razdoblje kada je kultura smrti primijetio iskonsko zametne stanice se podudara s stupnju razvoja mišjih zametaka (12.5-13.5 dana), kada pupoljci primarni spolnih ženska zametne stanice ulaze mejoze, i muških praiskonskim zametnih stanica su blokirani mitotski podjela. Međutim, ako ste dodali na okoliš, ne samo čimbenike rasta LIF i od SIF, ali i FGF2, primarna zametne stanice nastavljaju proliferirovat i subkulture se formiraju Kolonije stanica može reproducirati čak i nakon što je uklonjena iz okoline faktora rasta (SIF i FGF). Takve se stanice mogu dugo uzgajati na embrionalnom fibroblastnom supstratu bez dodavanja topljivog faktora rasta LIF. Ove su stabilne stanične linije izvedene iz primarnih zametnih stanica koje se predlažu da se zovu embrionalne zametne stanice. Ovaj pojam ne može se smatrati uspješna kao kad kulturan EG-stanice ne mogu dobiti embrionalne zametne stanice sposobne za obavljanje naknadne faze oogenesis ili spermatogeneze. To je zbog činjenice da je EG-stanične linije, iako potječu od primordijalnih zametnih stanica, ali u kulturi stjecanja svojstva embrionalnih pluripotentne matične stanice gube sposobnost počinjenja germenativnye liniju. Drugim riječima, primarni članci klice tijekom uzgoja gube svojstva gamete preobraženi u prekursorima i ESC-kao što su pluripotentne stanice.

Treba napomenuti da kada se primjenjuju imunodeficijalni EG miševi, teratomi se ne pojavljuju. Pretpostavlja se da gubitak sposobnosti ljudskih EG stanica za iniciranje teratoma je posljedica činjenice da te linije nisu stvorene izravno iz uzgoja primarnih zametnih stanica, već su dobivene iz stanica izoliranih iz embrijskih tijela. Stoga je moguće da su potomci pluripotentnih, ali već počinjenih stanica.

Treba napomenuti da postoje osnovne razlike između EG stanica i primarnih zametnih stanica. Potonji ne omogućuju dobivanje himernih mišjih embrija, što ukazuje na nedostatak sposobnosti primarnih zametnih stanica da se integriraju u unutrašnju masu stanica ili trophektoderm. Karakteristike populacije primarnih spolnih stanica sličnije su zaraženim linijama somatskih stanica kasnijih zametaka, čiji uvođenje u blastocist također ne dovodi do formiranja himernih embrija.

Modifikacija tehnike uzgoj embryoid tijela dobivenih EG-agregaciju stanica dopuštenih selekcijom na selektivnim medijima za primanje slijedećeg populaciju pluripotentnih stanica, pod nazivom „stanice izvedene iz tijela (embryoid embryoid tijela izvedene stanice - EBV-stanice). Sposobnost EBD stanica da se dugo umnožavaju u kulturi dopuštaju stvaranje stabilnih staničnih linija počinjenih stanica. Dobiveni su klonovi stanica koje eksprimiraju široki spektar mRNA i proteinskih markera specijaliziranih stanica. Taj pristup kao rezultat pokazuju da su primarne ljudske seks pluripotentne stanice i diferencijaciju in vitro u različitim vrstama stanica, glija: neurona, vaskularni endotel, hematopoetskih stanica, mišića i endodermal stanica.

Alternativni izvori embrionalnih matičnih stanica

Alternativni izvor ljudskih ESC linija može biti hibridne stanice. Implantacija u maternici pseudogravidne kravljeg geterogenomnoy strukture dobivenih prilikom spajanja preko elektroporacija fetusa ljudskih somatskih stanica s kravama jaja, koji je prethodno bio uklonjen iz pronukleus, omogućuje primanje unutarnja masa stanica pre-implantacija embrija umjetnih razvojne faze. U tu svrhu, u prvom koraku se dobiva od krava blastocista jaje s transplantiranim ljudskim stanicama jezgre.

Druga faza se izolira iz blastociste zametka, a iz njega - ESC Thomson metodom. Važno je napomenuti da je najbolje rezultate u separacije ESC linija po ovom postupku su dobiveni korištenjem jezgre folikularnih stanica ili primordijalnih zametnih stanica koje traju u ljudskom tijelu u stanju hibernaciju. To je zbog činjenice da je kravlje jajašce transplantiranih ljudskih stanica jezgra neukorochennye bi trebao imati visoku aktivnost i telomera telomeazy da se izbjegne prerano starenje ESC klonova koji su izvedeni iz hibridnog jajeta (Repin, 2001). Poznato je da su najvažniji unutarstanični marker proteini PGCs su Oct3, Oct4, TCF, Groucho, koji pripadaju tzv prigušivača, kromatina proteine. Prigušivači omogućuju posebno kompaktno pakiranje heterookromatina, što sprečava stvaranje petlji eukromatina. Paket kromatina posredovan ovim proteinima korelira s totipotencijom ESC genoma. Danas je utvrdio da su zrele jajne stanice u goveda i ljudi su jedina vrsta specijaliziranih stanica koje sadrže visoke koncentracije prigušivača proteina u citoplazmi. Na toj osnovi, te je razvio metodu za dobivanje hibridni ESCs somatskom prijenos jezgre stanica u ne-nuklearne kravlje jajne stanice. Preliminarna in vitro ispitivanja pokazala su da citoplazmi jajne stanice krave vraća totipotency genom ljudskih staničnih jezgara somatskih nakon 12-24 sati kulture.

Od posebnog interesa su podaci o svojstvima predimplantacijskog razvoja ljudskih embrija koji ukazuju na kasniju zamjenu totipotentnih stanica populacijom pluripotentnih stanica nego u miševa. Istraživanje staničnih transformacija pokazalo je da stanice unutarnje stanične mase ljudskog blastocista, osim ESC-a, također generiraju trofoblastne stanice, što ukazuje na njihovu ukupnu potentnost.

Poznato je da u stadiju blastocista postoje dvije različito počinjene stanične populacije. Jedan od njih je i vanjski sloj blastocista, trofectoderm, izveden iz stanice trofoblasta i drugih komponenti embrionalnih posteljica. Druga populacija stanica grupirana je u gustu masu koja povezuje unutrašnju površinu tropekoderma. Stanična populacija unutarnje stanične mase izvedena je iz svih tkiva i klica organa embrija. U fazi kasnog blastocista, iz unutarnje stanične mase nastaje ekstra-embrionski endoderm i nastaje epiblast (primarni ektoderm). Istovremeno, epiblastne stanice zadržavaju pluripotenciju, dok je sposobnost diferencijacije stanica ekstradicijskog endoderma ograničena.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Dobivanje ljudskih embrionalnih matičnih stanica

Do nedavno se vjerovalo da trofoblast dobiti od hESCs nemogućim. Međutim diploidnih linija trophectoderm matične stanice izolirane iz blastociste u mediju koji sadrži, umjesto LIF i FGF2 heparin, izbacuje i pretvara se u matičnim stanicama. Ako uklonite iz svoje sredine FGF2, a trophectoderm stanice zaustavi razmnožavanje, počinju endoreduplikacija kromosoma i staničnih elemenata trofektodermalnye postupno pretvara u divovski stanica trofoblasta. Vjerojatno, LIF ne stimulira proliferaciju stanice trophectoderm zbog činjenice da pokreće FGF2 mehanizma transsignalizatsii kao FGF2, vezanje na citoplazmatske receptore (FGFR2), aktivira MAP kinazu u citoplazmi - ERK1 i ERK2. Prema tome, kada je ugrađen u stanicama blastociste jednog signalnog puta (LIF - gpl30 - JAK-kinaze - STAT3) unutarnje stanice masa stanica se pretvaraju u pluripotentnih hESCs, a aktiviranje drugog mehanizma transmembranskog signaliziranja (FGF2 - FGFR2 - MAP kinaze ERK1 / ERK2) matične stanice u blastociste trophectoderm formira. Izbor signalnog puta, pak, ovisi o aktivnosti oct4 gena. Ovaj gen pripadaju POU domena, koji se nalazi na lokus t 17 autosoma i izražena je u oogenesis u razdoblju drobljenje i u stanicama stanične mase unutarnje blastociste i u prvobitnim zametnih stanica. Funkcionalna uloga oct4 gen koji kodira transkripcijski faktor potrebne za nastanak pluripotentnih stanica, njihovu diferencijaciju i dediferencijacije.

Ekspresija gena oct4 u ESC varira ovisno o interakciji tog faktora transkripcije s kofaktorima. Smjerna regulacija ekspresije oct4 u blastocistima pokazala je da, sa smanjenjem njegove aktivnosti, polovica stanica tvori tropektoderm, dok s povećanjem inducirane ekspresije okt4, uglavnom dolazi do ESC.

U eksperimentu, ESC ne može prevoditi u skladu uzgojem višestruko važne blastomeri dekolte pozornici i na pozornici gastrulacije i kasnijim fazama embrionalnog razvoja. Miš ESCs obično rasporediti na 3,5-4,5 dana trudnoće, koja odgovara (šeste jednog sloja blastociste) i sedam faza (dvoslojnih blastociste - rani jaje cilindra) normalno embriogeneze. Očito je da samo u razdoblju predimplantacije embriji miševa sadrže stanične populacije koje se mogu transformirati u ESC. Slijedom toga, izolacija ESC linija je moguća samo u određenim stadijima embriogeneze. Višestruko važne, u pogledu mogućnosti za razvoj održivog embrija iz embrionalnih ovojnica i posteljice su zigota i nastaje tijekom drobljenja blastomera. Gubitak ukupne snage germinalnih stanica započinje u kasnijem morula stadiju, kada daljnje blastomere usitnjavanje ovisi o njihovoj lokaciji. Rani Morula blaetomeri zadržavaju totipotenciju, jer eksperimentalne manipulacije s promjenama u njihovom položaju, na primjer, inverzija njihovog položaja, ne sprečavaju razvoj potpunog embrija.

Utvrđeno je da učinkovitost oslobađanja ESC-a u liniji utječe na stanje blastocista u vrijeme njihovog eksplaniranja. Korištenje blastocista nakon sedmodnevnog simulaciju dijapauza u genitalnom traktu miševa, kojima su odstranjeni jajnici na 3,5 dana gestacije i pomiješa s progesteronom, doprinosi uspješnijem razdvajanja linija embrionalnih matičnih stanica. Pretpostavlja se da u takvim uvjetima povećava se broj blastomera koji tvore unutarnju staničnu masu. Također je moguće da se stanični ciklus proteže i većina blastomera ulazi u fazu G0.

Nadalje, stvaranje stabilnih pluripotentnih hESC linije ovisi o genotipu embrija: vrlo lako razlikovati od ESCs Murine blastociste linija 129 je znatno teže ih dobiti miševima CS7BL / 6 i praktički je nemoguće izolirati linije od hESCs blastociste CBA / Ca miševa. Očito, rani embriji posjeduju neka genetska obilježja koja utječu na razvoj pluripotentne ESC linije. Međutim, kada se uzgajaju epiblast izolirana, kao i selektivnim odabirom diferencijacije hESCs stanične linije od ranih zametaka CBA / Ca miševi i dalje su dodijeljena.

