Mezenhimalne matične stanice

Među regionalnim matičnim stanicama posebno mjesto zauzimaju mezenhimalne matične stanice (MSC), čiji derivati čine stromalnu matricu svih organa i tkiva ljudskog tijela. Prioritet u istraživanju MSC-a pripada predstavnicima ruske biološke znanosti.

Sredinom prošlog stoljeća u laboratoriju A. Friedensteina prvi put je izolirana homogena kultura multipotentnih stromalnih matičnih stanica koštane srži. Mezenhimalne matične stanice pričvršćene na supstrat dugo su održavale visoki intenzitet proliferacije, a u kulturama s niskom gustoćom sjetve nakon fiksacije na supstrat formirale su klonove stanica sličnih fibroblastima koje nisu imale fagocitnu aktivnost. Prestanak proliferacije MSC-a završio je njihovom spontanom diferencijacijom in vitro u stanice kostiju, masti, hrskavice, mišića ili vezivnog tkiva. Daljnja istraživanja omogućila su utvrđivanje osteogenog potencijala stanica sličnih fibroblastima strome koštane srži različitih vrsta sisavaca, kao i njihove aktivnosti stvaranja kolonija. In vivo eksperimenti pokazali su da i hetero- i ortotopska transplantacija stanica sličnih fibroblastima koje stvaraju kolonije rezultira stvaranjem koštanog, hrskavičnog, vlaknastog i masnog tkiva. Budući da se stromalne matične stanice koštane srži karakteriziraju visokim kapacitetom samoobnavljanja i višestrukom diferencijacijom unutar jedne stanične linije, nazivaju se multipotentnim mezenhimalnim progenitorskim stanicama.

Treba napomenuti da su tijekom 45 godina temeljnih istraživanja mezenhimalnih matičnih stanica stvoreni stvarni uvjeti za primjenu njihovih derivata u kliničkoj praksi.

Danas nema sumnje da se sva tkiva ljudskog tijela formiraju iz matičnih stanica različitih staničnih linija kao rezultat procesa proliferacije, migracije, diferencijacije i sazrijevanja. Međutim, do nedavno se vjerovalo da su matične stanice u odraslom organizmu tkivno specifične, tj. sposobne su proizvoditi linije specijaliziranih stanica samo onih tkiva u kojima se nalaze. Ovaj konceptualni stav opovrgnut je činjenicama transformacije hematopoetskih matičnih stanica ne samo u stanične elemente periferne krvi, već i u ovalne stanice jetre. Osim toga, pokazalo se da su neuralne matične stanice sposobne dati i neurone i glialne elemente, kao i rano posvećene linije hematopoetskih progenitorskih stanica. S druge strane, mezenhimske matične stanice, koje obično proizvode stanične elemente kostiju, hrskavice i masnog tkiva, sposobne su transformirati se u neuralne matične stanice. Pretpostavlja se da se u procesu rasta, fiziološke i reparativne regeneracije tkiva, nepredane progenitorske stanice stvaraju iz tkivno nespecifičnih matičnih rezervi. Na primjer, popravak mišićnog tkiva može se ostvariti migracijom mezenhimalnih matičnih stanica iz koštane srži u skeletne mišiće.

Iako takvu međusobnu zamjenjivost matičnih stanica ne prepoznaju svi istraživači, mogućnost kliničke upotrebe mezenhimalnih matičnih stanica kao izvora za transplantaciju stanica i staničnog vektora genetskih informacija više nitko ne osporava, kao ni multipotentnost stromalnih matičnih stanica koštane srži, koje se relativno lako mogu izolirati i proširiti u in vitro kulturi. Istodobno, u znanstvenoj literaturi i dalje se pojavljuju izvješća o potencijalnoj pluripotentnosti stromalnih matičnih stanica koštane srži. Kao dokaz navode se istraživački protokoli u kojima se, pod utjecajem specifičnih induktora transdiferencijacije, MSC transformiraju u živčane stanice, kardiomiocite i hepatocite. Međutim, neki znanstvenici imaju ozbiljne sumnje u mogućnost ponovljene aktivacije i ekspresije gena iz razdoblja rane embriogeneze. Istovremeno, svi razumiju da ako se pronađu uvjeti za proširenje multipotentnosti mezenhimalnih matičnih stanica na pluripotentnost ESC-a, mnogi etički, moralni, religijski i pravni problemi u regenerativnoj plastičnoj medicini automatski će se riješiti. Osim toga, budući da u ovom slučaju izvor regenerativnog matičnog potencijala postaju pacijentove autologne stromalne stanice, rješava se i problem imunološkog odbacivanja transplantirane stanice. Bliska budućnost pokazat će koliko su ti izgledi realni.

[ 1 ], [ 2 ]

Upotreba mezenhimalnih matičnih stanica u medicini

U klinici se upotreba derivata mezenhimalnih matičnih stanica prvenstveno povezuje s obnavljanjem tkivnih defekata koji nastaju kod opsežnih i dubokih termalnih lezija kože. U predkliničkoj fazi provedena je eksperimentalna procjena izvedivosti upotrebe alogenih mezenhimalnih matičnih stanica sličnih fibroblastima za liječenje dubokih opeklina. Pokazalo se da mezenhimalne matične stanice slične fibroblastima koštane srži tvore monosloj u kulturi, što omogućuje njihovu transplantaciju radi optimizacije procesa regeneracije dubokih opeklinskih rana. Autori napominju da embrionalni fibroblasti imaju slično svojstvo, ali njihova klinička upotreba ograničena je postojećim etičkim i pravnim problemima. Duboka termička opeklina s oštećenjem svih slojeva kože modelirana je na Wistar štakorima. Površina opekline iznosila je 18-20% ukupne površine kože. Prva eksperimentalna skupina uključivala je štakore s dubokom termičkom opeklinom i transplantacijom alogenih mezenhimalnih matičnih stanica sličnih fibroblastima. Druga skupina sastojala se od životinja s dubokom termičkom opeklinom i transplantacijom alogenih embrionalnih fibroblasta. Treću skupinu predstavljali su kontrolni štakori s dubokom termičkom opeklinom koji nisu podvrgnuti staničnoj terapiji. Suspenzija mezenhimalnih matičnih stanica sličnih fibroblastima i embrionalnih fibroblasta nanesena je na površinu opekline pomoću pipete u količini od 2 x 10⁴ ^.stanice 2. dana nakon modeliranja opekline i izrezivanja nastale nekrotične kraste. Nakon transplantacije stanica, površina opekline prekrivena je gazom navlaženom izotoničnom otopinom natrijevog klorida s gentamicinom. Stanice koštane srži prikupljene su kako bi se dobile MSC-ove s njihovom naknadnom indukcijom u liniju mezenhimalnih matičnih stanica sličnih fibroblastima iz odraslih Wistar štakora iz femura. Embrionalni fibroblasti dobiveni su iz pluća embrija starih 14-17 dana. Embrionalni fibroblasti i stanice koštane srži za dobivanje MSC-ova prethodno su uzgajani u Petrijevim zdjelicama na temperaturi od 37°C u CO2 inkubatoru, u atmosferi s 5% CO2 pri 95% vlažnosti. Embrionalni fibroblasti uzgajani su 4-6 dana, dok je za stvaranje monosloja MSC-ova bilo potrebno od 14 do 17 dana. Nakon toga, MSC su krioprezervirane kao izvorni materijal za mezenhimalne matične stanice slične fibroblastima, koje su dobivene odmrzavanjem i kultiviranjem MSC-a tijekom 4 dana. Broj nastalih mezenhimalnih matičnih stanica sličnih fibroblastima bio je više od 3 puta veći od broja embrionalnih fibroblasta nastalih tijekom istog razdoblja kultivacije. Kako bi se identificirale transplantirane stanice u opeklinskim ranama u fazi kultivacije, njihov genom je označen pomoću virusnog shuttle vektora na bazi rekombinantnog adenovirusa tipa V koji nosi gen 1ac-2 koji kodira E. coli ß-galaktozidazu. Žive stanice u različito vrijeme nakon transplantacije detektirane su imunohistokemijski u kriosekcijama s dodatkom X-Gal supstrata, koji daje karakterističnu plavo-zelenu boju. Kao rezultat dinamičke vizualne, planimetrijske i histološke procjene stanja opeklinske rane, utvrđeno je da se već 3. dana nakon transplantacije stanica pojavljuju značajne razlike u tijeku procesa rane u odabranim skupinama. Ta je razlika postala posebno izražena 7. dana nakon transplantacije stanica. Kod životinja prve skupine, kojima su transplantirane mezenhimalne matične stanice slične fibroblastima, rana je poprimila jednoliko intenzivnu ružičastu boju, granulacijsko tkivo je raslo po cijeloj površini do razine epiderme, a površina opekline značajno se smanjila. Kolageni film koji se formirao na površini rane postao je nešto tanji, ali je nastavio prekrivati cijelo područje opekline. Kod životinja druge skupine, kojima su transplantirani embrionalni fibroblasti, granulacijsko tkivo se podiglo do razine epiderme rubova rane, ali samo mjestimično, dok je plazmoreja iz rane bila intenzivnija nego u 1. skupini, a početno formirani kolageni film praktički je nestao. Kod životinja koje nisu primile staničnu terapiju, 7. dana opeklinska rana bila je blijeda, s rupicama, nekrotično tkivo prekriveno fibrinom. Plazmoreja je uočena po cijeloj površini opekline. Histološki, životinje 1. i 2. skupine pokazale su smanjenje stanične infiltracije i razvoj vaskularne mreže.i ovi znakovi početnog regenerativnog procesa bili su izraženiji kod štakora 1. skupine. U kontrolnoj skupini uočeni su znakovi stanične infiltracije rane, histološki uzorak novostvorenih žila bio je odsutan. Od 15. do 30. dana promatranja, površina opekline kod životinja 1. skupine bila je značajno manja nego kod štakora ostalih skupina, a granulirajuća površina bila je razvijenija. Kod životinja 2. skupine, površina opekline također se smanjila u usporedbi s veličinom opeklinskih rana kod štakora kontrolne skupine, što se dogodilo zbog marginalne epitelizacije. U kontrolnoj skupini, površina opekline ostala je blijeda na mjestima s rijetkim granulacijama, na njoj su se pojavile vaskularne zvjezdice, bili su otočići fibrinoznog plaka, umjerena plazmoreja se nastavila po cijeloj površini opekline, a na nekim mjestima ostala je krasta koju je bilo teško odvojiti. Općenito, kod životinja 3. skupine, veličina rane također se smanjila, ali rubovi rane ostali su potkopani.

Dakle, tijekom komparativne studije brzine zacjeljivanja rana korištenjem mezenhimalnih matičnih stanica sličnih fibroblastima i embrionalnih fibroblasta, kao i bez upotrebe stanične terapije, uočeno je ubrzanje brzine zacjeljivanja površine opekline kao rezultat transplantacije mezenhimalnih matičnih stanica sličnih fibroblastima i embrionalnih fibroblasta. Međutim, u slučaju korištenja alogenih mezenhimalnih matičnih stanica sličnih fibroblastima, brzina zacjeljivanja rana bila je veća nego kod transplantacije embrionalnih fibroblasta. To se izrazilo u ubrzanju promjene faza regenerativnog procesa - smanjeni su uvjeti stanične infiltracije, povećana je brzina rasta vaskularne mreže, kao i stvaranje granulacijskog tkiva.

Rezultati dinamičke planimetrije pokazuju da je stopa spontanog zacjeljivanja opeklinske rane (bez upotrebe stanične terapije) bila najniža. 15. i 30. dana nakon transplantacije alogenih mezenhimalnih matičnih stanica sličnih fibroblastima, stopa zacjeljivanja rane bila je veća nego kod transplantacije embrionalnih fibroblasta. Histokemijska metoda za detekciju beta-galaktozidaze pokazala je da nakon transplantacije mezenhimalnih matičnih stanica sličnih fibroblastima i embrionalnih fibroblasta, transplantirane stanice ostaju održive na površini i u dubini regenerirajućih rana tijekom cijelog razdoblja promatranja. Autori smatraju da je veća stopa regeneracije opeklinske rane uz upotrebu mezenhimalnih matičnih stanica sličnih fibroblastima posljedica oslobađanja biološki aktivnih faktora koji stimuliraju rast iz tih stanica tijekom procesa sazrijevanja.