Dokazana standardna tehnika za dobivanje ESK linija od blastocista dano je u laboratorijskim priručnicima o tehnici eksperimentiranja s ranim embrijima. Eksperimentalni Hess može se dobiti kultiviranjem izoliranu epiblast (primarni ektoderm) 4.5 dana starih mišjih embrija pomoću tehnike mikrokirurških prilično složene i modificirane uvjetima kultiviranja. Složenost ovog postupka opravdana je jer je učestalost formiranja ESC linija znatno veća nego kod rada s unutarnjom masom blastocista.

ESC linije za izoliranje svaki klon je prebačen u mikro-dobro obrađivati 40-60 skupinom stanica, to se ponovno dispergiraju. Više ponavljanja ovog postupka omogućuje dobivanje besmrtnih ESK linija s maksimalnim proliferacija brzina normokariotipnyh stanica vezanih na plastike, koji prolaze kroz 50-100 zadrži totipotency i visoku aktivnost telomeraze. U procesu linijama ESC najveća opasnost je onečišćenje ili seruma bakterijskih endotoksina - i tragove koncentracija endotoksina u mediju kulture uzrokuje smrt masa nezrelih zametnih stanica. Uz pažljivu kontrolu rasta linearne i pravovremeno disperzije ESCs u kulturi sposobni su simetrično fisije, u kojem su obje kćeri stanice ostaju pluripotentne i mogućnosti to obaviti neograničen broj stanica ciklusa, održavanje diploidni kariotip i ukupni potenciju.

Izbor čiste populacije humanih ESCs može se provesti nakon transfekcije u njihove genome rekombinantne DNA molekule koje sadrže gen koji kodira sintezu protein zelene fluorescencije (GFP). Ekspresija GFP povećava s raste ESCs u okruženja za njihovu proliferaciju, dok početak diferencijaciju razine ekspresije gena se smanjuje, što omogućuje odabrane na selektivni medij čiste stabilne, pluripotentne staničnih linija. Kada se kultiviraju s GFP selekcijom ESCs, učestalost kolonija je znatno povećana, jer u uvjetima selekcijskih usjeva se uklanja snažan antiproliferativni učinak diferenciranih stanica.

Prevođenje humanih embrionalnih matičnih stanica, u skladu s pomoću metodi izolacije predimplantacijsku embrija (korak 80-120 stanice), koje ostaju nakon oplodnje in vitro postupak je u. Zbog toga se umjetno dobiveni "višak" embrija mehanički dispergiraju u okruženju Delbecco-Needle. Nakon označavanja stanice sa monoklonalnim antitijelima selektivnim fluorescentnim markerom zametka izoliranim stanicama. Embrijoblast je raspršen u pojedinačne stanice koristeći smjesu disazaza-kolagenaze. Disocirane stanice su rasle u posebnom mediju (80% Delbekko mediju + 20% fetalnog telećeg seruma u prisutnosti 500 ug / ml IL-6, LIF i SCF) na monosloju embrionalnih fibroblasta za umetanje 3 prve prolaza. Tako opstanak i proliferaciju matičnih i ishodišnih stanica održava izlaganjem IL-6, i LIF SCF. U tom okruženju, ovjes hESCs rasti klonovi osharennyh nepovezanim stanica se odijeli nježnim multiple pipetiranje. Novi klonovi pojavljuju se u suspendiranoj kulturi 5.-7. Dana. Maksimalna stopa rasta ESC postiže se ponovljenom disocijacijom klonova u fazi od 10-15 stanica. Zatim, svaki klon se prenese na mikročest i naraste do agregacije od 40-50 stanica. Postupak se ponavlja više puta u prolazima, povećava volumen kulture na gustoću od 5-10 milijuna stanica po 6 cm jelo. Korištenjem takvih Thomson stavljanjem se izolira 10 klonova besmrtne humane ESCs koji kroz prolaze 100 zadržavaju visoku aktivnost telomeraze, sposobnost da se intenzivno proliferaciju i fenotipskih karakteristika minimum Ukupna biološka aktivnost, s diferencijacije u bilo kojem od 350 specijaliziranih staničnim linijama koje su izvedene ekto-, mezo i endoderm. Diferencijacija humanog ESC počeo (na promjene srednje, dodavanja i eliminacije seruma LIF) s vezanja stanice na podlogu, što ukazuje na razvoj citoskeleta i adhezijskih receptora. Važno je da neograničeno širenje ljudskih ESCs održava normalan kariotip.

Druga metoda izolacije ljudskih ESC linija temelji se na primjeni primarnih spolnih stanica. Eksperimentalne studije pokazale su da se Eu-stanične linije mogu dobiti iz genitalnih plakova 12,5 dana starih embrija miševa. Međutim, u tim je slučajevima učestalost stvaranja staničnih linija progenitora bila znatno niža nego u pokusima s ranijim embrijima. Istodobno, primarne stanice spolova iz gonade mišjih embrija u dobi od 13,5 dana gestacije uglavnom su nesposobne pretvoriti u linije.

Prve stabilne linije humanih pluripotentnih EG stanica su poticale od primarnih gonocytes izoliranih iz genitalnog primordia 5-9 tjedana starih embrija. Izolirane stanice su uzgojene na supstrat inaktiviranom fibroblastu embriona miša u DMEM mediju uz fetalnog seruma, u koju se doda merkaptoetanola, forskolin, kao i rekombinantne humane faktora rasta (FGF i LIF). Nakon 7-12 dana, multicelularne kolonije pojavile su se u kulturi, prema morfološkim obilježjima i molekulskim markerima koji odgovaraju ljudskim EG stanicama. Nakon agregacije, te stanice formirale su embrijska tijela, čiji je daljnji razvoj pojavio specijalizirane stanice, karakteristične za derivate svih triju embrionalnih lišća. Tijekom 10-20 prolaza EG-linije zadržale su normalni kariotip i nisu izgubile pluripotenciju.

Također je pokazano da kombinirani učinak LIF, membranskih vezanih i topljivih faktora čelika, kao i TGF-b modificira program za razvoj primarnih zametnih stanica. Umjesto zaustavljanja mitotičke podjele i počinju razlikovati prema oogenezi ili spermatogenezi, primarne stanice spolova i dalje proliferiraju. Nakon nekoliko dodatnih mitotičkih ciklusa oni postaju slični stanicama epiblasta i, gubitkom svojstava prekursora zametnih stanica, transformiraju se u pluripotentne EG stanice embrionalnih stabljika.

Dakle, 1998. Godine, besmrtne linije primarnih seksualnih stanica prvi put su izolirane od seksualnog ishoda ljudskog fetalnog obdukcijskog tkiva. Embriogeneza ljudskih zametnih stanica primarnih pojaviti u žumanjčana vreća u trećem tjednu razvoja, a na 4-5th tjedna, ove stanice migriraju u području seksualnog kvržicama, gdje oni čine populaciju od primarnih dormantnye gonocytes. U neaktivnom stanju, primarne zametne stanice ostaju u pupoljci sve do rođenja. Primarna zametne stanične linije su iz fetalnih genitalnog tuberkuloze 5-9 tjedana starih embrija pozvanim ex tempore materijal koji je obrađen sa smjesom tipa IV kolagenaze-V, i DNase hijaluronidaza za kvantitativnu i kvalitativnu prinosu povećanje stanica. Primarne stanice pšeničnih klica u tkivu fetusa genitalnog kvržicama okružena strome (mezenhimalnog) Sertolijeve stanice. Funkcionalna svrha Sertolijeve stanice je proizvodnja anti-apoptotičkim faktora (Fas-ligand), mitogenima i imunosupresivi koji štite seksualne matične stanice imunološkog napada tijelu. Osim toga, stromalni mikrookoliš genitalnog tuberkula igra važnu ulogu u sazrijevanju gameta. Izolirani primarne stanice u kulturi klica sade iznad feeder strome slojem koji se sastoji od fibroblasta iz fetalnih prva tri prolaza. Najučinkovitiji kombinacija mitogenima je prepoznat kao kompleks sastoji od LIF, FGF i forskolinom (cAMP formacija stimulans). Proliferacije primordijalne zametne stanice in vitro zahtijevaju dodatak fetalnog seruma, u prisutnosti primarnog reprodukcije gonocytes u klonovima kulture pratnji formiranje kuglastih, nepričvršćenih stanica na podlogu.

Američki Nacionalni institut za zdravlje na temelju sažimanje postojeće informacije o metodama raspodjele ljudskih ESC linije iz blastocista je napravljen preliminarni zaključak da je uspješna dodjela ESC je najvjerojatnije kad kulturan blastociste s dobro formirana unutarnje stanične mase (Matične stanice: znanstveni napredak i smjeru daljnjih istraživanja Nat. Inst, od Health USA). S ove točke gledišta, najbolji izvor ESCs stvoriti linije ljudskog blastocista 5. Dan razvoja, od kojih je raspodjela stanične mase unutarnje treba pažljivo ukloniti trophectoderm. Izolirana unutarnja stanična masa se sastoji u ovoj fazi 30-35 stanica treba uzgajati na supstrat mišjih embrija fibroblasta, što je odlučujući uvjet za formiranje kolonija kulture hESCs.

Analiza fenotipskih značajki embrionalnih matičnih stanica

Od posebnog je interesa međuspecifična komparativna analiza fenotipskih značajki ESC. Utvrđeno je da su ljudska ESC kolonije - gusta nakupine spljošten epitelnih stanica, a miševi embryoid tele sastoji od labave konglomerat zaobljenim stanica. U ljudskom ESC, indeks omjera nuklearne i plazme je niži nego kod mišjeg ESK. Embrionalne matične stanice majmuna formiraju više ravnih kolonija stanica s neravnim rubovima. U ranim klonovima ESC primata, pojedine stanice su lako vidljive. Proliferativna ESC svih ispitivanih životinjskih vrsta ne izražava MHC molekule prve i druge klase. Istovremeno, ljudski ESCs daju pozitivni odgovor na antitijela tera 1-60 i GCTM-2, što ukazuje na prisutnost na površini keratin / kondroitin sulfat proteoglikane, karakteristika embrija (teratoma) -kartsinomnyh matičnih stanica. Izraz u hESCs sve vrste životinja oct4 gena ukazuje na to da, unatoč fenotipskih razlika u ljudskim i mišjim ESCs, očito aktivira na isti set gena odgovornih za održavanje pluripotency (Peru, 2001). Osim toga, ESC linije potječu od embrija štakora, svinja, kunića, primata, i stoku, imaju slične morfološke karakteristike, sličan skup molekularne identifikacije markera i gotovo identičan molekularni mehanizam za provedbu embriogeneze program koji vam omogućuje da se novi pogled na pitanju transplantacije ,

Za razliku od normalne embriogeneze in vivo, in vitro proliferaciju hESCs nije popraćena formiranjem germinalna slojeva i nastavlja blokirati homeotic Nohgenov podlogu, tj bez organogenezu. Od segmentacije geni ne djeluju u kulturi hESCs nemoguće reproducirati takve periode embriogeneze kao kartica odsječak segmentacije jezgre, formiranje žumanjčana vreća alantoisu provizorne i druge organe i tkiva. Kultura ESC-a zamrznuta je na početku formiranja 350 ograničenih linija specijaliziranih stanica. Dakle, klon podružnica ishodišne stanice i centralno lokalizirana PGCs su jedini model embrij tijekom razvoja u kojem su različite regije tkiva formirane u jednoj fazi razlikuju se od specijaliziranih stanica dobivenih, međutim, od uobičajenih prethodnika. Iako minimalnoj razini receptora na površini hESCs, oni zadržavaju sposobnost za obavljanje primitivne morfogenetske procese simulirajući većinu ranog strukture embrija: gnojnica hESCs u kulturi i agregata tvori strukturu nalik blastocista ili čak i kasnije embrija (jaje cilindara). Takvi suspenzijski agregati su prikladno nazvani jednostavnim i složenim embrionalnim tijelima.