Transplantacija auto- ili alogenih keratinocita i alogenih fibroblasta za liječenje opeklinskih rana također se koristi u kliničkoj praksi. Treba napomenuti da je kirurško liječenje djece s opsežnim dubokim opeklinama složen zadatak zbog visoke traumatičnosti i višestrukih kirurških zahvata, značajnog gubitka krvi i različitih reakcija na korištene infuzijske medije. Glavne poteškoće u izvođenju plastičnih operacija kože kod opsežnih dubokih opeklina, s površinom većom od 40% površine tijela, posljedica su težine stanja žrtava i nedostatka resursa donorske kože. Upotreba mrežastih transplantata s visokim koeficijentom perforacije ne rješava problem, budući da stanice nastale nakon perforacije epiteliziraju vrlo sporo, a sami kožni režnjevi često liziraju ili se isušuju. Takvi pokrovi za opeklinske rane poput ksenoskene, kadaveričnih alografta, sintetičkih filmskih pokrova nisu uvijek dovoljno učinkoviti, stoga se razvijaju nove metode pokrivanja površina opeklina slojevima kultiviranih keratinocita i fibroblasta. Posebno je predložena metoda pokrivanja površina opeklina uz pomoć kultiviranih alofibroblasta, koji, kada se transplantiraju, imaju izražen stimulirajući učinak na proliferaciju epidermocita sačuvanih u rani kod graničnih opeklina, kao i keratinocita u septama mrežastih transplantata. Rad L. Budkevicha i koautora (2000.) prikazuje rezultate korištenja ove metode za liječenje opeklina u djece. U studiju je uključeno 31 dijete s termičkom traumom u dobi od 1 godine do 14 godina. Kod troje djece ukupna površina opeklinskih rana stupnja IIIA-B - IV bila je 40%, kod 25 - 50-70%, a kod još troje - 71-85% površine tijela. Rana kirurška nekrektomija kombinirana je s transplantacijom kultiviranih alofibroblasta i autodermoplastikom. Prva faza liječenja uključivala je eksciziju nekrotičnog tkiva, druga faza uključivala je transplantaciju kultiviranih alofibroblasta na nosače filmova, a treća faza (48 sati nakon transplantacije kultiviranih alofibroblasta) uključivala je uklanjanje matrice i autodermoplastiku kožnim režnjevima s omjerom perforacije 1:4. Tri pacijenta primljena u kliniku s teškom opeklinskom bolešću imala su kultivirane alofibroblaste transplantirane na granulirajuće rane. Transplantacija kultiviranih alofibroblasta provedena je jednom kod 18 djece, dva puta kod 11 djece i tri puta kod dva pacijenta. Površina rane prekrivena staničnom kulturom kretala se od 30 do 3500 cm2. Učinkovitost kultiviranih alofibroblasta procijenjena je ukupnim postotkom prihvaćanja kožnog transplantata, vremenom zacjeljivanja opeklina i brojem smrtnih slučajeva od teške termičke traume. Prihvaćanje transplantata bilo je potpuno kod 86% pacijenata. Djelomično neprihvaćanje kožnih transplantata zabilježeno je u 14% slučajeva. Unatoč liječenju, šestero (19,3%) djece je umrlo. Ukupna površina oštećenja kože kod njih kretala se od 40 do 70% površine tijela.Transplantacija kultiviranih alofibroblasta nije bila povezana sa smrtnošću kod opeklina ni kod jednog pacijenta.

Analizirajući rezultate liječenja, autori primjećuju da su prethodno duboka termička oštećenja kože koja su pokrivala 35-40% površine tijela smatrana nekompatibilnima sa životom (za mlađu djecu - do 3 godine - duboke opekline koje pokrivaju 30% površine tijela su kritične, za stariju djecu - preko 40% površine tijela). Prilikom izvođenja kirurške nekrektomije s transplantacijom kultiviranih alofibroblasta i naknadnom autodermoplastikom kožnim režnjevima s visokim koeficijentom perforacije, opekline IIIB - IV stupnja ostaju kritične, ali trenutno postoje izgledi za spašavanje života čak i takvih žrtava u mnogim slučajevima. Kirurška nekrektomija u kombinaciji s transplantacijom kultiviranih alofibroblasta i autodermoplastikom kod djece s dubokim opeklinama pokazala se posebno učinkovitom kod pacijenata s raširenim kožnim lezijama s nedostatkom donorskih mjesta. Aktivna kirurška taktika i transplantacija kultiviranih alofibroblasta doprinose brzoj stabilizaciji općeg stanja takvih pacijenata, smanjenju broja zaraznih komplikacija opeklinske bolesti, stvaranju povoljnih uvjeta za prihvaćanje transplantata, smanjenju vremena obnove izgubljene kože i trajanja bolničkog liječenja, smanjenju učestalosti smrtnih ishoda kod žrtava s opsežnim opeklinama. Dakle, transplantacija kultiviranih alofibroblasta s naknadnom autodermoplastikom s kožnim režnjevima omogućuje oporavak kod djece s teškim opeklinama, koja su se prije smatrala osuđenima na propast.

Općenito je prihvaćeno da je primarni cilj liječenja opeklinske bolesti što potpunija i najbrža obnova oštećene kože kako bi se spriječili toksični učinci, infektivne komplikacije i dehidracija. Rezultati korištenja kultiviranih stanica uvelike ovise o spremnosti same opeklinske rane za transplantaciju. U slučajevima transplantacije kultiviranih keratinocita na površinu rane nakon kirurške nekrektomije, u prosjeku se 55% (po površini) transplantiranih stanica usađuje, dok se kod granulirajućih rana stopa usađivanja smanjuje na 15%. Stoga uspješno liječenje opsežnih dubokih opeklina kože zahtijeva, prije svega, aktivnu kiruršku taktiku. U prisutnosti opeklinskih rana IIIB-IV stupnja, površina opekline se odmah oslobađa nekrotičnog tkiva kako bi se smanjila intoksikacija i smanjio broj komplikacija opeklinske bolesti. Korištenje takve taktike ključno je za smanjenje vremena od trenutka primanja opekline do zatvaranja rana i duljine boravka pacijenata s opsežnim opeklinama u bolnici, a također značajno smanjuje broj smrtnih ishoda.

Prva izvješća o uspješnoj upotrebi kultiviranih keratinocita za prekrivanje opeklinskih površina pojavila su se početkom 1980-ih. Nakon toga, ova manipulacija provedena je korištenjem slojeva kultiviranih keratinocita, najčešće dobivenih iz autostanica, mnogo rjeđe iz alokeratinocita. Međutim, tehnologija autokeratinocitoplastike ne dopušta stvaranje stanične banke, dok je vrijeme potrebno za izradu transplantata keratinocita dovoljne površine dugo i iznosi 3-4 tjedna. Tijekom tog razdoblja rizik od razvoja infektivnih i drugih komplikacija opeklinske bolesti naglo se povećava, što značajno produžuje ukupno vrijeme boravka pacijenata u bolnici. Osim toga, autokeratinociti praktički se ne ukorijenjuju kada se transplantiraju na granulirajuće opeklinske rane, a visoka cijena posebnih medija za rast i biološki aktivnih stimulatora rasta keratinocita značajno ograničava njihovu kliničku upotrebu. Druge biotehnološke metode, poput kolagenoplastike, transplantacije krioprezervirane ksenoskene i upotrebe različitih biopolimernih premaza, povećavaju učinkovitost liječenja opsežnih površinskih, ali ne i dubokih opeklina. Metoda prekrivanja površine rane kultiviranim fibroblastima bitno se razlikuje po tome što se fibroblasti, a ne keratinociti, koriste kao glavna komponenta kultiviranog staničnog sloja.

Preduvjet za razvoj metode bio je podatak da su periciti koji okružuju male krvne žile progenitorske mezenhimske stanice sposobne transformirati se u fibroblaste koji proizvode mnoge faktore rasta i osiguravaju zacjeljivanje rana zbog snažnog stimulirajućeg učinka na proliferaciju i adheziju keratinocita. Upotreba kultiviranih fibroblasta za zatvaranje površina rana odmah je otkrila niz značajnih prednosti ove metode u usporedbi s upotrebom kultiviranih keratinocita. Konkretno, dobivanje fibroblasta u kulturi ne zahtijeva upotrebu posebnih hranjivih medija i stimulansa rasta, što smanjuje troškove transplantacije za više od 10 puta u usporedbi s troškovima dobivanja keratinocita. Fibroblasti se lako pasiviziraju, tijekom čega djelomično gube površinske antigene histokompatibilnosti, što zauzvrat otvara mogućnost korištenja alogenih stanica za izradu transplantata i stvaranje njihovih banaka. Vrijeme potrebno za dobivanje transplantata spremnih za upotrebu u klinici smanjuje se s 3 tjedna (za keratinocite) na 1-2 dana (za fibroblaste). Primarna kultura fibroblasta može se dobiti uzgojem stanica iz fragmenata kože uzetih tijekom autodermoplastike, a gustoća sjetve stanica za dobivanje subkultura ljudskih fibroblasta je samo 20 x 10³ ^po 1 ^cm².

Kako bi se proučio učinak fibroblasta i njihovih regulatornih proteina na proliferaciju i diferencijaciju keratinocita, provedena je komparativna analiza morfologije i proliferacije keratinocita na supstratima kolagena tipova I i III, kao i fibronektina u zajedničkoj kulturi s ljudskim fibroblastima. Ljudski keratinociti izolirani su iz fragmenata kože pacijenata s opeklinama, uzetih tijekom autodermoplastike. Gustoća sjetve keratinocita bila je 50 x 10³ stanica po 1 cm². Klinička učinkovitost transplantacije kultiviranih fibroblasta procijenjena je kod 517 pacijenata. Svi pacijenti podijeljeni su u dvije skupine: Skupina 1 - odrasli stradalnici s opeklinama IIA, B - IV stupnja; Skupina 2 - djeca s dubokim opeklinama IIIB - IV stupnja. Procjena dinamike strukturne i funkcionalne organizacije fibroblasta monoslojne kulture uzimajući u obzir ulogu glikozaminoglikana, fibronektina i kolagena u procesima regeneracije omogućila je autorima da odrede 3. dan kao najpovoljnije razdoblje za korištenje kultura fibroblasta za izradu transplantata. Studija utjecaja fibroblasta na proliferaciju i diferencijaciju keratinocita pokazala je da in vitro fibroblasti imaju izražen stimulirajući učinak, prvenstveno na procese adhezije keratinocita, povećavajući broj pričvršćenih stanica i brzinu njihove fiksacije za više od 2 puta. Stimulaciju procesa adhezije prati povećanje intenziteta sinteze DNA i razine proliferacije keratinocita. Osim toga, pokazalo se da je prisutnost fibroblasta i izvanstanične matrice koju oni tvore nužan uvjet za formiranje tonofibrilarnog aparata keratinocita, međustaničnih veza i, u konačnici, za diferencijaciju keratinocita i formiranje bazalne membrane. U liječenju djece s dubokim opeklinama utvrđena je visoka klinička učinkovitost transplantacije kulture alofibroblasta, posebno u skupini pacijenata s opsežnim lezijama kože u uvjetima nedostatka donorskog mjesta. Sveobuhvatna morfofunkcionalna studija pokazala je da transplantirane fibroblaste karakterizira aktivna sinteza DNA, kao i kolagena, fibronektina i glikozaminoglikana, koji su dio izvanstanične matrice koju tvore stanice. Autori ističu visok postotak prihvaćanja transplantiranih fibroblasta (do 96%), naglo smanjenje vremena njihovog primitka (unutar 24-48 sati umjesto 2-3 tjedna u slučaju korištenja keratinocita), značajno ubrzanje epitelizacije površine opekline, kao i značajno smanjenje troškova (za 10 puta) tehnologije uzgoja transplantata iz fibroblasta u usporedbi s transplantacijom keratinocita. Korištenje transplantacije kultiviranih alofibroblasta omogućuje spašavanje života djece s kritičnim opeklinama - toplinskim oštećenjem više od 50% površine tijela,što se prije smatralo nekompatibilnim sa životom. Treba napomenuti da je transplantacijom alogenih embrionalnih fibroblasta uvjerljivo dokazana ne samo brža regeneracija rana i oporavak pacijenata s različitim stupnjevima i područjima opeklina, već i značajno smanjenje njihove smrtnosti.

Autologni fibroblasti se također koriste u tako složenom području plastične kirurgije kao što je rekonstruktivna korekcija ozljeda glasnica. U tu svrhu se obično koristi goveđi kolagen, čije je trajanje djelovanja ograničeno njegovom imunogenošću. Budući da je strani protein, goveđi kolagen je osjetljiv na kolagenazu primatelja i može izazvati imunološke reakcije, a kako bi se smanjio rizik od toga, razvijene su tehnologije za dobivanje kolagenih pripravaka umreženih glutaraldehidom. Njihova prednost leži u većoj stabilnosti i nižoj imunogenosti, što je pronašlo praktičnu primjenu u uklanjanju defekata i atrofije glasnica. Injekcije autolognog kolagena prvi put su korištene 1995. godine. Tehnika je osigurala očuvanje primarne strukture autolognih kolagenih vlakana, uključujući intramolekularne enzimski katalizirane unakrsne veze. Činjenica je da su prirodna kolagena vlakna otpornija na uništavanje proteazama od rekonstituiranog kolagena, u kojem su telopeptidi prerezani. Integritet telopeptida važan je za kvaternarnu strukturu kolagenih vlakana i stvaranje unakrsnih veza između susjednih molekula kolagena. Za razliku od pripravaka goveđeg kolagena, autologni kolagen ne uzrokuje imunološke reakcije kod primatelja, ali nije dovoljno učinkovit kao sredstvo za nadoknadu. Stabilna korekcija može se postići lokalnom proizvodnjom kolagena transplantacijom autolognih fibroblasta. Međutim, tijekom proučavanja učinkovitosti autologne transplantacije fibroblasta u klinici utvrđene su određene poteškoće. U ranom razdoblju nakon transplantacije fibroblasta klinički učinak bio je slabiji u usporedbi s onim nakon uvođenja goveđeg kolagena. Prilikom uzgoja autolognih fibroblasta ne može se isključiti mogućnost transformacije normalnih fibroblasta u patološke, takozvane miofibroblaste, odgovorne za razvoj fibroze i stvaranje ožiljaka, što dokazuje kontrakcija kolagenskog gela uzrokovana specifičnom interakcijom fibroblasta i kolagenih fibrila. Osim toga, nakon serijskog pasažiranja in vitro, fibroblasti gube sposobnost sinteze proteina izvanstanične matrice.

Međutim, sada je eksperimentalno razvijena metoda za uzgoj autolognih ljudskih fibroblasta koja uklanja gore navedene nedostatke i ne rezultira onkogenom transformacijom normalnih fibroblasta. Autologni fibroblasti dobiveni ovom metodom koriste se za obnovu defekata u mekim tkivima lica. U studiji G. Kellera i suradnika (2000.) tretirano je 20 pacijenata u dobi od 37 do 61 godine s borama i atrofičnim ožiljcima. Biopsije kože (4 mm) iz retroaurikularne regije transportirane su u laboratorij u sterilnim epruvetama koje su sadržavale 10 ml medija za uzgoj (Eagleov medij s antibiotikom, mikoseptikom, piruvatom i fetalnim telećim serumom). Materijal je stavljen u 3-5 zdjelica za uzgoj promjera 60 mm i inkubiran u termostatu s atmosferom koja sadrži 5% CO2. Nakon 1 tjedna, stanice su uklonjene iz zdjelica tripsinizacijom i stavljene u bočice od 25 cm2. Stanice su injektirane pacijentima u količini od 4 x 107. Značajan i trajan klinički učinak uočen je kod pacijenata tijekom korekcije nazolabijalnih bora, kao i kod pacijenata s ožiljcima 7 i 12 mjeseci nakon treće transplantacije autolognih fibroblasta. Prema protočnoj citometriji, kultivirani fibroblasti proizveli su veliku količinu kolagena tipa I. In vitro studije pokazale su normalnu kontraktilnost injektiranih fibroblasta. Dva mjeseca nakon potkožne primjene kultiviranih fibroblasta u dozi od 4 x 107 stanica, kod golih miševa nisu otkriveni tumori. Injektirani fibroblasti nisu uzrokovali ožiljke ili difuznu fibrozu kod pacijenata. Prema autoru, usađeni autologni fibroblasti sposobni su stalno proizvoditi kolagen, što će pružiti kozmetički učinak pomlađivanja. Istovremeno, budući da je životni vijek diferenciranih stanica ograničen, fibroblasti uzeti od mladog pacijenta učinkovitiji su od onih dobivenih od starijih osoba. U budućnosti se pretpostavlja da će biti moguće krioprezervirati kulturu fibroblasta uzetih od mladog donora kako bi se kasnije presadile vlastite mlade stanice starijem pacijentu. Zaključno, nije sasvim točno zaključiti da su autologni fibroblasti, pod uvjetom da su funkcionalno očuvani, idealno sredstvo za ispravljanje defekata mekih tkiva lica. Istovremeno, sam autor napominje da su se tijekom istraživanja pojavile neke problematične situacije vezane uz korištenje autolognog sustava fibroblast-kolagen. Klinički učinak često je bio slabiji nego kod korištenja goveđeg kolagena, što je kod pacijenata uzrokovalo razočaranje.

Općenito, podaci iz literature o izgledima za kliničku upotrebu mezenhimalnih matičnih stanica izgledaju prilično optimistično. Pokušava se koristiti autologne multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice koštane srži za liječenje degenerativnih lezija zglobova. Provode se prva klinička ispitivanja upotrebe kultiviranih mezenhimalnih progenitorskih stanica u liječenju složenih prijeloma kostiju. Auto- i alogene mezenhimalne stromalne stanice koštane srži koriste se za stvaranje hrskavičnog tkiva za transplantaciju u korekciji defekata zglobne hrskavice zbog traume ili autoimunih lezija. Razvijaju se metode za kliničku upotrebu multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica za uklanjanje koštanih defekata kod djece s teškim oblikom nepotpune osteogeneze uzrokovane mutacijama u genu za kolagen tipa I. Nakon mijeloablacije, djeci primateljima se transplantira koštana srž od HLA-kompatibilnih zdravih donora, budući da nefrakcionirana koštana srž može sadržavati dovoljan broj mezenhimalnih matičnih stanica za kompenzaciju teškog koštanog defekta. Nakon transplantacije alogene koštane srži, takva su djeca pokazala pozitivne histološke promjene u trabekularnim kostima, povećanje stope rasta i smanjenje učestalosti prijeloma kostiju. U nekim slučajevima, pozitivan klinički rezultat postiže se transplantacijom blisko srodne alogene koštane srži i osteoblasta. Transplantacija MSC-a također se koristi za liječenje kongenitalne krhkosti kostiju uzrokovane neravnotežom osteoblasta i osteoklasta u koštanom tkivu. U ovom slučaju, obnova stvaranja kostiju postiže se kimerizacijom skupa matičnih i progenitornih stromalnih stanica u koštanom tkivu pacijenata.

Nastavlja se poboljšanje metoda genetske modifikacije donorskih mezenhimalnih matičnih stanica u svrhu korekcije genetskih defekata stromalnog tkiva. Pretpostavlja se da će se u bliskoj budućnosti mezenhimalne progenitorske stanice koristiti u neurologiji za ciljanu kimerizaciju moždanih stanica i stvaranje zdravog skupa stanica sposobnih za stvaranje deficitarnog enzima ili faktora odgovornog za kliničke manifestacije bolesti. Transplantacija mezenhimalnih matičnih stanica može se koristiti za obnovu strome koštane srži kod pacijenata oboljelih od raka nakon radio- i kemoterapije, a u kombinaciji sa stanicama koštane srži - za obnovu hematopoeze. Razvoj nadomjesne terapije usmjerene na uklanjanje defekata mišićno-koštanog sustava uz pomoć MSC-a potiče se inženjerskim razvojem u području projektiranja matričnih biomaterijala ili biomimetika koji tvore okvire naseljene potomstvom mezenhimalnih matičnih stanica.

Izvori mezenhimalnih matičnih stanica

Glavni izvor mezenhimalnih matičnih stanica je koštana srž, čije se hematopoetske matične stanice u tijelu sisavaca stalno diferenciraju u stanice krvi i imunološkog sustava, dok su mezenhimalne matične stanice predstavljene malom populacijom stanica strome koštane srži sličnih fibroblastima i doprinose očuvanju nediferenciranog stanja hematopoetskih matičnih stanica. Pod određenim uvjetima, mezenhimalne matične stanice diferenciraju se u stanice hrskavičnog i koštanog tkiva. Kada se posijaju na medij za uzgoj pod uvjetima niske gustoće sadnje, mononuklearne stromalne stanice koštane srži tvore kolonije adhezivnih stanica, koje su, zapravo, multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice slične fibroblastima. Neki autori smatraju da se u koštanoj srži talože neobvezujuće mezenhimalne matične stanice koje, zbog svoje sposobnosti samoobnavljanja i visokog potencijala diferencijacije, opskrbljuju sva tkiva tijela mezenhimalnim prekursorima stromalnih elemenata tijekom cijelog života organizma sisavca.

U koštanoj srži, stromalni stanični elementi tvore mrežu koja ispunjava prostor između sinusoida i koštanog tkiva. Sadržaj uspavanih MSC-a u koštanoj srži odrasle osobe usporediv je s količinom hematopoetskih matičnih stanica i ne prelazi 0,01-0,001%. Mezenhimalne matične stanice izolirane iz koštane srži i koje nisu podvrgnute kultivaciji nemaju adhezijske molekule. Takve MSC-e ne eksprimiraju CD34, ICAM, VCAM, kolagen tipova I i III, CD44 i CD29. Posljedično, in vitro, na supstratu kulture nisu fiksirane mezenhimalne matične stanice, već napredniji progenitorski derivati mezenhimalnih matičnih stanica koji su već formirali komponente citoskeleta i receptorski aparat molekula stanične adhezije. Stromalne stanice s CD34 fenotipom nalaze se čak i u perifernoj krvi, iako ih je u koštanoj srži znatno manje nego CD34-pozitivnih mononuklearnih stanica. CD34 stanice izolirane iz krvi i prenesene u kulturu pričvršćuju se na supstrat i tvore kolonije stanica sličnih fibroblastima.

Poznato je da u embrionalnom razdoblju stromalna osnova svih organa i tkiva sisavaca i ljudi nastaje iz zajedničkog skupa mezenhimalnih matičnih stanica prije i u fazi organogeneze. Stoga se vjeruje da bi se u zrelom organizmu većina mezenhimalnih matičnih stanica trebala nalaziti u vezivnom i koštanom tkivu. Utvrđeno je da glavni dio staničnih elemenata strome labavog vezivnog i koštanog tkiva predstavljaju predane progenitorske stanice, koje, međutim, zadržavaju sposobnost proliferacije i stvaranja klonova in vitro. Kada se takve stanice unesu u opći krvotok, više od 20% mezenhimalnih progenitorskih stanica implantira se među stromalne elemente hematopoetskog tkiva i parenhimskih organa.

Potencijalni izvor mezenhimalnih matičnih stanica je masno tkivo, među čijim su matičnim stanicama identificirani prekursori adipocita u različitom stupnju predanosti. Najmanje zreli progenitorski elementi masnog tkiva su stromalno-vaskularne stanice koje su, poput multipotentnih mezenhimalnih prekursorskih stanica koštane srži, sposobne za diferencijaciju u adipocite pod utjecajem glukokortikoida, faktora rasta sličnog inzulinu i inzulina. U kulturi se stromalno-vaskularne stanice diferenciraju u adipocite i hondrocite, a u masnom tkivu podrijetlom iz koštane srži postoje stanice koje tvore adipocite i osteoblaste.

Stromalne matične stanice pronađene su i u mišićima. U primarnoj kulturi stanica izoliranih iz ljudskog skeletnog mišića detektiraju se zvjezdaste stanice i višejezgreni miotubi. U prisutnosti konjskog seruma, zvjezdaste stanice proliferiraju in vitro bez znakova citodiferencijacije, a nakon dodatka deksametazona u hranjivi medij, njihovu diferencijaciju karakterizira pojava staničnih elemenata s fenotipom stanica skeletnih i glatkih mišića, kostiju, hrskavice i masnog tkiva. Stoga su u ljudskom mišićnom tkivu prisutne i posvećene i neopredjeljene multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice. Pokazalo se da populacija progenitorskih stanica prisutnih u skeletnim mišićima potječe od neopredjeljenih multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica koštane srži i razlikuje se od miogenih satelitskih stanica.