Kada se pomiješa diferenciraju u različite stanice embryoid tijela istovremeno izražena rano geni ektoderm (oct3, FGF-5, čvora), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), kardiogeni mesoderm (pkh-2,5), neuralne cijevi (msx3 ) i hematopoeze (elff). Koristeći različite kombinacije citokina i faktora rasta za usmjeravanje stvaranja klica sloj stanica in vitro u brojnim slučajevima bilo je moguće dobiti embryoid tijela, koji su ponajprije izraženi gena ektoderm ili mesoderm koja otvara put modeliranje gastrulacije i rane organogenezu faze.

Klonska rast hESCs je dokaz stanične diobe asimetričnog u kojoj je samo jedan od ESC u središnjoj klona zadržava bezgranični reprodukciju sposobnosti, dok je druga kćer stanica dovodi do generacije ishodišne stanice, diferencijacija je već dolazio. Stoga je brzina umnažanja klona na periferiji embrijskog tijela veća nego u sredini. Granične stanice rastućeg klona prolaze kroz spontanu poremećenu diferencijaciju, migriraju ili umiru mehanizmi apoptoze. Ovi događaji odrediti sudbinu klona, ako je stopa proliferacija premašuje stopu migracije i smrti stanica apoptozom, klon veličine i dalje povećavati, stabilizacija događa s jednakom apoptoze i brzini formiranja nove brzine stanica, regresija - obrnutom omjeru tih procesa. Prostorni stanice podijeljene su simetrično, tj. Obje stanice kćeri dalje se diferenciraju u zrele specijalizirane stanične linije. Omjer ESC / progenitorskih stanica varira, ali uvijek je količina ESC samo djelić posto posto populacije progenitorskih stanica. Stoga, samo pažljivo pipetiranje i pravovremeno disagregiranje klonova može povećati broj ESC-ova u kulturi. Kako bi se dobio maksimalni prinos ESC, najučinkovitije je bilo disagregiranje klonova u fazi 10-12 stanica. Smjer i stupanj diferencijacije stanica u tijelu embrija ovise o njihovoj lokaciji. Vanjska embryoid stanice tijela ne izražavaju gen i oct4 proći diferencijaciju u osnovnim endoderm stanica iz koje se formiraju epithelioid stanice i parijetalni extraembryonic visceralnog endoderm. Interne stanice embrijskog tijela eksprimiraju gen oct4 i zadržavaju pluripotenciju tijekom 48 sati kulture. No, tada je morfološka reorganizacija događa u epitelnim jednoslojna kultura počinje i ekspresija gena koji kontroliraju razvoj primarne ektoderm. Zatim započinje proces potpunog poremećenog citodiferencijacije s pojavom različitih tipova stanica koji su derivati svih triju germinalnih listova. U procesu spontanog diferencijacije embryoid tjelesnim stanicama prvo nastati agregata za endoderm oznake u obliku fragmenata (cisti) jajeta ulici. Nadalje, u tim strukturama pojavljuju se angioblasti i endotelne stanice rastućih kapilara. U završnoj fazi spontanog diferencijacije unutarnjih stanica embryoid tijelo razvija različite fazi diferencirane stanice, uključujući neurone, glija elemenata kardiomiocitima, makrofagi i eritrocita. U određenom aproksimacija (s obzirom na prostornu inverziju listova koji tvore tkivo embrija) preko embryoid tijela in vitro može istražiti morfogenetske procese i analizirati molekularnih mehanizama embrionalne cytodifferentiation početnom razdoblju, te uspostaviti uloge specifičnih gena u provedbi tih procesa.

Stoga su unutar klona stanice u kojima se otkrivaju različiti genetski razvojni programi - ESC, rani progenitor i diferencijacija populacija progenitor. Uzgoj ESC-a pomoću metode padanja ili masovne kulture bez slojnog feeder-a i bez dodavanja LIF-a u mediju neizbježno dovodi do stvaranja embrijskih tijela. Morfologija stanica vanjskih i unutarnjih slojeva embrijskih tijela je drugačija. Vanjski sloj se sastoji od velikih, procesnih stanica. Njihova površina, okrenuta prema okolišu, prekrivena je brojnim mikrovilijama. Vanjski sloj stanica odvojen je od unutarnje bazalne membrane nalik Reichert membrani, dok su stanice unutarnjeg sloja embrijalnih tijela cilindrični epitel. Morfološki, unutrašnji sloj, iako sadrži mnoge dijelove stanica, više podsjeća na nediferencirane ESC kolonije.

Značajke ljudskih embrionalnih matičnih stanica

Odsustvo parenhima-mesenchvmal interakcija na pozadinskog signala blokiranja gene homeosis uzrokuje nepravilno rast PGCs u kulturi, jer je to kartica je slomljen i formiranju infrastrukture provizorne organa. Neorganizirano rast i neuredno spontana diferencijacija hESCs u kulturi zbog nedostatka mesenchvmal obilježavanja strome budućih tijela: in vitro moguće je stvaranje milijuna hepatocita, ali ne možete dobiti bilo segmentima jetre, uključujući i takve strukturne i funkcionalne elemente, kao što su sinusa, prostor Disse i Kupfferovim stanicama.

Smatra se da je pluripotency od ESCs ostvaruje isključivo u embriogeneze u obliku tkiva i organa embrija, dok se pupčana vrpca i posteljica izvedeni trofoblasta. Zatvoren u ljusku trofektodermalnuyu ESK konstantno generira stanični klonovi provizorne ostvarivanja razvoj programa kombiniranim mRNA bulk Nohteyaov topografski matriks, koji je unaprijed prostorni raspored, oblik, dimenzije, broj privremenih i konačnih organskih stanica i parenhimu sklop u strukturne i funkcionalne jedinice. Istovremeno ESC su vrsta jedina stanica u kojoj je molekularni mehanizam ostvarivanja svojih potencijala potpuno odvoji od genetskog programa razvoja i ESCOs sami oduzeta mogućnost interakcije s drugim stanicama zbog blokade obje percepcije receptora i transsignalizatsii sustava. Međutim, odgovarajući aktivacijski ESCs rezultira postupnim implementacija embriogeneze Program završna rođenja je potpuno formirana i spremna za Izvanmaterična života nekog organizma koji se sastoji od milijardi stanica. U tom kratkom vremenu, ali nezamislivo dug u stanični prostor put neizbježne pojave grešaka u molekularne mehanizme koji pružaju vitalne funkcije stanica, te u programima koji kontroliraju njihovu proliferaciju, diferencijaciju i specijalizaciju. Dakle, u modernim farmakogenomiku promatrati odvojeno bolest molekularne uređaje i programiranje stanica bolest. I djelovanje većine novih lijekova usmjerenih na ispravljanje ime programa diferencijacije, proliferacije i organogeneze, kao i regeneraciji organa i tkiva. U organizmu odraslog preko ESCs postaje moguće kontrolirati ponašanje matičnih / ishodišnih stanica transplantiranih u mozgu, jetri, slezeni, koštanoj srži i drugih organa u čovjeka za popravak oštećene primatelja parenkimalne organa zbog diferencijaciju i specijalizaciju donator mezenhimske stanice sačuvanim matricu. U osnovi, totipotency Program pokreće još oocita genoma razini, zigota i blastomeri, ali ove stanice još uvijek nije moguće klonirati i presađuju se u količinama potrebnim za potrebe iskustvene i praktične medicine. Dakle, ESC je jedinstven izvor genetskih informacija sadrži trodimenzionalni linearni ograničenje kartu embrija i kodove specijaliziranih stanične linije tijekom gastrulacije.

Gotovo neograničene mogućnosti regenerativnim ESC zbog činjenice da je njihov genom, za razliku od genetskog aparata diferenciranih somatskih stanica, održava pluripotency. Jedna od manifestacija uspavanom stanju ukorijenjena u ESCs genetskih informacija je takozvani minimalni fenotip - na površini ESC izražavanja ograničen broj receptora, te stoga raspoređeni vrlo malo programa za interakciju transsignalizatsii nuklearnu napravu u stanici sa svojim okoline. Na pozadini zimskog sna gena odgovornih za ograničavanje specijaliziranih stanične linije i diferencijacije stanica, aktivira samo oko 30 od 500 gena čiji su proizvodi pružaju komunikacijske stanice s okolnog okoline. Koristeći metodu serijske analize genske ekspresije prikazan da općenitost glavnih funkcionalnih genoma kutije reguliraju energiju i metabolizam u somatskim stanicama i ESCs u zadnjem određena izuzetno male količine mRNA receptora, G-proteina, sekundarnih glasnika, transkriptaze, kofaktora ekspresiju i represije da je, cijeli sustav transmembranski regulatorni signal u stanicu. To je zbog nedostatka ili vrlo niske ekspresije transsanalizacijskih gena. Tijekom diferencijacije induciranog u genom ESC 18 rada zaustavljena sinkrono djeluje gene za pozadinu aktiviranje transsignalizatsii 61 gena koji kontroliraju sintezu stanične adhezije receptora, komponente ekstracelularnog matriksa, ograničenje transkriptaza messendzhernyh elemente i za prijenos signala u sustavu za nuklearni jedinicu s membranskim staničnim receptorima u plazmi. Istovremeno blokira ekspresiju gena odgovornih za sintezu proteina prigušivača, kao i ekspresiju gena koingibitorov pruža totipotency genoma hESCs.

Pronađeni su genetički markeri za stanice svih tri embrionalne letke. Identifikacija sloj ektodermalne stanica nosi na ekspresiju gena čvora, oct3 i FGF-5, stanice mezodermalni - gen brachyury, zeta-globin, endoderm - na ekspresiju gata-4 gena. U normalnom embriogeneze, tijekom gastrulacije opaženo aktivnu migraciju nezrelih populacija matičnih i ishodišnih stanica, lokalno određivanja područja kosti lica lubanje, neki dijelovi mozga, perifernog živčanog sustava, srčane provodljivosti sustava i timusa tkiva koje nastaju iz klonova pomaknut stanica. Označavanje ćelija rani geni klice slojeva olakšava topografske analize migracija nezrelih stanica u razvoju embrija. Nađeno je posebno da stanice u agregatima embriokarcinom P19 ekspresiju prve gena mesoderm brachyury započinje za vrijeme redukcije ekspresije gena tkivnog aktivatora plazminogena, a-fetoprotein, keratin 8 i keratina 19, koji su markeri ranije mezoderma migracijskih populacije. Prema tome, formiranje tkiva mezodermalni porijekla započinje tek nakon postupka migracije i taloženje točke mezodermalni ishodišnih stanica.