Adhezivne zvjezdaste stanice koje odgovaraju multipotentnim mezenhimalnim progenitorskim stanicama u diferencijacijskom potencijalu također su pronađene u miokardu novorođenih štakora, budući da se pod utjecajem deksametazona diferenciraju u adipocite, osteoblaste, hondrocite, stanice glatkih mišića, miotube skeletnih mišića i kardiomiocite. Pokazalo se da su stanice glatkih mišića krvnih žila (periciti) derivati nediferenciranih perivaskularnih multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica. U kulturi, perivaskularne mezenhimalne matične stanice eksprimiraju α-aktin glatkih mišića i receptor faktora rasta izvedenog iz trombocita te su sposobne za diferencijaciju barem u stanice glatkih mišića.

Posebno mjesto, s gledišta rezervi matičnih stanica, zauzima hrskavično tkivo, čiji se izuzetno nizak reparativni potencijal smatra posljedica nedostatka multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica ili faktora diferencijacije i rasta. Pretpostavlja se da multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice prethodno posvećene hondro- i osteogenezi ulaze u hrskavično tkivo iz drugih tkivnih izvora.

Podrijetlo tkiva i uvjeti vezanja mezenhimalnih progenitorskih stanica u tetive također nisu utvrđeni. Eksperimentalna opažanja pokazuju da u ranom postnatalnom razdoblju stanice Ahilove tetive zečeva u primarnim kulturama i pri prvom pasažu zadržavaju ekspresiju kolagena tipa I i dekorina, ali daljnjim uzgojem gube markere diferencijacije tenocita.

Treba napomenuti da još nije dobiven odgovor na pitanje jesu li multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice lokalizirane u različitim tkivima zapravo stalno prisutne u njihovoj stromi ili se tkivni bazen mezenhimalnih matičnih stanica obnavlja migracijom stromalnih matičnih stanica koštane srži.

Uz koštanu srž i druge mezenhimalne tkivne zone odraslog organizma, krv iz pupkovine može biti još jedan izvor MSC-a. Pokazalo se da krv iz pupkovine sadrži stanice koje imaju slične morfološke i antigenske karakteristike s multipotentnim mezenhimalnim progenitorskim stanicama, sposobne su za adheziju i nisu inferiorne u odnosu na multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice podrijetlom iz koštane srži u potencijalu diferencijacije. U kulturama mezenhimalnih matičnih stanica iz krvi iz pupkovine pronađeno je 5 do 10% neobvezujućih multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica. Pokazalo se da je njihov broj u krvi iz pupkovine obrnuto proporcionalan gestacijskoj dobi, što neizravno ukazuje na migraciju multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica u različita tkiva tijekom fetalnog razvoja. Pojavile su se prve informacije o kliničkoj primjeni mezenhimalnih matičnih stanica izoliranih iz krvi iz pupkovine, kao i onih dobivenih iz embrionalnog biomaterijala, što se temelji na poznatoj sposobnosti fetalnih matičnih stanica da se integriraju, usađuju i funkcioniraju u organima i tkivnim sustavima odraslih primatelja.

Potraga za novim izvorima mezenhimalnih matičnih stanica

Korištenje mezenhimalnih matičnih stanica embrionalnog podrijetla, kao i drugih fetalnih stanica, stvara niz etičkih, pravnih, pravosudnih i zakonodavnih problema. Stoga se nastavlja potraga za ekstraembrionalnim donorskim staničnim materijalom. Pokušaj kliničke upotrebe fibroblasta ljudske kože bio je neuspješan, što je bilo predodređeno ne samo visokim financijskim kapacitetom tehnologije, već i brzom diferencijacijom fibroblasta u fibrocite, koji imaju značajno niži proliferacijski potencijal i proizvode ograničen broj faktora rasta. Daljnji napredak u proučavanju biologije MSC-a i multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica koštane srži omogućio nam je razvoj strategije za kliničku upotrebu autolognih mezenhimalnih matičnih stanica. Tehnologija njihove izolacije, uzgoja, ex vivo reprodukcije i ciljane diferencijacije zahtijevala je, prije svega, proučavanje spektra molekularnih markera MSC-a. Njihova analiza pokazala je da primarne kulture ljudskog koštanog tkiva sadrže nekoliko vrsta multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica. Proosteoblastni fenotip otkriven je u stanicama koje eksprimiraju marker stromalnih progenitornih stanica STRO-1, ali ne nose osteoblastni marker - alkalnu fosfatazu. Takve stanice karakterizira niska sposobnost stvaranja mineraliziranog koštanog matriksa, kao i odsutnost ekspresije osteopontina i receptora paratireoidnog hormona. Derivati STRO-1-pozitivnih stanica koje ne eksprimiraju alkalnu fosfatazu predstavljeni su intermedijarno i potpuno diferenciranim osteoblastima. Utvrđeno je da su stanični elementi kloniranih linija STRO-1-pozitivnih ljudskih trabekularnih koštanih stanica sposobni diferencirati se u zrele osteocite i adipocite. Smjer diferencijacije ovih stanica ovisi o učinku polinezasićenih masnih kiselina, proupalnih citokina - IL-1b i faktora tumorske nekroze a (TNF-a), kao i protuupalnog i imunosupresivnog TGF-b.

Kasnije je utvrđeno da multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice nemaju specifičan fenotip svojstven samo njima, ali eksprimiraju kompleks markera karakterističnih za mezenhimalne, endotelne, epitelne i mišićne stanice u odsutnosti ekspresije imunofenotipskih antigena hematopoetskih stanica - CD45, CD34 i CD14. Osim toga, mezenhimalne matične stanice konstitutivno i inducibilno proizvode hematopoetske i nehematopoetske faktore rasta, interleukine i kemokine, a receptori za neke citokine i faktore rasta eksprimiraju se na multipotentnim mezenhimalnim progenitorskim stanicama. Među stanicama stromalnog matriksa ljudskog tijela pronađene su dormantne, ili stanice u mirovanju, s imunofenotipom gotovo identičnim antigenskom profilu multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica netretiranih 5-fluorouracilom - obje stanice eksprimiraju CD117, koji označava "odrasle" matične stanice.

Dakle, stanični marker jedinstven za mezenhimalne matične stanice još nije identificiran. Pretpostavlja se da mirujuće stanice predstavljaju populaciju neobvezujućih multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica, budući da ne eksprimiraju markere stanica posvećenih osteo- (Cbfa-1) ili adipogenezi (PPAR-y-2). Dugotrajno izlaganje sporo proliferirajućih mirujućih stanica fetalnom goveđem serumu dovodi do stvaranja terminalno diferencirajućih obvezujućih progenitorskih stanica karakteriziranih brzim rastom. Klonsku ekspanziju takvih mezenhimalnih matičnih stanica podržava FGF2. Čini se da je genom stromalnih matičnih stanica prilično čvrsto „zatvoren“. Postoje izvješća o odsutnosti spontane diferencijacije u MSC-ima - bez posebnih uvjeta za obvezu, one se ne transformiraju čak ni u stanice mezenhimalne loze.

Kako bi se proučila populacijska struktura derivata mezenhimalnih matičnih stanica, provodi se potraga za proteinskim markerima diferencijacije na staničnim linijama strome i u primarnim kulturama. In vitro klonska analiza stanica koštane srži koje stvaraju kolonije pokazala je da EGF povećava prosječnu veličinu kolonije i smanjuje klonsku ekspresiju alkalne fosfataze kada se primjenjuje na primarne kulture, dok dodatak hidrokortizona aktivira ekspresiju alkalne fosfataze, koja je marker osteogenog smjera diferencijacije MSC-a. Monoklonska antitijela na STRO-1 omogućila su odvajanje i proučavanje populacije STRO-1-pozitivnih adhezivnih stanica u heterogenom sustavu Dexter kultura. Određen je spektar citokina koji reguliraju ne samo proliferaciju i diferencijaciju hematopoetskih i limfoidnih stanica, već i sudjeluju u stvaranju, formiranju i resorpciji skeletnih tkiva putem para-, auto- i endokrinih mehanizama. Receptorom posredovano oslobađanje sekundarnih glasnika kao što su cAMP, diacilglicerol, inozitol trifosfat i Ca2+ također se koristi za analizu markera različitih kategorija stanica stromalnog tkiva koje eksprimiraju odgovarajuće receptore. Korištenje monoklonskih antitijela kao markera omogućilo je utvrđivanje pripadnosti retikularnih stanica strome limfoidnih organa T- i B-ovisnim zonama.

Neko vrijeme vodile su se znanstvene rasprave oko pitanja mogućnosti podrijetla MSC-a iz hematopoetskih matičnih stanica. Doista, kada se suspenzije stanica koštane srži eksplantiraju u monoslojne kulture, u njima rastu diskretne kolonije fibroblasta. Međutim, pokazalo se da prisutnost prekursora kolonija fibroblasta i različitih klica diferencijacije hematopoetskog tkiva u koštanoj srži nije dokaz njihovog zajedničkog podrijetla iz hematopoetske matične stanice. Korištenjem diskriminantne analize matičnih stanica koštane srži utvrđeno je da se mikrookruženje tijekom heterotopske transplantacije koštane srži ne prenosi hematopoetskim stanicama, što dokazuje postojanje populacije MSC-a u koštanoj srži koja je histogenetski neovisna o hematopoetskim stanicama.

Osim toga, metoda selektivnog kloniranja omogućila je identifikaciju nove kategorije stromalnih progenitorskih stanica u monoslojnim kulturama stanica koštane srži, određivanje njihovog broja te proučavanje njihovih svojstava, proliferativnih i diferencijacijskih potencijala. Pokazalo se da se stromalne fibroblastolike stanice proliferiraju in vitro i tvore diploidne kolonije koje, kada se transplantiraju natrag u tijelo, omogućuju stvaranje novih hematopoetskih organa. Rezultati proučavanja pojedinačnih klonova ukazuju na to da među stromalnim progenitorskim stanicama postoji populacija stanica koje svojim proliferativnim i diferencijacijskim potencijalom mogu preuzeti ulogu matičnih stanica stromalnog tkiva, histogenetski neovisnih o hematopoetskim matičnim stanicama. Stanice ove populacije karakterizira samoodrživi rast i diferenciraju se u progenitorske stanične elemente kosti, hrskavice i retikularnog tkiva koštane srži.

Od velikog su interesa rezultati istraživanja R. Chailakhyana i koautora (1997.-2001.), koji su uzgajali progenitorske stanice strome koštane srži zečeva, zamoraca i miševa na hranjivoj podlozi a-MEM uz dodatak fetalnog telećeg seruma. Autori su proveli eksplantaciju s početnom gustoćom od 2-4 x 10³ stanica koštane srži po 1 cm2. Homologne ili heterologne stanice koštane srži inaktivirane zračenjem korištene su kao hranilica u dozi koja je zadržala učinak hranilice, ali je potpuno blokirala njihovu proliferaciju. Dvotjedne primarne diskretne kolonije fibroblasta tripsinizirane su kako bi se dobili monoklonski sojevi. Dokazi o klonskom podrijetlu kolonija dobiveni su korištenjem kromosomskog markera u miješanim kulturama koštane srži mužjaka i ženki zamoraca, time-lapse fotografije živih kultura i u miješanim kulturama singenetske koštane srži miševa CBA i CBAT6T6. Transplantacija suspenzije svježe izoliranih stanica koštane srži ili in vitro uzgojenih stromalnih fibroblasta ispod bubrežne kapsule provedena je u poroznim nosačima od ivalona ili želatine, kao i u inaktiviranoj spužvastoj koštanoj matrici zeca. Za transplantaciju klonova u koštanu ovojnicu, femuri zamorca očišćeni su od mekog tkiva i periosta, epifize su obrezane, a koštana srž temeljito isprana. Kost je izrezana na fragmente (3-5 mm), osušena i ozračena dozom od 60 Gy. Pojedinačne kolonije fibroblasta smještene su u koštane ovojnice i implantirane intramuskularno. Za intraperitonealnu transplantaciju stromalnih fibroblasta uzgojenih in vitro korištene su difuzijske komore tipova A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) i O (V=0,15 cm3, h=2 mm).

Prilikom proučavanja dinamike rasta klonskih sojeva, R. Chailakhyan i sur. (2001.) otkrili su da pojedinačne stanice koje tvore kolonije fibroblasta, kao i njihovi potomci, imaju ogroman proliferativni potencijal. Do 10. pasaže, broj fibroblasta u nekim sojevima bio je 1,2-7,2 x 109 ^stanica. Tijekom svog razvoja izvršili su do 31-34 udvostručenja stanica. U ovom slučaju, heterotopska transplantacija sojeva izvedenih iz koštane srži, nastalih od stromalnih prekursora nekoliko desetaka klonova, rezultirala je prijenosom mikrookruženja koštane srži i stvaranjem novog hematopoetskog organa u zoni transplantacije. Autori su postavili pitanje jesu li pojedinačni klonovi sposobni prenijeti mikrookruženje koštane srži stromalnih stanica ili je za to potrebna suradnja nekoliko različitih klonogenih stromalnih prekursora? I ako su pojedinačni klonovi sposobni prenijeti mikrookruženje, hoće li ono biti potpuno za sva tri hematopoetska izdanka ili različiti klonovi osiguravaju stvaranje mikrookruženja za različite hematopoetske izdanke? Kako bi se riješili ovi problemi, razvijena je tehnologija za uzgoj stromalnih progenitorskih stanica na kolagenom gelu, koja omogućuje uklanjanje uzgojenih kolonija fibroblasta s površine za naknadnu heterotopnu transplantaciju. Pojedinačni klonovi stromalnih fibroblasta uzgojenih iz stanica koštane srži CBA miševa i zamoraca izrezani su zajedno s fragmentom gel premaza i heterotopno transplantirani - ispod bubrežne kapsule singenetskih miševa ili u trbušni mišić autolognih zamoraca. Prilikom transplantacije u mišić, kolonije na gelu smještene su u koštane ovojnice.

Autori su otkrili da je 50-90 dana nakon transplantacije kolonija fibroblasta koštane srži, u zoni transplantacije u 20% slučajeva uočen razvoj kosti ili kosti i hematopoetskog tkiva. U 5% životinja primatelja, formirana žarišta koštanog tkiva sadržavala su šupljinu ispunjenu koštanom srži. Unutar koštanih cilindara, takva žarišta imala su zaobljeni oblik i kapsulu izgrađenu od koštanog tkiva s osteocitima i dobro razvijenim osteoblastnim slojem. Šupljina koštane srži sadržavala je retikularno tkivo s mijeloidnim i eritroidnim stanicama, čiji se proporcionalni odnos nije razlikovao od onog u normalnoj koštanoj srži. U bubregu je transplantat bio tipičan organ koštane srži nastao tijekom transplantacije nativne koštane srži, s koštanom kapsulom koja je prekrivala šupljinu koštane srži samo sa strane bubrežne kapsule. Hematopoetsko tkivo uključivalo je mijeloidne, eritroidne i megakariocitne elemente. Stroma šupljine koštane srži imala je dobro razvijen sinusni sustav i sadržavala je tipične masne stanice. Istodobno, u zoni transplantacije nekih kolonija ispod bubrežne kapsule pronađeno je koštano tkivo bez znakova hematopoeze. Proučavanje proliferativnih i diferencijacijskih potencijala pojedinačnih klonova nastavljeno je na monoklonskim sojevima koštane srži kunića, čije su stanice resuspendirane u hranjivom mediju i u zasebnoj ivalon spužvi mase 1-2 mg transplantirane pod bubrežnu kapsulu donora koštane srži kunića. Stanice 21 monoklonskog soja podvrgnute su takvoj autotransplantaciji. Rezultati su uzeti u obzir nakon 2-3 mjeseca. Autori su otkrili da su u 14% slučajeva transplantirani monoklonski sojevi formirali organ koštane srži koji se sastoji od koštanog tkiva i šupljine koštane srži ispunjene hematopoetskim stanicama. U 33% slučajeva transplantirani sojevi formirali su kompaktnu kost različite veličine s osteocitima ugrađenim u šupljine i razvijenim osteoblastnim slojem. U nekim slučajevima, u spužvama s transplantiranim klonovima razvilo se retikularno tkivo bez kostiju ili hematopoetskih elemenata. Ponekad se formirala retikularna stroma s dobro razvijenom mrežom sinusoida, ali nije naseljena hematopoetskim stanicama. Dakle, dobiveni rezultati bili su slični podacima dobivenim tijekom transplantacije klonova na kolageni gel. Međutim, ako je transplantacija klonova uzgojenih na supstratu rezultirala stvaranjem tkiva koštane srži u 5% slučajeva, koštanog tkiva u 15% i retikularnog tkiva u 80% slučajeva, onda je kod transplantacije monoklonskih sojeva stvaranje elemenata koštane srži uočeno u 14% slučajeva, koštanog tkiva u 53% i retikularnog tkiva u 53% slučajeva. Prema autorima, to ukazuje na to da su uvjeti za realizaciju proliferativnog i diferencijacijskog potencijala stromalnih fibroblasta tijekom transplantacije na porozne nosače bili optimalniji nego tijekom njihove transplantacije u koštane ovojnice i na kolageni supstrat.Moguće je da korištenje naprednijih metoda uzgoja i reverzne transplantacije klonova može poboljšati uvjete za ostvarenje njihovog diferencijacijskog potencijala od strane klonova i promijeniti te omjere. Na ovaj ili onaj način, ali glavni značaj provedenih studija je da su neki klonovi stromalnih stanica sposobni formirati koštano tkivo i istovremeno osigurati stromalno hematopoetsko mikrookruženje za tri izdanka hematopoeze koštane srži odjednom: eritroidni, mijeloidni i megakariocitni, stvarajući prilično velike platforme hematopoetskog tkiva i određenu koštanu masu.

Autori su se zatim pozabavili pitanjem sposobnosti pojedinačnih klonogenih stromalnih progenitorskih stanica da prođu kroz ove tipove stanične diferencijacije u zatvorenom sustavu difuzijskih komora. Osim toga, bilo je potrebno utvrditi posjeduju li pojedinačni klonovi polipotentnost ili manifestacija diferencijacijskog potencijala zahtijeva kooperativnu interakciju nekoliko klonova s fiksnom osobinom citodiferencijacije, čiji različiti omjeri određuju preferencijalno stvaranje koštanog, retikularnog ili hrskavičnog tkiva. Kombiniranjem dva metodološka pristupa - dobivanjem monoklonskih sojeva stromalnih progenitorskih stanica koštane srži i njihovim presađivanjem u difuzijske komore - R. Chailakhyan i koautori (2001.) dobili su rezultate koji su im omogućili da se približe razumijevanju strukturne organizacije strome koštane srži. Transplantacija monoklonskih sojeva stromalnih progenitorskih stanica u komore O-tipa rezultirala je stvaranjem i koštanog i hrskavičnog tkiva, što ukazuje na sposobnost potomaka jedne stanice koja stvara stromalne kolonije da istovremeno formiraju koštano i hrskavično tkivo. Pretpostavka da koštano i hrskavično tkivo potječu od zajedničke stromalne progenitorske stanice više je puta iznesena. Međutim, ova hipoteza nije imala točnu eksperimentalnu potvrdu. Stvaranje kosti i hrskavice u difuzijskim komorama bio je nužan dokaz postojanja zajedničke progenitorske stanice za ove dvije vrste tkiva među matičnim stanicama strome koštane srži.

Zatim je 29 klonskih sojeva drugog i trećeg pasaža dobivenih iz primarnih kultura koštane srži zeca smješteno u difuzijske komore i intraperitonealno implantirano u homologne životinje. Studije su pokazale da 45% monoklonskih sojeva koštane srži posjeduje osteogeni potencijal. Devet komora sadržavalo je isključivo retikularno tkivo, ali ono je bilo prisutno zajedno s koštanim i hrskavičnim tkivom u još 13 komora, što je činilo 76% svih sojeva. U komorama tipa O, gdje je bila moguća diferencijacija i koštanog i hrskavičnog tkiva, proučavano je 16 sojeva. U četiri komore (25%) formirano je i koštano i hrskavično tkivo. Treba još jednom napomenuti da su u studijama R. Chailakhyana i suradnika (2001.) pojedinačne progenitorske stanice prošle kroz 31 do 34 udvostručenja unutar staničnog soja, a njihovo potomstvo sastojalo se od 0,9-2,0 x ¹⁰⁹ stanica. Broj mitoza koje su progenitorske stanice poliklonskih sojeva prošle bio je gotovo identičan broju monoklonskih sojeva. Brzina razvoja poliklonskih sojeva, posebno u prvoj fazi njihovog formiranja, u značajnoj je mjeri ovisila o broju kolonija korištenih za iniciranje sojeva. Diploidni sojevi ljudskih embrionalnih fibroblasta (WI-38), kada su reklonirani na razinama udvostručenja 12-15, također su formirali kolonije koje su se razlikovale po promjeru i sadržaju stanica. Velike kolonije koje su sadržavale više od 103 stanica činile su samo 5-10%. S povećanjem broja dioba, postotak velikih kolonija smanjivao se. Mono- i poliklonski sojevi stromalnih fibroblasta koštane srži zadržali su diploidni set kromosoma nakon 20 ili više udvostručenja, a tendencija njihovog razvoja bila je usporediva s dinamikom razvoja diploidnih sojeva embrionalnih fibroblasta. Analiza potencijala diferencijacije pojedinačnih progenitorskih stanica strome koštane srži, provedena presađivanjem monoklonskih sojeva u difuzijske komore, pokazala je da je polovica njih bila osteogena. Velike kolonije činile su 10% njihovog ukupnog broja. Posljedično, broj osteogenih stanica koje formiraju kolonije odgovarao je približno 5% njihove ukupne populacije. Ukupna masa osteogenih progenitorskih stanica koje su identificirali autori uključivala je stanice sposobne istovremeno formirati koštano i hrskavično tkivo. Štoviše, prvi put je utvrđeno da ove dvije vrste tkiva u odraslom organizmu imaju zajedničku progenitorsko stanicu: 25% testiranih klonova stvoreno je takvim stanicama, a njihov broj među ukupnom populacijom progenitorskih stanica bio je najmanje 2,5%.

Dakle, heterotopna transplantacija pojedinačnih klonova fibroblasta koštane srži otkrila je nove aspekte strukturne organizacije populacije mezenhimalnih progenitorskih stanica. Pronađene su stromalne progenitorske stanice koje su sposobne prenijeti specifično mikrookruženje za sve hematopoetske klice odjednom, čiji se broj među velikim klonovima proučavanim u različitim modelima kreće od 5 do 15% (0,5-1,5% ukupnog broja detektiranih progenitorskih stanica). Uz klonove koji prenose cjelokupno mikrookruženje koštane srži, postoje progenitorske stanice određene samo za osteogenezu, koje, kada se prenesu u otvoreni sustav, tvore koštano tkivo koje ne podržava razvoj hematopoeze. Njihov broj od ukupnog broja progenitorskih stanica iznosi 1,5-3%. Neke od ovih stanica sposobne su za stvaranje koštanog tkiva s ograničenim razdobljem samoodržavanja. Posljedično, populacija stromalnih progenitorskih stanica je heterogena u svom potencijalu diferencijacije. Među njima postoji kategorija stanica koje tvrde da su stromalne matične stanice, sposobne za diferencijaciju u sva tri smjera karakteristična za stromalno tkivo koštane srži, tvoreći kost, hrskavicu i retikularno tkivo. Prikazani podaci nam daju nadu da će, korištenjem različitih staničnih markera, biti moguće odrediti doprinos svake vrste stromalnih stanica organizaciji specifičnog mikrookruženja i podršci hematopoeze u Dexterovim kulturama.

Karakteristike mezenhimalnih matičnih stanica

Posljednjih godina utvrđeno je da su u stacionarnim kulturama koštane srži multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice predstavljene ograničenom populacijom malih agranularnih stanica (RS-1 stanice) karakteriziranih niskim kapacitetom stvaranja kolonija i odsutnošću ekspresije Ki-67 antigena specifičnog za proliferirajuće stanice. Antigenski parametri uspavanih RS-1 stanica razlikuju se od spektra antigena brzo proliferirajućih predanih stromalnih progenitorskih stanica. Utvrđeno je da se visoka stopa proliferacije predanih progenitorskih stanica opaža samo u prisutnosti RS-1 stanica. Zauzvrat, RS-1 stanice povećavaju svoju stopu rasta pod utjecajem čimbenika koje luče najzrelije derivate multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica. Čini se da su RS-1 stanice podklasa nepredanih MSC-a sposobnih za recikliranje. In vitro, 5-fluorouracil-rezistentne stromalne progenitorske stanice koštane srži karakteriziraju se niskim sadržajem RNA i visokom ekspresijom gena ornitin dekarboksilaze, markera neproliferirajućih stanica.