Uz iznimno ograničene fenotipskih osobina i nedostatku većina blokova transsignalizatsii ESC ipak izražavaju neke molekule receptora koji se mogu koristiti kako bi ih identificirati. Važno je napomenuti da su antigeni markeri ESC-a kod ljudi i primata bili uobičajeni. Najčešće se koristi za označavanje hESCs označenih antitijela na antigene membrannosvyazannym SSEA-3, 4-SSEA (jedinstveni lipidni kompleks antigena predstavljaju glikolipida GL7 s sialična kiselina), kao i visoki polimer glikoproteini TRA-1-81, 1-60-TRA. Nadalje, izrazi hESCs specifičan antigen embrionalnog SSEA-1 i endogenog alkalnu fosfatazu, kao i specifični transkripcijski faktor Oct4. Potonji je potrebno za održavanje proliferacije hESCs mehanizama - specifični transkripcijski faktor Oct4 gen aktivira ekspresiju faktora rasta fibroblasta 4 gena i stabilizira boks odgovoran za neograničavajući DNA ponavljanje u nezrelih stanica. Najvažniji unutarstanični marker proteini su Oct3, Oct4, TCF i Groucho, u vezi s proteinima kromatina-prigušivača.

Odmah nakon dugoročnog kultiviranih ESCs pokušaja neuspješna i organizam prvo je pripremljen kultura matičnih stanica izoliranih iz miševa blastociste i kulture primarnih zametnih stanica, počeo fazi studije sposobnosti ESC pluripotency kada se daje u ranim stadijima razvoja embrija. Pokazalo se da je na morule i blastociste PGCs su u mogućnosti da se formira himernih embrija u kojem donora PGCs potomci otkrivena u svim tjelesnim tkivima i čak u gamete. Tako je u razvojnoj biologiji pomoću ESC skriptiranje „most” između eksperimentalnih studija in vivo i in vitro, što znatno povećava mogućnost proučavanja procesa oznake primarne tkiva i organe, njihovu diferencijaciju i embrionalne organogeneze.

Jasno je utvrđeno da se in vivo tijekom embriogeneze ESK integrirati u staničnu masu ranog embrija, a njihovi derivati nalaze se u svim organima i tkivima. ESCs koloniziraju u himernom zametku liniju spolnih stanica, potomci koji čine punu ovulaciju i spermatozoide. Embrionske matične stanice kolonija klonogenih - pojedinačni PGCs može stvoriti genetski identičan kolonija stanica s molekularnih markera, koji uključuju oct4 ekspresiju gena i alkalnu fosfatazu, visoka aktivnost telomeraze, kao i ekspresiju specifičnih antigena embrija.

Proučiti mehanizme embriogeneze koristeći tehniku hESCs kimerizaciju morule izradom biološke strukture, koja se nalazi izvan sloj tetraploid blastomeri prijemne i donorske PGCs daju u. Tako, trofoblasti formiran od potomaka tetraploid blastomera primatelja koji omogućava implantacije i placentacije i donorske PGCs djeluju kao unutarnje stanične mase, koji je formiran od izvediv zametne linije primarnih tijela i progenitorskih gamete. Studija ESC vrijednost ne leži samo u tome, kada je manipulacija in vitro s njihovom genomu zadržana pluripotency, ali i na činjenicu da dok očuvati sposobnost sudjelovanja u formiranju hESCs iskonsko zametnih stanica kimcričnog embrija. To pokazuje da je samo jedan izdanak genetski modificiranih PGCs kolonizirati sve osnovne i bakterije koje tvore tkanine kimerni embrija dobivenog agregacije ili sukulture stanica sa 8 stanica embrija. Kada su transplantirane u miševe morula ESCs transfektiranim sa zelenim fluorescentnim gena proteina, fluorescentne potomci stanica pronađeni su u svim ispitivanim tkivima u razvoju embrija (Shimada, 1999). Transplantacija ESC u morule može stvoriti održive miševa, tijelo koje se sastoji isključivo od potomaka donirao ESC, što otvara mogućnosti za različite terapijske mogućnosti kloniranja. Sada takav metodički pristup uspješno primjenjuje za proučavanje problema razvojne biologije, posebno, može analizirati genetske mehanizme inaktivacije X kromosoma ili epigenetičke nestabilnosti hESCs. Transplantacija ESC-a u rani embrij se također koristi u biotehnologiji u poljoprivredi, kao iu pokusima genske terapije.

Transplanti genetski modificiranih ESC-a koriste se za testiranje ciljnih stanica mutantnih gena. In vitro kultivirani ESC-i se koriste u biotehnologiji radi stvaranja nokautiranih miševa. U tu svrhu, pomoću homologne rekombinacije biti uklonjena iz ESCs istraživanje gena (knockout) i selektivni mediji luče stanice koje oskudijevaju taj gen. Tada se uklanjaju ESC-ovi ubrizgavaju u blastociste ili agregiraju s blastomera morula. Tako dobiveni himerni rani zameci se transplantiraju u žena primatelja i novorođenčadi miševi odabrana među pojedincima s gameta, nullizigotnymi tog gena. S ovom tehnologijom stvorene su mnoge linije nokautiranih miševa, koje se široko koriste u eksperimentalnoj biologiji i eksperimentalnoj medicini. Na tim biološkim modelima proučavao vrijednosti određenih gena u embrionalnom razvoju, kao i njihovu ulogu u mehanizmima bolesti i patoloških stanja u ljudi. Osim toga, linije nokautiranih životinja koriste se u preklinickoj fazi ispitivanja novih metoda genske terapije. Na primjer, koristeći transfekcije gena u normalnim ESK alela mutirani gen učinkovito upravljati ispraviti mutaciju, udari hemopoetskog sustava. Uvođenje stranih gena u ESC omogućuje stvaranje linija homozigotnih transgenskih laboratorijskih životinja ubrzanom brzinom. Međutim, treba napomenuti da je tehnika usmjerena rekombinacije brisanje gena pouzdano razrađen su tek relativno ESC miševi. Koristeći mišje ESCs dvostruko knockout instaliran funkcionalnu ulogu područje grozd gena na kromosomu (7 kopija genomske regije 19 minuta humani kromosom), i proksimalnog dijela 11. Kromosoma (kopirati ljudski kromosom 5d) - brisanje tih gena u ESK miševi omogućili su procijeniti funkciju njihovih analoga kod ljudi.

Funkcijske kapacitet Studije humanih embrionalnih gena u transfekciji genom koji laboratorijske životinje ljubimci hESCs naročito kripto razjasniti ulogu gena na kartici i tvore gen kardiogeni mesoderm, osobe-6 - u embriogenezi oku. Predstavlja prvi izražaj gena u nezreli proli & kartice ESC teratokarcinom i blastocista miševi potvrdio ogromnu represiju u ESK transsignalizatsii gena. Kombinacija mutanata ESCs 60-80 i 20-30 stanica normalnih prije implantacije mišjih embrija dovodi do razvoja himcrna embrija u kojoj oznake tijela su sastavljena od donatora i primatelja stanica, koji nam omogućuje da se odredi uloga nepoznatih gena u gastrulacije i organogeneze. Funkcionalna karta mjesta gena u razvoju zametka u mišjih uvećanim detaljima uloge gena kartici SF-1 u nadbubrežne žlijezde i genitalnog primordia, mas-1 gena - u bubrezima kartica myoD obiteljskim genima - u kartici skeletnih mišića obitelji gena gata-1-4 - u ograničenje sazrijevanja osnove eritro- i limfopoeze.

Redatelj off majčinu i očevu alela gena u hESCs pomoću vektora rekombinazu služio pojasniti funkcije različitih gena tijekom ranog embriogeneza i tehnologija ciljanje ljudskih nepoznatih gena u miša ESCs doprinose otkrivanju novih mutiranih gena odgovornih za razvoj teških nasljednih bolesti. Koristeći postupak knockout definirano značenje obvezni nekih gena za polaganje embrionalnog tkiva: gata-4 - za infarkt, gata-1 - na eritroidne hematopoetskih tkiva, myoD - skeletni mišić, brachyury - za ograničenje mesoderm transkriptaza hnf3 i hnf4 - za matične stanice jetre, krpe-2 - oznake za klonova T i B limfocita (Repin, 2001). Dvostruko brisanje gena u hESCs otvorio pristup proučavanju funkcionalne uloge gena u klica slojeva, segmentacije i homeosis i transplantacije ESC s obzirom na mogućnost dobivanja održive međuvrsnog hibridnih embrija. S poboljšanim metodama transplantacije donatorskih PGCs u jednom 8-staničnog embrija dokazano da kimerizacijom na staničnoj razini mnogih organa embrija primatelja. Imajte na umu da se klice stanica nalaze u ljudskim tkivima primatelj miševi organa nakon primjene ljudskog hematopoetskih matičnih stanica u blastocistu. Utvrđeno je da je u mišjih zametaka tijekom formiranja krvnih tijela cirkulira pluripotentne hESCs. Moguće je da njihova biološka funkcija bude u embrionalnoj organizaciji budućeg imunološkog sustava. S ESC in vitro reproducirati odgovarajuće modele ljudskog genetske bolesti: dvostruki onesvešćeni modeli distrofin gen miševa Duchenneovu mišićnu distrofiju, atm gena isključivanja (kontrolni signal kinaze sinteze kromatina) - ataksija-teleangektaziyu. U tom slučaju, fatalna nasljedna bolest u djece zbog nedostataka u popravku DNA razvija degeneracije Purkinjeovim stanica u mali mozak, koji je u pratnji involucije timusa zbog smrti proliferacijom stanica. Klinika, Patofiziologija i patomorfologija ataksije-teleangek- tazii prikazane putem unošenja u ESC abnormalnog genetičke informacije od miševa u himera odgovaraju onima kod ljudi. Nadalje, ataksija-teleangektazii koristeći PGCs i knockout miševa razvila eksperimentalni model, neki nasljedni homozigotni ljudskih bolesti povezanih s poremećajima ugljikohidrata i metabolizam lipida, katabolizam aminokiselina, uklanjanje bakra i bilirubin, što značajno povećava mogućnost eksperimentalnog lijeka za predkliničkom ispitivanju novih metoda liječenja relevantne bolesti osoba.

[12], [13], [14], [15]

Korištenje citohidrata matičnih stanica

Hibridni stanice dobivene taljenjem somatskih stanica iz hESCs, prikladne i obećavajući model za proučavanje matičnih stanica pluripotency i reprogramiranje diferenciranih stanica kromosoma. Tsitogibridy dobiven spajanjem ESC s diferenciranim stanicama odraslih životinja, pružiti priliku za proučavanje odnosa između genoma različitih „dobi”: razvija jedinstvenu situaciju u kojoj se homologni kromosomi potječe iz stanica različitih faza diferencijacije i različitim stupnjevima zrelosti, su u istoj jezgri, gdje oni mogu lako transdeystvuyuschimi podijeliti regulatorne signale. Teško je predvidjeti kako će reagirati tsisregulyatornye epigenetičko sustav homolognih kromosoma postojećih tijekom -in tira razvoj, kao odgovor na udar transdeystvuyuschih signale iz embrionalnih povezanih genoma. Osim toga, u hibridnim stanicama nastaje segregacija roditeljskog kromosoma koji omogućuje proučavanje interakcija genoma na zasebnoj razini kromosoma, tj, potencijalno utvrditi dio specifičnih kromosoma u održavanju pluripotency ili naprotiv, izlaz u diferencijaciji.