Intenzivna proliferacija stromalnih progenitorskih stanica započinje nakon njihove fiksacije na supstratu. U tom slučaju, izražen je markerni profil slabo diferenciranih stanica: SH2 (TGF-(3) receptor), SH3 (domena signalnog proteina), kolagen tipova I i III, fibronektin, adhezijski receptori VCAM-1 (CD106) i ICAM (CD54), kadherin-11, CD44, CD71 (transferinski receptor), CD90, CD120a i CD124, ali bez ekspresije karakterističnih markera hematopoetskih matičnih stanica (CD34, CD14, CD45). Klonalni rast omogućuje ponovljeno pasiranje mezenhimalnih matičnih stanica s formiranjem brojnih genetski homogenih stromalnih progenitorskih pluripotentnih stanica u kulturi. Nakon 2-3 pasaže, njihov broj doseže 50-300 milijuna. U kulturi dovoljne gustoće, nakon što je proliferacija prestala, stromalne progenitorske stanice, za razliku od fibroblasta hematopoetskog tkiva, diferenciraju se u adipocite, miocite, hrskavične i koštane stanice. Kombinacija triju regulatornih diferencijacijskih signala, uključujući 1-metil-izobutilksantin (induktor unutarstanične cAMP formacije), deksametazon (inhibitor fosfolipaza A i C) i indometacin (inhibitor ciklooksigenaze, koji također smanjuje aktivnost tromboksan sintaze), pretvara do 95% progenitornih mezenhimalnih stanica u adipocite. Formiranje adipocita iz nezrelih stromalnih elemenata potvrđeno je ekspresijom gena lipoproteinske lipaze, histokemijskim otkrivanjem apolipoproteina i peroksisomalnih receptora. Stanice istog klona pod utjecajem TGF-b u mediju bez seruma stvaraju homogenu populaciju hondrocita. Višeslojna stanična kultura ovog hrskavičnog tkiva karakterizirana je razvijenim međustaničnim matriksom koji se sastoji od proteoglikana i kolagena tipa II. U hranjivoj podlozi s 10% Učinak kompleksa signala diferencijacije koji se sastoji od b-glicerofosfata (anorganskog donora fosfata), askorbinske kiseline i deksametazona u istoj kulturi stromalnih progenitorskih stanica dovodi do stvaranja staničnih agregata. U takvim stanicama opaža se progresivno povećanje aktivnosti alkalne fosfataze i razine osteopontina, što ukazuje na stvaranje koštanog tkiva, čija se mineralizacija stanica potvrđuje progresivnim povećanjem unutarstanične količine kalcija.

Prema nekim podacima, sposobnost mezenhimalnih matičnih stanica za neograničenu diobu i reprodukciju različitih tipova stanica mezenhimalne diferencijacijske linije kombinirana je s visokim stupnjem plastičnosti. Kada se unesu u ventrikule ili bijelu tvar mozga, mezenhimalne matične stanice migriraju u parenhim živčanog tkiva i diferenciraju se u derivate glialne ili neuronske stanične linije. Osim toga, postoje informacije o transdiferencijaciji MSC-a u hematopoetske matične stanice i in vitro i in vivo. Dublja analiza u nekim studijama utvrdila je iznimno visoku plastičnost MSC-a, koja se očituje u njihovoj sposobnosti diferencijacije u astrocite, oligodendrocite, neurone, kardiomiocite, stanice glatkih mišića i stanice skeletnih mišića. Brojne studije o transdiferencijacijskom potencijalu MSC-a in vitro i in vivo utvrdile su da se multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice podrijetlom iz koštane srži terminalno diferenciraju u stanične linije koje tvore koštano, hrskavično, mišićno, živčano i masno tkivo, kao i tetive i stromu koje podržavaju hematopoezu.

Međutim, druge studije nisu otkrile nikakve znakove ograničenja pluripotentnosti genoma mezenhimalnih matičnih stanica i progenitorskih populacija stromalnih stanica, iako je proučavano više od 200 klonova MSC-a izoliranih iz jedne primarne kulture kako bi se testirala moguća pluripotentnost stromalnih stanica. Velika većina klonova in vitro zadržala je sposobnost diferencijacije u osteogenim, hondrogenim i adipogenim smjerovima. Isključujući vjerojatnost migracije stanica primatelja transplantacijom mezenhimalnih matičnih stanica ispod bubrežne kapsule ili u difuzijske komore, pokazalo se da stromalne progenitorske stanice in situ zadržavaju heterogeni fenotip, što ukazuje ili na odsutnost restrikcijskih faktora u zoni transplantacije ili na odsutnost pluripotentnosti MSC-a kao takve. Istodobno, dopušta se postojanje rijetkog tipa somatskih pluripotentnih matičnih stanica, koje su zajednički prekursori svih odraslih matičnih stanica.

Multi-, ali ne i pluripotentnost, pravih mezenhimalnih matičnih stanica, koje čine vrlo mali udio stanica koštane srži i sposobne su za proliferaciju pod određenim uvjetima tijekom in vitro uzgoja bez diferencijacije, dokazuje se njihovom induciranom predanošću stanicama kostiju, hrskavice, masnog tkiva, mišićnog tkiva, kao i tenocitima i stromalnim elementima koji podržavaju hematopoezu. U pravilu, produljena izloženost mediju za kulturu s fetalnim telećim serumom izaziva oslobađanje MSC-a u predane stromalne progenitorske stanice, čije potomstvo prolazi kroz spontanu terminalnu diferencijaciju. In vitro je moguće postići ciljano stvaranje osteoblasta dodavanjem deksametazona, ß-glicerofosfata i askorbinske kiseline u medij za kondicioniranje, dok kombinacija deksametazona i signala diferencijacije inzulina inducira stvaranje adipocita.

Utvrđeno je da se prije ulaska u fazu terminalne diferencijacije, MSC koštane srži u početku diferenciraju u mezenhimalne matične stanice slične fibroblastima pod određenim uvjetima uzgoja. Derivati tih stanica in vivo sudjeluju u stvaranju kostiju, hrskavice, tetiva, masnog i mišićnog tkiva, kao i strome koja podržava hematopoezu. Mnogi autori pod pojmom „multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice“ podrazumijevaju i same MSC i posvećene stromalne progenitorske stanice koštane srži i mezenhimalnih tkiva. Klonska analiza multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica podrijetlom iz koštane srži pokazala je da se nešto više od jedne trećine svih klonova diferencira u osteo-, hondro- i adipocite, dok stanice preostalih klonova imaju samo osteogeni potencijal i tvore samo hondro- i osteocite. Klon multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica poput BMC-9, pod odgovarajućim uvjetima mikrookoliša, diferencira se u stanice s fenotipom i funkcionalnim karakteristikama ne samo osteoblasta, hondrocita i adipocita, već i stromalnih stanica koje podržavaju hematopoezu. Klon RCJ3.1 stanica izoliranih iz koštane srži fetusa štakora diferencira se u mezenhimalne stanice različitih fenotipova. Pod kombiniranim djelovanjem askorbinske kiseline, b-glicerofosfata i deksametazona, stanični elementi ovog klona prvo tvore multinuklearne miocite, a zatim, sekvencijalno, adipocite, hondrocite i otočiće mineraliziranog koštanog tkiva. Populacija granularnih stanica iz periosta fetusa štakora odgovara neobjedinjenim multipotentnim mezenhimalnim progenitorskim stanicama, budući da je karakterizirana niskom stopom proliferacije, ne eksprimira markere diferencijacije i pod uvjetima kulture diferencira se u hondro-, osteo- i adipocite, kao i stanice glatkih mišića.

Stoga treba prepoznati da pitanje pluri- ili multipotentnosti genoma mezenhimalnih matičnih stanica ostaje otvoreno, što, shodno tome, utječe i na ideje o diferencijacijskom potencijalu stromalnih progenitorskih stanica, koji također nije definitivno utvrđen.

Eksperimentalno dokazana i važna karakteristika mezenhimalnih matičnih stanica je njihova sposobnost napuštanja tkivne niše i cirkulacije u općem krvotoku. Da bi se aktivirao program genetske diferencijacije, takve cirkulirajuće matične stanice moraju ući u odgovarajuće mikrookruženje. Pokazalo se da se sustavnim unošenjem MSC-a u krvotok životinja primatelja, nezrele stanice implantiraju u različite organe i tkiva, a zatim se diferenciraju u krvne stanice, miocite, adipocite, hondrocite i fibroblaste. Posljedično, u lokalnim tkivnim zonama dolazi do signalno-regulacijskih interakcija između nevezanih i vezanih stromalnih progenitorskih stanica, kao i između njih i okolnih zrelih stanica. Pretpostavlja se da diferencijaciju induciraju parakrini regulatorni čimbenici mezenhimalnog i nemezenhimalnog podrijetla (faktori rasta, eikosanoidi, molekule izvanstanične matrice), koji osiguravaju prostorne i vremenske veze u mikrookruženju multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica. Stoga bi lokalno oštećenje mezenhimalnog tkiva trebalo dovesti do stvaranja zona mikrookruženja multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica koje se kvalitativno razlikuju od kompleksa regulatornih signala intaktnih tkiva, u kojima se odvijaju fiziološki, a ne reparativni regeneracijski procesi. Ova razlika je izuzetno važna u smislu specijalizacije staničnog fenotipa u normalnom i oštećenjem induciranom mikrookruženju.

Prema konceptima, upravo su ovdje ugrađeni mehanizmi temeljne razlike između dva poznata procesa - fiziološke regeneracije i upalne proliferacije. Prvi od njih završava obnavljanjem specijaliziranog staničnog sastava tkiva i njegove funkcije, dok je rezultat provedbe procesa proliferacije stvaranje elemenata zrelog vezivnog tkiva i gubitak funkcije oštećene tkivne zone. Stoga je za razvoj optimalnih programa za korištenje multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica u regenerativno-plastičnoj medicini potrebno temeljito proučavanje značajki utjecaja čimbenika mikrookoliša na diferencijaciju MSC-a.

Ovisnost strukture odjeljka matičnih stanica o staničnim para- i autokrinim regulatorima, čija je ekspresija modulirana vanjskim signalima, je nesumnjiva. Među funkcijama regulatornih čimbenika, najvažnije su kontrola asimetrične diobe MSC-a i ekspresija gena koji određuju faze predanosti i broj staničnih dioba. Vanjske signale, o kojima ovisi daljnji razvoj MSC-a, osigurava njihovo mikrookruženje. U nezrelom stanju, MSC-i proliferiraju dugo vremena, zadržavajući sposobnost diferencijacije u linije adipocita, miofibroblasta, strome hematogenog tkiva, hrskavičnih i koštanih stanica. Utvrđeno je da se ograničena populacija CD34-negativnih stromalnih staničnih elemenata koji cirkuliraju u krvi vraća iz općeg krvotoka u stromu koštane srži, gdje se transformira u linije CD34-pozitivnih hematopoetskih matičnih stanica. Ova opažanja upućuju na to da recirkulacija progenitorskih mezenhimalnih stanica u krvotoku održava tkivnu ravnotežu stromalnih matičnih stanica u različitim organima mobilizacijom zajedničkog skupa nezrelih stromalnih elemenata koštane srži. Diferencijacija MSC-a u stanice s višestrukim mezenhimalnim fenotipovima i njihovo sudjelovanje u regeneraciji ili popravku kostiju, hrskavice, masnog tkiva i tetiva in vivo dokazano je korištenjem modela adoptivnog prijenosa na eksperimentalnim životinjama. Prema drugim autorima, udaljena migracija MSC-a duž vaskularnog korita kombinirana je s kratkim udaljenostima ili lokalnim kretanjem multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica unutar tkiva tijekom popravka hrskavice, regeneracije mišića i drugih restorativnih procesa.

Lokalne matične rezerve baze stromalnog tkiva djeluju kao izvor stanica u procesima fiziološke regeneracije tkiva i nadopunjuju se udaljenim transportom MSC-a kako se troše matični resursi stromalnog tkiva. Međutim, u uvjetima potrebe za hitnom mobilizacijom reparativnog staničnog potencijala, na primjer, u slučaju politraume, cijeli ešalon MSC-a sudjeluje u procesima reparativne regeneracije, a mezenhimalne progenitorske stanice koštane srži regrutiraju se na periferiju kroz opći protok krvi.

Transplantacija mezenhimalnih matičnih stanica

Mogu se pratiti određene paralele između procesa fiziološke regeneracije tkiva i njihovog formiranja tijekom intrauterinog razvoja. U embriogenezi ljudi i sisavaca, formiranje različitih vrsta specijaliziranih stanica događa se iz ekto-, mezo- i endodermalnog bazena zametnih slojeva, ali uz obvezno sudjelovanje mezenhima. Labava stanična mreža embrionalnog mezenhimalnog tkiva obavlja brojne regulatorne, metaboličke, okvirne i morfogenetske funkcije. Polaganje privremenih organa događa se tek nakon kondenzacije mezenhima zbog klonogenog rasta progenitorskih stanica, koje generiraju primarne morfogenetske signale organogeneze. Stromalni derivati embrionalnog mezenhima stvaraju stanični okvir privremenih organa i čine osnovu za njihovu buduću energetsko-plastičnu opskrbu zbog rasta primarnih krvnih i limfnih žila. Drugim riječima, stromalni elementi mikrocirkulacijske jedinice fetalnih organa nastaju prije formiranja njihovih strukturnih i funkcionalnih jedinica. Osim toga, aktivna migracija mezenhimalnih stanica tijekom organogeneze osigurava prostornu orijentaciju organa u razvoju označavanjem njihovih volumenskih granica kroz ograničenje homeotskih Hox-tipova. Stromalni okvir također služi kao osnova za sastavljanje strukturnih i funkcionalnih jedinica parenhimskih organa, koji često uključuju morfogenetski i funkcionalno potpuno različite stanice. Posljedično, tijekom embriogeneze, funkcije mezenhima su primarne i ostvaruju se stvaranjem regulatornih signala koji aktiviraju regionalnu proliferaciju i diferencijaciju progenitorskih epitelnih stanica. Embrionalne mezenhimske stanice proizvode faktore rasta poput HGF-b, HGF-b, CSF, za koje parenhimske progenitorske stanice imaju odgovarajuće receptore. U diferenciranom zrelom tkivu odraslog organizma, stromalna mreža stanica također generira signale za održavanje održivosti i proliferacije progenitorskih stanica nemezenhimskog podrijetla. Međutim, spektar stromalnih regulatornih signala u postnatalnoj ontogenezi je različit (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, itd.) i usmjeren je na osiguranje fiziološke regeneracije ili popravka oštećenih tkivnih zona. Štoviše, spektralne karakteristike stromalnih regulatornih faktora u svakoj vrsti tkiva, pa čak i unutar jednog organa, su različite. Konkretno, hematopoeza i limfopoeza s proliferacijom i diferencijacijom hematopoetskih i imunokompetentnih stanica javljaju se samo u određenim organima, unutar čijih granica djeluje stromalno mikrookruženje, osiguravajući uvjete za sazrijevanje hematopoetskih i limfoidnih stanica. Sposobnost hematopoetskih i limfoidnih stanica da ponovno nasele određeni organ, proliferiraju i sazrijevaju u njegovim mikrostrukturnim nišama ovisi o regulatornim faktorima mikrookruženja.

Među komponentama izvanstanične matrice koje proizvode multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice, treba istaknuti fibronektin, laminin, kolagen i proteoglikane, kao i CD44 (receptor za hijaluronanski i osteopontinski receptor), koji imaju glavnu ulogu u organiziranju međustaničnih interakcija i formiranju izvanstanične matrice u koštanoj srži i koštanom tkivu. Dokazano je da multipotentne mezenhimalne progenitorske stanice koštane srži stvaraju stromalno mikrookruženje koje pruža induktivne i regulatorne signale ne samo MSC-ima, već i hematopoetskim progenitorima i drugim nemezenhimalnim matičnim stanicama koštane srži. Poznato je da je sudjelovanje MSC-a u hematopoezi određeno njihovom sposobnošću diferencijacije u stromalne stanice koje podržavaju hematopoezu, a taj instruktivni signal MSC-i primaju izravno od hematopoetskih matičnih stanica. Zato u kulturi mreža stromalnih progenitorskih stanica služi kao hranidbena baza za razvoj svih klonova hematopoetskih stanica.

U zrelom organizmu, intenzitet hemo- i limfopoeze je u stanju dinamičke ravnoteže s "trošenjem" zrelih krvnih stanica i stanica imunološkog sustava na periferiji. Budući da se stromalne stanice koštane srži i limfoidnih organa obnavljaju izuzetno rijetko, ne dolazi do značajnog restrukturiranja stromalnih struktura u njima. Sustav se može izvesti iz dinamičke ravnoteže mehaničkim oštećenjem bilo kojeg od organa hemo- ili limfopoeze, što dovodi do ujednačenih sekvencijalnih promjena koje se tiču ne samo i ne toliko hematopoetskih ili limfoidnih elemenata koliko stromalnih struktura oštećenog organa. U procesu reparativne regeneracije prvo se formira stromalna baza, koja se zatim ponovno naseljava hematopoetskim ili imunokompetentnim stanicama. Ova odavno poznata činjenica čini posttraumatsku regeneraciju prikladnim modelom za proučavanje stromalnog mikrookruženja hematopoetskih organa. Posebno se mehaničko pražnjenje medularne šupljine tubularnih kostiju koristi za proučavanje reparativne regeneracije koštane srži - kiretaže, koja omogućuje brzo i učinkovito uklanjanje hematopoetskog tkiva iz stanja dinamičke ravnoteže. Prilikom proučavanja procesa reparativne regeneracije hematopoetskih i stromalnih komponenti koštane srži nakon mehaničkog pražnjenja medularne šupljine tibije zamoraca, utvrđeno je da ne postoji izravna korelacija između indeksa regeneracije hematopoetskih i stromalnih stanica (broj hematopoetskih stanica, koncentracija i broj stromalnih progenitorskih stanica). Osim toga, pokazalo se da se povećanje populacije stromalnih progenitorskih stanica događa ranije nakon kiretaže, a sami stromalni fibroblasti postaju fosfataza-pozitivni, što je tipično za osteogeno tkivo. Također je utvrđeno da kiretaža 3-5 tubularnih kostiju dovodi do rasta ove stanične populacije u koštanoj srži neoperiranih kostiju, pa čak i u slezeni, koja je kod zamoraca isključivo limfopoetski organ.

Morfološka slika reparativnih procesa u koštanoj srži kiretiranih tibija zamoraca uglavnom odgovara podacima opisanim u literaturi dobivenim u pokusima na životinjama drugih vrsta, a dinamika promjena koje nastaju nakon uklanjanja hematopoetskog tkiva ista je za sve životinjske vrste i razlika se odnosi samo na vremenske parametre. Morfološki, fazni redoslijed obnove hematopoeze u ispražnjenoj medularnoj šupljini sastoji se od uzastopnih procesa organizacije krvnog ugruška, stvaranja grubog vlaknastog koštanog tkiva, njegove resorpcije, razvoja sinusoida i stvaranja retikularne strome, koja se potom ponovno naseljava hematopoetskim elementima. U ovom slučaju, broj progenitornih hematopoetskih stanica u procesu regeneracije tkiva koštane srži povećava se paralelno s povećanjem sadržaja hematopoetskih matičnih stanica.

Yu. Gerasimov i koautori (2001.) usporedili su promjene u broju hematopoetskih stanica i broju stromalnih progenitorskih stanica u pojedinačnim fazama procesa regeneracije. Pokazalo se da kvantitativne promjene u stanicama koštane srži u kiretiranoj kosti odgovaraju dinamici morfoloških karakteristika regeneracije. Autori povezuju smanjenje staničnog sadržaja u regeneratu tijekom prva tri dana sa smrću hematopoetskih stanica zbog nepovoljnog utjecaja mikrookruženja koje stvara proliferirajuće retikularno tkivo u očuvanoj koštanoj srži u području epifize, kao i s formiranjem žarišta osteoidnog tkiva u potonjem i oštećenjem krvnih žila tijekom kiretaže. 7.-12. dana porast razine nuklearnih stanica podudara se s pojavom pojedinačnih žarišta mijeloidne hematopoeze u zonama proliferacije stromalnih elemenata. 20. dana pojavljuju se značajna područja regenerirane koštane srži i dobro razvijeni sinusi, što je popraćeno značajnim povećanjem ukupnog broja stanica. Međutim, broj hematopoetskih elemenata tijekom tog razdoblja iznosi 68% kontrolne razine. To je u skladu s prethodno objavljenim podacima da broj hematopoetskih stanica nakon kiretaže doseže normu tek 35.-40. dana nakon operacije.

U ranom posttraumatskom razdoblju, glavni izvor za obnovu hematopoeze su lokalni stanični elementi sačuvani tijekom kiretaže. U kasnijim fazama, glavni izvor regeneracije hematopoetskog tkiva koštane srži su matične stanice koje repopuliraju slobodne stromalne zone. Što se tiče pojedinačnih kategorija stromalnih stanica (endotelnih, retikularnih i osteogenih), izvori koji osiguravaju njihovo formiranje tijekom reorganizacije šupljine koštane srži ostaju nejasni. Rezultati studije Yu. V. Gerasimova i koautora (2001.) pokazuju da je u koštanoj srži sačuvanoj nakon kiretaže koncentracija stanica koje tvore kolonije fibroblasta znatno veća nego u normalnoj koštanoj srži. Autori smatraju da kiretaža rezultira intenzivnijim selektivnim ispiranjem hematopoetskih stanica u usporedbi sa stromalnim stanicama koje tvore kolonije, a koje sudjeluju u formiranju strome i jače su povezane s njezinom glavnom supstancom od hematopoetskih stanica.

Dinamika promjene broja stanica koje tvore kolonije fibroblasta korelira s intenzitetom procesa osteogeneze, naknadnom resorpcijom koštanih trabekula i stvaranjem retikularne strome, koju naseljavaju hematopoetske stanice. Većina stromalnih progenitorskih stanica u navedenim uvjetima regeneracije formira grubo vlaknasto koštano tkivo i retikularnu stromu. U slučaju prijeloma femura u uvjetima produljene osteosinteze, 5. dana u zoni regeneracije povećava se koncentracija i broj stanica koje tvore kolonije fibroblasta, a tijekom razdoblja intenzivnog stvaranja kosti njihov se broj povećava 6 puta. Poznato je da stanice koštane srži koje tvore kolonije fibroblasta imaju osteogena svojstva. Broj stromalnih progenitorskih stanica povećava se prije naseljavanja kiretiranog područja koštane srži hematopoetskim stanicama. To je u dobrom skladu s podacima da stromalne stanice osiguravaju stvaranje hematopoetskog mikrookruženja. Očito je da stvaranje hematopoetskog mikrookruženja odgovara određenoj razini regeneracije stromalnog tkiva, a broj hematopoetskih stanica povećava se širenjem stromalne platforme pogodne za hematopoezu.

Od najvećeg su interesa podaci autora da se odmah nakon kiretaže povećava broj stromalnih progenitorskih stanica u udaljenim dijelovima kostura. Počevši od šestog sata pa sve do uključivo dvadesetog dana, u kontralateralnoj tibiji opaža se više nego dvostruko povećanje i koncentracije i broja stanica koje tvore kolonije fibroblasta. Mehanizam ovog fenomena vjerojatno je povezan s činjenicom da masivno oštećenje koštane srži dovodi do stvaranja velikog broja krvnih ugrušaka uz istovremeno uništavanje značajnog broja trombocita i oslobađanje faktora rasta izvedenog iz trombocita (PDGF) u krv, za koji se zna da uzrokuje proliferaciju stanica koje tvore kolonije fibroblasta smještene u tijelu izvan proliferativnog bazena. U eksperimentima na zečevima, lokalna primjena MSC-a potiče obnovu hrskavičnog tkiva kirurški oštećenog koljenskog zgloba, što se može povezati sa stvaranjem hondrocita koji potječu od injektiranih MSC-a. Međutim, reparativna regeneracija koštanih defekata u laboratorijskih štakora značajno je poboljšana korištenjem mezenhimalnih matičnih stanica zatvorenih u keramičkom okviru. Stoga se može pretpostaviti da ako ne RBOC, onda neki drugi faktor koji potječe iz oštećenih stromalnih stanica ima udaljeni stimulirajući učinak na proliferaciju mezenhimalnih progenitorskih stanica u intaktnim zonama koštane srži i potiče njihovu migraciju u područje defekta koštane srži. To je pak u suprotnosti s podacima iz literature iz prethodnih godina koji ukazuju na to da stromalne stanice odgovorne za mikrookruženje, za razliku od hematopoetskih stanica, nisu sposobne za migraciju i potječu iz lokalnih izvora.