Kao prvi eksperimentalni model za proučavanje interakcija genoma različitih „povijesti razvoja” koristi tsitogibridy dobiti spajanjem teratokartsinomnyh pluripotentne i diferencirane somatskih stanica. U nekim slučajevima, takve hibridne stanice zadržale su pluripotentna svojstva na dovoljno visokoj razini. Posebno, in vivo teratokarcinoma-somatske hibridne stanice inducirale su razvoj istinskih teratomas koje sadrže derivate svih tri germinalnog lima, a in vitro embrioidna tijela nastala su u kulturama suspenzije. Čak iu interspecifičnim citohybridima ovog tipa, embrionalni antigeni su zabilježeni u slučajevima kada su somatski partneri u fuziji sa stanicama teratokarcinoma imali limfocite ili timocite. Važno je napomenuti da su cito-hibridi stvoreni spajanjem stanica teratokarcinoma s fibroblastima odgovaraju fibroblastima prema fenotipu.

Najvažnije je da je utvrđena činjenica da se u-teratokartsinomno somatske hibridne stanice pojavio putokaz genoma reprogramiranje diferenciranih stanica, karakterizira reaktivacije pojedinih gena ili neaktivne X kromosoma somatskog partnera. Dakle, rezultati studija o citohybrididima kao što su teratokarcinoma-somatske stanice pokazuju da hibridne stanice često zadržavaju pluripotenciju i postoje znakovi reprogramiranja genoma somatskog partnera.

U pokusima za dobivanje embrija unutarvrsni hibridnih stanica fuzijom splenocita sa mišem ESCs odrasle životinje su se karakteristike kao tsitogibridov, razdvajanje analize roditeljskih kromosoma i ocijeniti pluripotency hibridni genoma. Za međuvrsni hibridnih stanica koje proizvode stanice teratokarcinoma fuzijskih s somatskih stanica, uglavnom karakterizira niskoj segregaciji kromosoma s Tetraploid ili blizu Tetraploid kariotipa. Slična kromosomska kompozicija zabilježena je u cytohybridu spajanjem primarnih spolnih stanica s limfocitima. U isto vrijeme, međuvrsni hibridne stanice dobivene kao rezultat spajanja miša limfocitne stanice teratokartsinomnyh kanadska kuna, bilo je intenzivno segregaciju kromosoma somatskih partnera.

Jedno kvalitativno nova faza u istraživanju segregacije roditeljskih kromosoma međuvrsni hibrida čak nakon razvoja mikrosatelitskih metoda analize pomoću lančane reakcije polimeraze, pri čemu je svaki miš kromosom nađeno nekoliko stotina markera igrač pouzdano razliku između bilo kojeg para homolognih kromosoma u hibridnim stanicama.

Spajanjem ESK (koristeći HM-1 stanice, deficijentne na gipoksantinfosforiboziltransferazy aktivnosti 2n = 40, XY, izoliran iz blastociste mišjeg soja 129 / 01A) s splenocita iz miševa srodni linije DD / c uspio primiti skup hibridnih klonova morfološki imao sličnost hESCs. Svi klonovi se izoliraju na selektivni medij, u kojem je moguće rast samo s aktivnim gipoksantinfosforiboziltransferazoy stanica. Elektroforetski analiza pokazala prisutnost klonove alelnu varijantu gipoksantinfosforiboziltransferazy karakteristika miševi DD / c. Koristeći citogenetskom analizom utvrđeno je da su četiri imala tri hibridni klonovi okolodiploidny set kromosoma. Jedan blizu tctraploidna klon sadržane dvije populacije hibridnih stanica, od kojih je jedan bio tctraploidna, a drugi, manji - diploidne.

Analiza mikrosatelitne čime diskriminirati bilo koji par homolognih kromosoma miš 129 / 01A i DD / c, u hibridnim klonova s okolodiploidnym skupa pokazali da klonovi došlo u dva različita preferencijalno eliminacije autosoma somatskog partnera. Većina autosomno klonovi HESS2 i HESS3 imao markeri linija 129 / 01A, tj pluripotentne partnera. Izuzetak je kromosom 1 i I: klonovi HESS2 i HESS3, zajedno s oznakama iz HM-1 stanica, mali broj markera prisutne somatske partnera. Ovi rezultati mogu odražavati nepotpunu segregaciju kromosoma 1 i i somatske partnera te su u skladu s citogenetskog podataka koji trisomija kromosoma koji se javlja u 30-40% HESS2 i staničnih klonova HESS3. HESS4 klon se razlikuju značajno u kromosomskim sastava: mnogo autosomni kromosomi Ovaj klon potječu iz genoma ESK (kromosoma 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 i 17), ali kromosomi 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 i 19 bili su zastupljeni homologima oba roditelja. Kvantitativni odnos mikrosatelitni markera ove homolognih kromosoma odgovara približno 1: 1. To je omogućilo autori sugeriraju da je jedan homologni je izvedena iz genoma ESC, a drugi - od diferenciranih stanica. U nekim supklonovima klon HESS4 promatrati samo prisutnost token kromosoma 18 i 19 somatskog partnera. Rezultati pokazuju da stanice klon HESS4, osim segregacije kromosoma somatskih partnera, bilo je uklanjanje jednog ili oba homolozi gore kromosoma pluripotentno genoma, odnosno došlo je do obostranog segregaciju kromosoma oba roditelja - fenomen je prilično neobično, jer tsitogibridov karakteristika segregacija kromosoma samo jedan od roditelja.

Osim toga, nakon 20. Prolazu, svi klonovi hibridnih stanica sadrže samo X kromosoma markere somatske partnera, to jest, u klonova je zamijenio X kromosoma ESC na X kromosomu somatske partnera. To je potvrđeno in situ hibridizacijskim podacima korištenjem FITC-označenog sonda specifičnog za mišji X-kromosom: pozitivni signal detektiran je samo na jednom kromosomu. Treba napomenuti da su u ranijim fazama uzgoja (do 15. Prolaza), prema citogenetskim podacima, u mnogim stanicama postojala dva X-kromosoma. Kao posljedica toga, upotreba selektivnih medija omogućuje manipulaciju kromosomskom sastavu hibridnih stanica i selektivno ciljanje klonova koji nose pojedinačne kromosome od somatskog partnera na pozadini ESC genoma.

Kao jedinstvena značajka genoma tsitogibridov je lokalizacija roditeljskih genoma u jednoj jezgri, naravno, postavlja pitanje održavanja svojstava pluripotentne embrionalni genom ESC-somatskih hibrida stanica u uvjetima bliskom kontaktu s genom diferenciranih stanica. Morfološki je citohybrid ESC i somatskih stanica sličan roditeljskoj liniji ESC-a. Kvalifikacija pluripotency je pokazala da su svi klonovi okolodiploidnym set kromosoma su u stanju formirati u suspenziji kulture embryoid tijela u kojima se derivati tri sloja klica prisutan.

Većina hibridnih stanica sadržavala je ECG-7 antigen, marker karakterističan za rane zametke miševa, a također je imao visoku aktivnost alkalne fosfataze. Najskuplji podaci o visokim pluripotentnim svojstvima hibridnih stanica dobiveni su u pokusima kako bi se dobilo niz injekcijskih kimera koje uključuju hibridne stanice klon HESS2. Analiza biokemijskih markera pokazala je da su potomci donorskih hibridnih stanica bili u većini himera tkiva. Stoga, hibridne stanice dobivene fuzijom ESC i somatskih diferenciranih stanica zadržavaju pluripotenciju na visokoj razini, uključujući sposobnost stvaranja himera kada se umetnete u blastocističku šupljinu.

Klonovi HESS2 i HESS4 značajno su se razlikovali u sastavu roditeljskih kromosoma, ali imali su slična svojstva pluripotentnosti. Moglo bi se vjerovati da pluripotentnost u hibridnom genomu se očituje kao dominantna značajka, ali moguće je da svi kromosomi embrijskog genoma nisu uključeni u proces održavanja pluripotentnosti. Ako je ova pretpostavka točna, može se očekivati da uklanjanje nekih kromosoma pluripotentnog partnera iz genoma hibridoma neće biti popraćeno promjenom pluripotentnog statusa. U ovom slučaju, analiza segregacije roditeljskih kromosoma u embrionalnim hibridnim stanicama omogućit će bliski pristup identifikaciji kromosoma odgovornih za kontrolu pluripotentnosti embrionalnih stanica.

Serov O. Et al (2001) su utvrdili među potomstvom 50 dobiven iz križevima je kimerama s normalnim miševima, one koje će imati genotip miševe 129 / 01A i nosi X kromosoma DD miševa. Autori vide razlog za to u smanjenju pluripotentnosti u hibridnim stanicama pod utjecajem somatskog genoma. Alternativno objašnjenje može biti negativni učinak trisomije na neke autosome i neravnoteže u spolnim kromosomima (XXY su promatrane u stanicama do 15. Prolaza) u hibridnim stanicama kada su prolazili pokraj meioze. Poznato je da stanice XXY ne mogu proći kroz meiozu i oblikovati gamete. Trisomija je također u stanju uzrokovati smanjenje proliferativne aktivnosti hibridnih stanica, zbog čega selektivna prednost u razvoju kimera može pripadati stanicama embrija primatelja. Iz toga slijedi da za adekvatnu procjenu pluripotentnog potencijala hibridnih stanica, potrebno je dobiti hibridne klonove s normalnim diploidnim skupom kromosoma.

U pokusima Serova O. Et al (2001), prvi su demonstrirali mogućnost reprogramiranja X kromosoma u genom stanice somatskih hibridne stanice. Ovaj zaključak slijedi iz autori analizu ekspresije gena himera HPRT (marker X-kromosom): prisutnost alelne varijante HPRT DD / c miševa je detektirana u svim analiziranim tkivima kimerni. Treba naglasiti da je nakon uvođenja hibridnih stanica u blastociste šupljine tsitogibridy spadaju u neselektivnim uvjetima i očuvanje X kromosoma u genom hibridnih stanica znači da je postao obligatno komponenta njegovog genoma i to ne pravi razliku od Y kromosom pluripotentno partnera.

Rezimirajući rezultate analize interakcije somatske i pluripotentno embrionalnog genoma u hibridnim stanicama, autori zaključuju da u određenom tsitogibridah pluripotency pojavljuje kao dominantna osobina. Hibridni gen sposoban pojedinih kromosoma reprogramirati diferencirane stanice, koja, međutim, ne isključuje obrnuti utjecaj na somatske genoma pluripotency od embrionalnog genoma. U kultiviranju hibridnih stanica, indukcija diferencijacije događa se mnogo češće nego u izvornoj liniji roditelja ESC NM-1. Sličan učinak opažen je u formiranju primarnih kolonija: mnoge primarne kolonije embrionalnih hibridnih stanica razlikuju se u ranim fazama formiranja s velikim gubitkom klonova tijekom njihovog odabira i množenja.

Dakle, citokineti koji nastaju spajanjem ESCs s somatskim stanicama, usprkos bliskom kontaktu s genom diferenciranih stanica, čuvaju pluripotenciju kao jedinstvenu osobinu embrijskog genoma. Štoviše, u takvim hibridnim stanicama moguće je reprogramirati pojedinačne kromosome koji potječu od difuznih stanica. Ostaje nejasno koliko potpuno pluripotentna svojstva genoma embrija u hibridnim stanicama ustraju, osobito, njihovu sposobnost sudjelovanja u formiranju embrionalnog putanja u kimerama. Zbog toga je potrebno dobiti embrionalne hibridne stanice s normalnim kariotipom. U svakom slučaju, pluripotentne embrionalne hibridni stanice mogu biti pravi model za genetičku identifikaciju kromosoma koji su uključeni u održavanje pluripotency ili njezine kontrole kao bilateralna segregacija roditeljskih kromosoma potencijalno pruža takvu priliku.

Ni manje atraktivan je proučavanje fenomena, koji O. Serov i koautori (2001) definiraju kao "kromosomsku memoriju". U hibridnom genoma homolognih kromosoma su dva alternativna oblika: homologe somatske partner jednom doživjela diferencijacije, dok homologa pluripotentno partnera, taj proces je tek početak. Dakle, održavanje visoke pluripotentne svojstva hibridnih stanica ukazuje na to da „pluripotentne” konfiguracije homologa ESC prilično stabilni u hibridnim genoma, unatoč utjecaju transdeystvuyuschih faktora proizlaze iz somatske partnera. Gore opisane značajke reprogramiranja razlikuju homologna genoma kromosoma tijekom razvoja himera ne isključuje mogućnost da su prve faze stvaranja in vitro i uzgoju tsitogibridov oni zadržavaju svoj status stekli tijekom diferencijacije in vivo. Prema posljednjim podacima, kada prijenos embrija hibridne stanice u neselektivnom mediju u kojem je intenzivan samo otklanjanje kromosoma somatskih partner, tj genom hibridnih stanica lako razlučuje homolozi nakon in vitro kulture 10-15 pasaža. Dakle, embrionalne hibridne stanice predstavljaju obećavajuću eksperimentalni model za proučavanje ne samo od temeljnih svojstava embrionalnog genoma kao pluripotency, ali i njegove alternative - embrionalne diferencijaciju.

Terapijska učinkovitost transplantacije embrijskih matičnih stanica

Prije analize terapijske učinkovitosti ESC transplantacije i njihovih derivata, sažetak gore navedenog materijala. Značajke ESC u smislu pune provedbe embriogeneze in vitro su nedovoljni zbog nedostataka u ovom slučaju zbog izostanka mezenhimalnih matičnih stanica koje se događaju u tijelu samostalno i neovisno od hESCs. Genetska snaga ESC-a je manja od genetskog potencijala zigota, stoga se ne koristi izravno za kloniranje embrija. Jedinstveni biološki potencijal ESC-a kao jedine stanice u kojima se razvojni programi distribuiraju u punom slijedu nalaze se u istraživanjima o funkciji gena. Pomoću ESC-a dešifriraju se prve kombinacije signala koji aktiviraju ekspresiju ranih i kasnih gena koji kodiraju razvoj tri embrionalne ploče. Očuvanje genoma pluripotency od ESCs in vitro ih čini jedinstveni alat za popravak regeneracije koji može automatski kompenzirati stanica gubitaka oštećenih organa i tkiva. U idealnom hipotetski izvedbe može se pretpostaviti da je „... U transplantaciji donatorskih PGCs u organizam primatelja prenose kompaktno zapakirane programe koji pod povoljnim uvjetima ostvaruju se u izgradnju novog tkani'7 sposoban” ... Učinkovito integriran u tijelo primatelja, kao morfološka, i funkcionalne i funkcionalne. "

Naravno, nakon razvoja metoda za monodifferentiation ESC, započeo je in vivo ispitivanje funkcionalne aktivnosti stanica dobivenih in vitro od jednog specijaliziranog klona. Proliferacijski ESO klon generira populacije migrirajućih progenitorskih stanica koje su stvarno sposobne aktivno integrirati u zonu oštećenja tkiva primatelja, koji se koristi u regenerativno-plastičnoj medicini. Utvrđeno je da transplantacija Dopa-neurona u substantia nigra smanjuje kliničke manifestacije u eksperimentalnom hemiparkinsonizmu. Regionalni transplantati donorskih neuronskih matičnih stanica smanjuju stupanj poremećaja motora uzrokovanih traumom ili kontuzija leđne moždine i mozga. Primljeni i prvi pozitivni rezultati transplantacije matičnih stanica u demijelinizacijskim bolestima. Čini se da regenerativno-plastične snage ESC-a otvaraju neograničene mogućnosti korištenja stanične transplantacije u praktičnoj medicini. Međutim, kada se transplantiraju u ektopične zone, ESC se neizbježno pretvaraju u tumore. Kada se formiraju subkutane injekcije ESC u imunodeficijentnim miševima. Kada presađivanja ispod kapsule razmuljivanja ESK testise u sinergičkih miševa načinjen teratoma koja se sastoji od različitih tkiva, stanice koje su derivati sva tri sloja klica. U takvim teratomama, procesi smanjene organogeneze su vrlo rijetki.

Brojni radovi daju informacije o pozitivnim rezultatima presađivanja ranih derivata ESCO-a na životinje s bivšom perifernom patologijom. Stanica neurotransplantation koristeći derivate PGCs dalje razvija u eksperimentu i prvih kliničkih ispitivanja o korekciji funkcionalnih poremećaja mozga i leđne moždine, traume liječenje siringomijeliju i multiple skleroze (Repin, 2001). S pojavom tehnologije neyronogeneza ESCs in vitro, umjesto korištenja embrionalnom tkivu mozga transplantacije razvijene derivate neurosfera, dobivene iz kulture embrionalnog živčano tkivo. Takve suspenzije transplantacije su puno homogene i sadrže predanse neurona i neuroglie.

Osim regularnom mediju za kulturu s retinoičnom kiselinom u dozi od 10 ug / ml u trajanju od 6 tjedana u embrionalne linije (teratoma) NTERA-2 humanog -kartsinomy nastaje više od 80% nakon mitotičkih neurona. Potpuna homogenost neurona stanovništva postiže se protok sortiranje označene immunophenotypic markere zrelih neurona koje se mogu dobiti osloboditi od ostataka teratokartsinomnyh i nezrelih stanica. Nakon transplantacije u različitim regijama mozga pokusnih životinja takvi neuroni ne samo preživjeti, već ugrađen u regionalnim neuronskim mrežama. U životinja s eksperimentalnim modelima lokalnih nedostataka CNS neurotransplantation smanjuje kliničke manifestacije ljudske patologije, kao što su učinci kraniocerebralne traume, moždanog udara, bolesti demijeliniziranja, nasljednim defektima cerebralne razvoja, bolesti taloženja lipida i polisaharida.

Kako bi se optimizirali regeneracijski procesi u degenerativnim bolestima središnjeg živčanog sustava, razvijaju se tehnologije za pripremu oligodendrocitnih produkata mijelina iz ESK. Prva faza tradicionalno uključuje proliferaciju ESC-ova s umnožavanjem broja stanica potrebnih za transplantaciju. U drugoj fazi, provodi se usmjerena diferencijacija stanica u populaciju mišinskih oligodendrocitnih prekursora koji se kontroliraju selektivnim markerskim antigenima.

Neki izgledi su otvoreni za korištenje izvedenica ESCs razviti metode za korekciju imunodeficijencije uzrokovan genetskim defektima u sazrijevanju timus. U ispitivanjima na knockout (rag 1) miševi s induciranim defekt gena - povreda rekombinacije mehanizam V (D) J gen loci TCR, što dovodi do gubitka funkcije T-limfocita, transplantacijskih rane derivate PGCs u timus životinji oporavi sazrijevanje normalne populacije imunosnih klonova odgovornih za stanični imunitet. Klinička ispitivanja transplantacije preoblikovane in vitro hESCs za liječenje fatalnu nasljedne anemije u djece.

Prigovori na brzo uvođenje transplantacije matičnih stanica u kliniku opravdani su ograničenim brojem stabilnih linija ljudskih embrionalnih matičnih stanica i potrebe za njihovom standardizacijom. Kako bi se povećala čistoća standardiziranih ESC linija, kao i odraslih matičnih stanica, predložena je metoda odabira linija na temelju molekularne genetske analize kratkih tandemskih ponavljanja DNA. Također je potrebno testirati ESC linije za prisutnost malih kromosomskih preuređivanja i genetskih mutacija, potencijalna mogućnost njihove pojave u uvjetima kultiviranja stanica je dovoljno visoka. Teza proširuje obvezno testiranje svojstava svih vrsta PGCs i regionalnih pluripotentne matične stanice, jer je njihova razmnožavanje in vitro može dovesti do novih osobina nije svojstvena embrionalnih matičnih stanica na konačni ili tkiva. Konkretno, pretpostavlja se da je dugotrajna uzgoj u medijima citokina Hess bliže tumorske stanice, jer se oni pojave slične promjene putevi koji reguliraju stanični ciklus sa stjecanjem sposobnosti za provedbu neograničen broj dioba stanica. Neki autori, na temelju potencijala za razvoj tumora, smatraju ljudsku transplantaciju ranih derivata embrionalnih matičnih stanica kao bezobzirnost. Po njihovom mišljenju, mnogo je sigurnije koristiti počinjene potomke ESC-a, tj. Linije predaka diferenciranih stanica. Međutim, još uvijek nije razvijena pouzdana tehnika dobivanja stabilnih ljudskih staničnih linija koja se razlikuju u pravom smjeru.

Tako je u literaturi sve više podataka o pozitivnom terapijskom učinku transplantacije humanih embrionalnih derivata matičnih stanica. Međutim, mnoga od tih djela podliježu reviziji i kritici. Neki istraživači vjeruju da su rezultati ranih kliničkih ispitivanja preliminarni i sugeriraju samo da matične stanice mogu imati blagotvoran učinak na klinički tijek bolesti. Stoga je potrebno dobiti podatke o dugoročnim rezultatima transplantacije stanica. Kao argument, dane su faze razvoja kliničke neurotransplantologije. Doista, u literaturi, u početku dominira objave visoke učinkovitosti transplantacija mozga fragmentima embrija u Parkinsonove bolesti, no tada je počeo da se pojave izvješća negira terapijski učinak zametka ili fetusa živčanog tkiva transplantirane u mozgu pacijenata.

Provedena prva klinička ispitivanja procjene sigurnosti transplantacije neuroblast - derivate PGCs NTERA-2 teratokarcinom, nezrele stanice koje proliferiraju u kulturi su podvrgnuti pohranu 100 milijuntina stanične mase. Dio tako dobivenog stanica je korištena za određivanje karakteristike staničnog fenotipa i nečistoća, kao i za testiranje potencijalnih onečišćenja virusa i bakterija. Od medij za kulturu je uklonjen i LIF dovodni sloj stanica strome i fetalnih stvoreni uvjeti za usmjerenu diferencijacije u hESCs neuroblasts s kombinacijom faktora rasta i citokina. Zatim su neuroblasti pročišćeni iz nezrelih stanica teratokarcinoma na razdjelniku stanica protoka. Nakon drugog pročišćavanja i karakterizacije fenotipa transplantiranih stanica neuroblasts (-10-12 milijuni) suspenzija pomoću posebnog šprice i mikrokanula stereotaxy i pod kontrolom CT injektira u nucleus basalis mozga pacijenata (u sedmom mjesecu nakon hemoragijski moždani udar). Nakon jedne godine transplantacije učinaka transplantacije neurona u zonu moždanog udara pokazalo je nuspojave i neželjene učinke. Polovica pacijenata doživjela je poboljšanje motoričke funkcije u razdoblju od 6 do 12 mjeseci nakon transplantacije. Pozitivni klinički su promjene prati porast dotoka krvi zoni udara nakon transplantacije stanica: srednja apsorpcija povećanja fluorescencije-obilježenog 2-dezoksiglukoze, prema emisijska tomografija pozitronske dosegla 18%, a kod nekih pacijenata - 35%.

Međutim, Američki nacionalni institut za zdravstvo proveo je neovisno istraživanje o kliničkoj učinkovitosti neurotransplantacije u bolesnika s Parkinsonizmom. Pacijenti u prvoj skupini bili su transplantirani s embrionalnim živčanim tkivom koja je proizvodila dopamin, dok je druga skupina pacijenata prolazila lažnom operacijom. Rezultati ukazuju na nulu kliničku učinkovitost takvog neurotransplantacije, unatoč činjenici da su embrionalni neuroni koji su dobivali dopamin preživjeli u mozgu primatelja. Štoviše, nakon 2 godine nakon transplantacije fetalnog živčanog tkiva u 15% bolesnika razvio uporni diskinezije, koja je odsutna u bolesnika u placebo skupini (Matične stanice: znanstveni napredak i smjeru daljnjih istraživanja Nac INST, zdravstva SAD-a ...). Promatranja daljnjeg razvoja bolesti u tim pacijentima se nastavljaju.

Neki autori pripisuju kontradiktorne literaturu o procjeni kliničkih podataka djelotvornost Neurotransplantation s drugačijim pristupom odabiru bolesnika skupine, neadekvatnog izbora objektivnih metoda za procjenu njihovog stanja i, što je najvažnije, različiti uvjeti razvoja fetusa živčanog tkiva i na različitim dijelovima mozga iz kojeg Tkanje se proizvodi u različitim veličinama transplantaciju i metodičke značajke operacije.

Treba napomenuti da se pokušava usmjeriti transplantacija pluripotentne embrionalnih matičnih stanica u striatalnog području mozga štakora s eksperimentalnim tijela gemiparkinsonizmom prati proliferaciju ESC i njihovu diferencijaciju u dopaminskih neurona. Mora se pretpostaviti da su novoformirane neuroni učinkovito ugrađen u neuronskom mrežom kao ESCs nakon transplantacije uočeno je korekcija anomalija ponašanja i motora asimetrija u apomorfmskim test. Istovremeno, neke životinje su umrle uslijed transformacije transplantiranih ESK u tumoru mozga.

Stručnjaci američke Nacionalne i medicinske akademije, stručnjaci National Institutes of Health smatra da je klinički potencijal hESCs zaslužuje ozbiljnu pažnju, međutim, inzistiraju na potrebi detaljnog proučavanja njihova svojstva, vjerojatnost komplikacija i dugoročne učinke u eksperimentima s odgovarajućim biološkim modelima ljudskih bolesti (Matične stanice i buduća regenerativna medicina Nacionalna akademija Press, matične stanice i buduće smjernice za istraživanje, Nat. Inst, Health USA).

S ove točke gledišta, važno je da se usporedna histološka analiza eksperimentalnog teratoma dobiti transplantaciju u testisa mulj PGCs s teratoma koje su se razvile zbog transplantacije ranom stadiju embrija, što je uključivalo prisutan ESC pokazali da ESK bez obzira na njihovo podrijetlo ili interakcije s te ili druge okolne stanice na isti način ostvaruju svoje tumorigenske potencijale. Pokazalo se da takvi teratoma imaju klonalne porijekla, kao što je od tumora ESCs može doći, koji se sastoji od derivata sva tri sloja klica (.Rega, 2001). Važno je napomenuti da kada su transplantirane u imunodeficijentne miševe kloniranih PGCs s normalnim kariotipa i formirana teratoma koja se sastoji od različitih tipova diferenciranih somatskih stanica. Ovi eksperimentalni podaci savršeni su dokaz klonalnog podrijetla teratoma. Iz perspektive razvojne biologije, oni sugeriraju da nije višekratnik broja angažiranih ishodišnih stanica i pluripotentno identiteta matičnih stanica je izvor diferenciranih derivata sva tri zametka slojeva, teratoma komponente. Međutim, u praktične rezultate transplantacije stanica ovih studija su, ako ne previsoki, a zatim znak upozorenja za potencijalne opasnosti, jer inokulacije ESC ili primordijalnih zametnih stanica u različitim tkivima odraslih imunodeficijentnih miševa neminovno uzrokuje razvoj tumora iz transplantiranih matičnih stanica. Neoplastični degeneracija ektopikalno presadili ESC pratnji pojavom satelitske populacija diferenciranih stanica - po djelomično razlikovati svakako ESCs i nezrelih klonovi posvećen linije. Zanimljivo je da su za transplantaciju hESCs u skeletnim mišićima stanica u blizini teratokartsinomnymi neurona formira češće. Međutim, u administriranje PGCs Mace jaje ili blastocista pratnji punoj integraciji u zametnih stanica bez stvaranja maligne stanice. U isto vrijeme ESC ugrađen u gotovo svim organima i tkivima embrija, uključujući i seksualno rudimentima. Takvi allofennye životinje su prvo dobiva podvrgavanjem teratokarcinom stanice 129 na ranoj fazi embrija, na 8-100 stanica. U allofennyh miševi populacije geterogenomnyh stanice izvedene iz donorske PGCs uvodi se u koštanoj srži, kože, crijeva, jetre i genitalija, koje omogućuje stvaranje u eksperimentu čak interspecijskim stanica himere. Manji vrijeme ranog embrija, to je veći postotak stanica kimerizacijom, najvišeg stupnja kimerizacijom promatrane u krvotvornog sustava, kože, živčanog sustava, jetre i tankog crijeva allofennogo embrija. U odraslom organizmu tkiva pristupačan kimerizaciju zaštićeni od izlaganja imunološkog sustava od primatelja gistogematicalkie barijera: transplantacije primordijalnog zametne stanice u testisima parenhima uz umetanjem donorske matičnih stanica u tkivo primatelja germenativny sloj. Međutim, ESC transplantacija u formaciji blastocista himcrna primordia genitalije s generacija donatora iskonsko zametnih stanica se ne pojavljuje. ESC pluripotency prilikom izrade posebne uvjete, a može se koristiti za kloniranje: ESC presađivanja miševi 8-16 stanica mišjeg embrija, naznačen time, da stanica mitoze tsitokalazinom blokiran pridonosi normalne embriogeneze s razvojem embrija donatora PGCs.

Prema tome, alternativa je transplantacija alogene ESC terapijskog kloniranja temelju somatskih stanica nuklearne transplantacije u izvađene oocita stvoriti unutarnju blastociste stanične mase od koje se zatim alocirani liniju genetski identičnih donatora PGCs somatski jezgri. Tehnički, ova ideja je moguće, budući da je mogućnost stvaranja hESC linija iz blastocista dobivenih nakon transplantacije somatskih jezgri u izvađene jajnu stanicu u više navrata pokazala je u pokusima na laboratorijskim životinjama (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Posebice u miševa homozigotni za mutacije rag2 fibroblaste dobiveni kultiviranjem potkožnim stanice tkiva su korišteni kao donori su jezgre transplantiraju u izvađene oocita. Nakon aktivacije, oociti „zigota” uzgajane do formiranja blastociste, iz stanične mase unutarnje je izolirana PGCs te ih se pusti u linija za mutirani gen nullizigotnyh stanica (rag2-/ +). Homolognom rekombinacijom u takvim ESC-ima ispravljena je mutacija jednog alelnog gena. U prvom nizu eksperimenata s hESCs rekombinantni gen dobiven embryoid tijela su pripravljeni, transfektirane stanice takvim rekombinantnim retrovirusa (HoxB4i / GFP), te nakon razmnožavanje u miševa vene rag2-/ ~. U drugoj seriji, tetraploidni blastomeri su agregirani s genetski modificiranim ESC i transplantirani na njihove ženske primatelje. Rođeni imunokompetentni miševi služili su kao donori koštane srži za transplantaciju u mutirane miševe. U obje serije, rezultat je bio pozitivan: 3-4 tjedna u svim miševima normalnih zrelih mijeloidne i limfne stanice su pronađeni u stanju proizvoditi imunoglobuline. Dakle, transplantacija u oocita jezgre somatskih stanica može se koristiti ne samo za proizvodnju hESC linije, ali i za tsitogenoterapii - Ispravak nasljednim poremećajima koriste ESC kao vektor za prijevoz ispravljanje genetske informacije. Ali u ovom smjeru transplantacije stanica, pored bioetičkih problema, postoje ograničenja. Nije jasno koliko je sigurno transplantacija će biti terapijski klonirati stanice s genotipom identičan genotipa određenog pacijenta, jer takve stanice mogu uvesti mutacije koje stvaraju predispozicije za određene bolesti. Normalni ljudski jaja ostaju nedostupni objekt, a čak i kada presađivanje somatske jezgre u izvađene životinjskog jajne stanice samo 15-25% projektirana „zigota” razvijaju na blastociste fazi. Nije određeno koliko je blastocista potrebno za dobivanje pojedinačne linije pluripotentnih kloniranih ESC. Treba napomenuti i visoku razinu financijskih troškova vezanih uz složenost metodologije terapijskog kloniranja.

Zaključno, u ESC pluripotency genoma hypomethylated DNA kombinirana s visokom aktivnošću telomeraze i kratke faze C ^ staničnog ciklusa, što osigurava intenzivni potencijalno beskonačnu množenje, tijekom koje se zadrže PGCs diploidnih kromosoma i „juvenilni” set fenotipskih osobina. Klonska rast PGCs u kulturi ne isključuje ih diferencirati u bilo specijaliziranih stanica organizma na proliferaciju stanica linije i dodavanjem odgovarajuće regulatorne signale. Ograničenje diferencijacija hESCs u skladu in vitro somatske stanice se ostvaruje bez sudjelovanja mezenhimu, zaobilazeći Nohteyaov je organogeneza i bez stvaranja embrija. Ektopična primjena ESC in vivo neizbježno dovodi do stvaranja teratokarcinoma. ESC transplantacija u blastociste ili ranom stadiju embrija u pratnji njihovom integracijom sa tkivima zametka i njegove stabilne kimerizacijom tijela.

Regenerativni i plastične tehnologije temeljene na transplantacije stanica je točka sjecište interesa članova stanične biologije, razvojne biologije, eksperimentalne genetike, imunologije, neurologiji, kardiologiji, hematoloških i mnogim drugim područjima eksperimentalne i praktične medicine. Najvažniji eksperimentalni rezultati dokazuju mogućnost reprogramiranje matičnih stanica sa smjerom promjene njihovih svojstava, što otvara perspektivu za kontrolu cytodifferentiation procese s faktorima rasta - za regeneraciju miokarda, obnovu CNS lezija i normalizaciju funkcije aparata otočića gušterače. Međutim, rasprostranjenog derivata transplantacije uvođenje ESC u medicinskoj praksi potrebno je ispitati svojstva ljudskih matičnih stanica u više detalja i daljnje pokuse s PGCs u eksperimentalnim modelima bolesti.

Bioetičkih pitanja i problem odbacivanja transplantata alogenoj mogao riješiti promatrane plastičnost genoma regionalnih matičnih stanica odraslih. Međutim, početni podatak je da kada presađivanje jetre izolirane i temeljito karakterizira autologne hematopoetskih stanica, od kojih su nove hepatocitima, s ugrađenim u jetri lobules, sada se pregledavaju i kritizira. Međutim, objavljeni podaci da transplantacija živčanih matičnih stanica u timusu je stvaranje novih klice donatora T i B-limfociti, i presađivanje živčanih matičnih stanica u mozgu u koštanoj srži dovodi do stvaranja hematopoetskih zametnih kontinuirana donorske mijeloidnih i eritropoeze , Prema tome, u odraslih organa mogu biti sačuvana pluripotentne matične stanice koje su sposobne genoma reprogramiranje ESC do kapaciteta.

Ljudski embrij ostaje izvor primanja ESC-a u medicinske svrhe, što predodređuje neizbježnost novo sjecišta moralnih, etičkih, moralnih, pravnih i vjerskih problema na mjestu rođenja ljudskog života. Otkriće ESC-a dali su snažan poticaj za nastavak grubih rasprava o tome gdje se nalazi linija između živih stanica i tvari, tvari i osobnosti. Istodobno, ne postoje univerzalne norme, pravila i zakoni koji se odnose na korištenje ESC-a u medicini, usprkos ponovljenim pokušajima njihovog stvaranja i prihvaćanja. Svaka država u svom zakonodavstvu rješava taj problem samostalno. S druge strane, liječnici iz cijelog svijeta i dalje pokušavaju razviti regenerativnu plastičnu medicinu izvan takvih rasprava, prvenstveno korištenjem ne-embrionalnih matičnih stanica i zaliha matičnih stanica odraslog organizma.

Neke od povijesti izolacije embrionalnih matičnih stanica

Terato- (embrija) stanice su izolirane iz -kartsinomnye spontano nastaju testisa soja teratoma Miš 129 / tert-Sv, spontani jajnika teratoma mišje linije Lt / Sv, od teratoma, ektopichno izvor su transplantirane stanice ili tkivo embrija. Među tako dobivenih stabilnih terato- linija mišjih embrija (stanice) -kartsinomnyh neki su pluripotentne, drugi su podvrgnute diferencijacije samo u stanicama jednog određenog tipa, a neki su uglavnom nesposobni cytodifferentiation.

U to vrijeme, fokus je bio istraživanje koje je pokazalo mogući povratak terato- (embrij) -kartsinomnyh stanice za normalan fenotip nakon njihovog uvođenja u embrionalnom tkivu u razvoju, kao i rad stvoriti in vitro genetski modificirane terato- (embrija) -kartsinomnyh stanica, uz pomoć kojih su mutirani miševi dobiveni za biološko modeliranje ljudske nasljedne patologije.

Korištena uvjetovana kultivacija suspenzije korištena je za izoliranje linija stanica teratoplanog karcinoma. U kulturi terato- (embrija) -kartsinomnye stanice, kao što su ESCs, rastu tvoreći embryoid tijela i zahtijeva da se prevesti u linije za vezanje disocijacije održavanje pluripotency na umetanje sloja embrionalnih fibroblasta ili suspenzije kultivaciju u održavanoj podlozi. Terato- pluripotentne stanice (embrija) - karcinom velikih linija, sferni, imaju visoku aktivnost alkalne fosfataze, obliku agregata i sposobni višesmjerna diferencijacije. Kada je uvedena u blastocistu agregirani s morulae, što je rezultiralo u formiranju kimernih embrija u raznim organima i tkivima koja su derivati nalaze terato- (embrija) -kartsinomnyh stanice. Međutim, velika većina takvih himcrna embrija umre u maternici, au organima preživljavanje himera novorođene strane stanice i rijetko otkrije s niskom gustoćom. Istovremeno je incidencija tumora (fibrosarkoma, rabdomiosarkom i drugih vrsta malignih oteklina i adenoma pankreasa) oštro povećava i neoplastičnim degeneracije često događa iu maternici himcrna embrija.

Većina terato- (embrij) -kartsinomnyh stanica u mikro okruženju normalnih embrionalnih stanica gotovo prirodno postaje maligne neoplastične karakteristike. Smatra se da je nepovratan maligne bolesti je uzrokovana aktivacijom proto-onkogena u procesu strukturnih pregradnje. Jedini izuzetak su stanične linije embriokartsinomnoy SST3, teratom izvedene iz mišjeg testisa (linija 129 / Sv-ter), koji pokazuju visoku mogućnost integracije u tkiva i organa fetusa bez naknadnog formiranja tumora kod kimernih miševa. Izvedeni terato- (embrij) -kartsinomnyh stanične linije na miševima himera gotovo ne sudjeluju u formiranju osnovnih gonocytes. Očito je povezana s visokom učestalošću kromosomskih aberacija zajedničkih većini terato- (embrija) -kartsinomnyh linije u kojem se stanice promatrati kao aneuploidije ili kromosomske anomalije.

Nekoliko stabilnih linija terato- (embrija) -kartsinomnyh humanog je pripremljena pod laboratorijskim uvjetima, naznačen time, pluripotency visoko proliferativno djelovanje i sposobnost diferencijacije u kulturi tijekom rasta. Konkretno, linija ljudskih stanica teratog-embrij karcinoma NTERA-2 korištena je za ispitivanje mehanizama neuronskog citodiferencijacije. Nakon transplantacije stanica ove linije u subventrikularnu regiju prednjeg dijela novorođenčadi, promatrana je njihova migracija i neuronska proizvodnja. Bilo je čak pokušaja da presaditi neurona terato- dobivene uzgojem stanica (embrij) -kartsinomnoy liniju NTERA-2, u bolesnika s potezima, koji su, prema autorima, što dovodi do kliničkog poboljšanja bolesti. U ovom slučaju malignosti terato- transplantirane stanice (embrij) -kartsinomnoy linija NTERA-2 u bolesnika s moždanim udarom su navedeno.

U prvom retku nediferenciranih pluripotentne embrionalnih matičnih stanica miševa u ranim 80-ih godina prošlog stoljeća dobio Evansa i Martina, tako da ih odaberete iz stanične mase unutarnje jedne blastociste - zametka. Izolirani PGCs linija za dugo vremena zadržavaju pluripotency i sposobnost da se diferenciraju u različite vrste stanica pod utjecajem faktora posebnom mediju za kultivaciju.

Pojam „embrionalnih pluripotentne matične stanice” pripada Leroy Stevens da ispitivanje duhana katrana utjecaja na učestalost razvoja tumora skrenuo je pozornost pojave spontane testisa teratokarcinom linearnih (129 / v) kod miševa kontrolne skupine. Testisa teratokarcinom stanice su karakterizirane visokom stopom proliferacije, i u prisutnosti tekućine lijevo u trbušnu šupljinu sa formiranjem spontanog diferencijacije neurona, keratinocita, kondrocitima, kardiomiocitima, kao i kose i koštanih ulomaka, ali bez naznaka redoslijedu cytoarchitectonics prikladno tkiva. Kada sadnju u kulturi stanica narasla teratokarcinom nevezan u donju pluripotentnih klonova i nastale embryoid tijela se zatim zaustavi i podvrgnuti spontane fisije neuredno diferenciraju u glija neurona, mišićnih stanica, te kardiomiocitima. Stevens otkrili da teratokarcinom miš 129 / v sadrži manje od 1% stanica sposobnih za razlikovanje u različitim specijaliziranim somatske linije, a sama razlikovanje ovisi o čimbenicima koji na njih utječu (sastav peritonealna tekućina proizvoda dodan u kulturu zrelih stanica ili tkiva). Leroy Stevenson pretpostavka o prisutnosti među teratokarcinom stanica embrionalne ishodišne seksualne zametne stanice je potvrđeno: suspenzija zametka predimplantacijsku zameci stanica u odraslih miševa tkiva formirane teratokarcinom i odvojio od njih čistih linija stanica nakon intraperitonealnog davanja primatelja životinje su diferencirani u neurone, kardiomiocitima i druge somatske kletki derivati sva tri sloja klica. U pokusima in vivo transplantacije ESK (dobiven iz zametka ali ne trofoblasta) u mišjih zametaka, na različitim stupnjevima linije 8-32 blastomera bila rađanja kimernog životinje (bez stvaranja tumora) u organima koji detektira klice donorsku tkiva. Himerizam zabilježeno je čak u liniji spolnih stanica.

Primarna ishodišne zametne stanice izolirane iz mišjeg embrija klica spolu, morfologiju, imunološke fenotipa i funkcionalnih svojstava u skladu s dobivenim iz hESCs teratokarcinom Stevenson i zametka. Pri himera rođene nakon davanja hESCs u blastocistu, allofenny organa morfogeneza naznačen mozaik izmjenični donora i primatelja strukturne i funkcionalne jedinice jetre, pluća i bubrega. U mnogim slučajevima je zapaženo stvaranje crijevnih kriptova ili lobula jetre, koji se sastojao od istodobno primatelja i donorskih stanica. Međutim, provedba morfogeneze uvijek dogodila na genetskom programu obliku, koji pripada primatelju, a himerizam je ograničena na staničnoj razini.

Zatim, utvrđeno je da je proliferacija hESCs bez cytodifferentiation na hranjivi sloj izveden iz mezenhimalnih stanica (fetalni fibroblasti) javlja u nazočnosti LIF vezanja na selektivnim hranjivim medijima koji selektivno daju samo preživljavanje matičnih i ishodišnih stanica, dok je većina od specijaliziranih staničnih elemenata umire. Uz pomoć ovih tehnika je 1998. Godine James Thomson je izdvojeno pet besmrtne linije embrionalnih matičnih stanica iz stanične mase unutarnje jedne blastociste osobe. Iste godine, John Gerhart je razvio metodu za izoliranje besmrtne ESC linije od seksualnog dašak četiri do pet tjedana ljudskih embrija. Zbog svojih jedinstvenih svojstava, samo dvije godine kasnije embrionalnih matičnih stanica i matičnih stanica definitivni tkivo je počeo da se koristi u praksi regenerativne medicine i genske terapije.