Ipak, rezultati studije Yu. Gerasimova i koautora (2001.) pokazuju da mehanička trauma uzrokuje ne samo oštro restrukturiranje stromalnog tkiva u kiretiranoj kosti, već i značajne promjene u stromi u udaljenim intaktnim kostima, tj. postoji sistemski odgovor stromalnog tkiva na lokalnu traumu. Štoviše, kada se nanese politrauma - višestruka kiretaža - ova reakcija je pojačana i opaža se ne samo u operiranoj kosti i udaljenim dijelovima kostura, već i u limfoidnim organima, posebno u slezeni. Mehanizam takvog sistemskog odgovora stromalnog tkiva koštane srži i slezene na lokalnu traumu i politraumu ostaje nepoznat. Pretpostavlja se da je ovaj proces povezan s djelovanjem humoralnog faktora koji luči mezenhimalna stroma medularne šupljine koštane srži. Mogućnost proizvodnje hormonalnog faktora nespecifičnog za organ, odgovornog za proliferaciju stanica koje tvore kolonije fibroblasta, od strane stromalnih stanica koštane srži i slezene, dokazuju podaci o njihovoj aktivnosti stimuliranja kolonija u monoslojnim kulturama koštane srži.

U tom smislu, vrijedi napomenuti da se sustavnom primjenom multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica njihovi derivati repopuliraju ne samo u koštanoj srži, već i u drugim tkivima, što se posebno koristi za gensku terapiju. Pokazalo se da intravenskom primjenom velikih količina MSC-a s divljim tipom genoma miševima s mutacijom u genu kolagena I, donorske stanice zamjenjuju do 30% stanica u koštanom i hrskavičnom tkivu primatelja, a transficirane mišje mezenhimalne matične stanice koje luče ljudski IL-3 učinkovito podržavaju hematopoezu tijekom 9 mjeseci u slučaju njihove istovremene primjene s ljudskim hematopoetskim matičnim stanicama imunodeficijentnim miševima.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Genetska modifikacija mezenhimalnih matičnih stanica

Među uspjesima eksperimentalne genetske modifikacije MSC-a, vrijedi istaknuti transfekciju gena faktora IX u ljudske MSC-e s naknadnim prijenosom transfektantnih stanica na imunodeficijentne miševe, što dovodi do pojave antihemofilnog faktora B u krvi tijekom 8 tjedana nakon transplantacije. U ovom eksperimentu provedena je posttranslacijska modifikacija faktora IX pomoću y-glutamil karboksilaze u transficiranim stanicama. Transdukcija MSC-a retrovirusnim vektorom koji kodira ljudski faktor IX bila je manje uspješna - naknadna primjena ovih stanica psu s hemofilijom B osigurala je terapijsku razinu faktora IX, održavajući normalan intenzitet koagulacijske hemostaze, samo 12 dana.

Transplantacija mezenhimalnih matičnih stanica u moždani parenhim životinja pokazala je da se nezrele stanice donora transformiraju u neuronske i glialne populacije. Usađivanje neuronskih derivata zdravog mezenhimalnog tkiva donora teoretski omogućuje ispravljanje genetskih abnormalnosti metabolizma mozga u bolesnika s Gaucherovom bolešću i drugim poremećajima metabolizma lipida, gangliozida ili ugljikohidrata.

Eksperimentalna potraga za uvjetima za transdiferencijaciju matičnih stanica strome koštane srži u progenitorske stanice živčanog i jetrenog tkiva je u tijeku. Pažnja istraživača usmjerena je na kombinacije induktora diferencijacije i posebnih uvjetovanih medija. Konkretno, za izolaciju primarne kulture stromalnih stanica, stanice koštane srži isprane i resuspendirane u DMEM/F12 (1/1) mediju za kulturu s 10% fetalnog telećeg seruma zasijavaju se gustoćom od 200 000/cm2. Nakon 24 sata, neprianjajuće stanice se uklanjaju, a stanice slične fibroblastima pričvršćene na plastiku uzgajaju se jedan tjedan. Za diferencijaciju stromalnih stanica koštane srži u neuroblaste koristi se uvjetovani medij dobiven trodnevnim uzgojem primarne kulture mišjih embrionalnih fibroblasta, kao i DMEM/F12 medij (1/1) s 2% fetalnog telećeg seruma i dodatkom 20 ng/ml NF ili 10-6 M retinoične kiseline (neuroinduktori koji se koriste za neuronsku diferencijaciju mišjih i ljudskih embrionalnih matičnih stanica). Diferencijacija stromalnih stanica koštane srži u prekursorske stanice hepatocita inducira se u uvjetovanom mediju nastalom kao rezultat trodnevnog uzgoja primarne kulture mišjih embrionalnih stanica jetre u DMEM/F12 mediju (1/1) uz dodatak 10% fetalnog telećeg seruma.

Ovdje treba još jednom napomenuti da su stanice strome koštane srži koje tvore kolonije heteromorfne i mogu se podijeliti u dva tipa. Prvi tip uključuje stanice slične fibroblastima koje tvore filopodije s velikim jezgrama i jednom ili dvije nukleole. Drugi tip predstavljaju male vretenaste stanice. Prilikom uzgoja stanica obje vrste u uvjetovanom mediju dobivenom na hranjivom sloju primarnih mišjih embrionalnih fibroblasta, stanice slične neuroblastima pojavljuju se u kulturi 3. do 4. dana. U ovoj fazi najčešće imaju vretenasti oblik s jednim ili dva duga nastavka koji završavaju filopodijama. Rjeđe su piramidalne ili zvjezdaste stanice s kratkim dendritima. Dendriti nekih neuroblasta imaju karakteristična proširenja (pupoljci rasta) i grane u svom distalnom dijelu, dok drugi imaju izrazite konuse rasta s filopodijama, kroz koje dendriti rastu. Slične morfološke značajke (pupoljci i konusi rasta s filopodijama) svojstvene neuroblastima koji se diferenciraju u neurone detaljno su opisane u studijama o neurogenezi. Na temelju toga, neki autori zaključuju da su stanice koje su pronašli u kulturi neuroblasti. Posebno su E. Shchegelskaya i suradnici (2002.) nakon kultiviranja primarne kulture stromalnih stanica tijekom dva tjedna u uvjetovanom mediju koji se mijenjao svakih 3. do 4. dan otkrili da su neke od stanica proliferirale dok su zadržale nediferencirano stanje. Izvana su takve stanice nalikovale fibroblastima i otkrivene su u kulturi zajedno s diferencirajućim neuroblastima. Većina stanica (oko 80%) bila je u različitim fazama diferencijacije u stanice živčanog tkiva, prvenstveno u neurone. Dendritični nastavci tih stanica bili su u bliskom kontaktu jedni s drugima, tako da su stanice postupno formirale dijelove živčane mreže na supstratu u obliku dugih višestaničnih niti. Dendritični nastavci neuroblasta postali su znatno dulji, neki od njih premašili su duljinu samog tijela neurona za 8-10 puta. Udio piramidalnih i zvjezdastih stanica postupno se povećavao. Dendriti zvjezdastih stanica su se granali. Prema autorima, kasnija diferencijacija piramidalnih i zvjezdastih stanica u usporedbi s vretenastim stanicama odgovara slijedu faza normalne neurogeneze u životinja. Kao rezultat toga, autori zaključuju da matične stanice strome koštane srži prolaze kroz induciranu neurogenezu, tijekom koje se sve tri glavne vrste neurona formiraju iz neuroblasta in vitro. Prekursori živčanih stanica također su otkriveni tijekom uzgoja stanica strome koštane srži tijekom 3-4 dana u mediju s 2% fetalnog seruma i 20 ng/ml LIF-a. Ali u ovom slučaju, matične stanice su se dijelile vrlo sporo, diferencijacija neuroblasta dogodila se samo u 30% slučajeva i nisu formirale neuronske mreže. Koristeći retinoičnu kiselinu kao jedan od induktora diferencijacije živčanih stanica, autori su dobili do 25-30% živčanih stanica u kulturi,s pretežno glijalnim elementima - astrocitima i oligodendrocitima. Neuroni su činili samo trećinu svih živčanih stanica, iako su bili zastupljeni sa sve tri vrste: vretenaste, piramidalne i zvjezdaste stanice. Šestog dana uzgoja stromalnih stanica u mediju s retinoičnom kiselinom, živčane stanice su postale diferenciranije, a aksoni su pronađeni u pojedinačnim piramidalnim neuronima, koji se u normalnoj neuroontogenezi pojavljuju kasnije od formiranja dendritičnih nastavaka. Prema autorima, unatoč niskom prinosu živčanih stanica, metoda indukcije retinoičnom kiselinom ima svoje prednosti: oligodendrociti i astrociti obavljaju mijelinacijske i nutritivne funkcije tijekom rasta dendrita i aksona te su neophodni za normalno stvaranje živčanog tkiva. Stoga je za popravak oštećenih područja in vivo bolje koristiti suspenziju neurona obogaćenu glijalnim stanicama.

U drugoj seriji eksperimenata, autori su pokušali inducirati diferencijaciju stromalnih stanica koštane srži u stanice jetre. Nakon tri dana uzgoja stromalnih matičnih stanica koštane srži u uvjetovanom mediju dobivenom inkubacijom mišjih embrionalnih hepatocita, pronađene su velike, sferne stanice, često binuklearne, s citoplazmatskim inkluzijama različitih veličina. Ove stanice bile su u različitim fazama diferencijacije i razlikovale su se po veličini, broju jezgri i inkluzijama u citoplazmi. U većini tih stanica otkriven je glikogen, na temelju čega su ih autori identificirali kao prekursorske stanice hepatocita. Budući da u kulturi nisu pronađene stanice slične neuroblastima, zaključeno je da uvjetovani medij dobiven kao rezultat uzgoja embrionalnih hepatocita nije imao faktore diferencijacije živčanih stanica i, obrnuto, sadržavao je faktore koji induciraju diferencijaciju stromalnih stanica koštane srži u prekursorske stanice hepatocita. Zaključno, autori sugeriraju prisutnost pluripotentnosti u stromalnim stanicama koštane srži, budući da se one in vitro diferenciraju u stanice živčanog ili jetrenog tkiva ovisno o specifičnom uvjetovanom mediju i korištenim induktorima.

Neke studije su doista ispravno pokazale diferencijaciju stromalnih stanica koštane srži u kardiomiocite, hrskavicu, koštano i živčano tkivo. Postoje dokazi da među stanicama koštane srži postoje populacije matičnih stanica sposobnih za diferencijaciju u hepatocite. U svjetlu ovih podataka, rezultati gore navedenih eksperimenata na miševima i dalje se mogu smatrati daljnjom potvrdom prisutnosti pluripotentnih mezenhimalnih matičnih stanica u koštanoj srži sposobnih za diferencijaciju u stanice različitih tkiva odraslog organizma.

Transplantacija mezenhimalnih matičnih stanica

U kliničkoj transplantologiji, ljudske mezenhimalne matične stanice mogu se koristiti za osiguranje širenja hematopoetskih matičnih stanica, kao i njihovih ranih prekomitetnih potomaka. Posebno, uvođenje autolognih hematopoetskih matičnih stanica i MSC-a oboljelima od raka nakon kemoterapije visokim dozama ubrzava obnovu broja neutrofila i trombocita u perifernoj krvi. Alo- i autologne transplantacije mezenhimalnih matičnih stanica koriste se za liječenje multiplog mijeloma, aplastične anemije i spontane trombocitopenije - bolesti povezanih s primarnim defektom u stromi hematopoetskog tkiva. Učinkovitost stanične terapije u onkohematološkoj patologiji u mnogim je slučajevima veća uz istovremenu primjenu stromalnih i hematopoetskih matičnih stanica, što se očituje smanjenjem postoperativnog razdoblja obnove hematopoeze, smanjenjem broja smrtnih ishoda zbog neselektivnog uništavanja regionalnih i cirkulirajućih stanica raka, pri čemu umiru i vlastite progenitorske hematopoetske stanice pacijenta. Izgledi korištenja MSC-a i drugih multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica u kliničkoj praksi posljedica su relativne lakoće njihovog dobivanja iz aspirata koštane srži, širenja u kulturi i transfekcije terapijskih gena. Istodobno, lokalna implantacija multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica može se koristiti za kompenzaciju lokalnih defekata tkiva, a u slučaju sistemskih disfunkcija tkiva mezenhimalnog podrijetla nije isključeno njihovo unošenje u opći krvotok.

Autori radova, u kojima se analiziraju izgledi za korištenje MSC-a za lokalnu, sistemsku transplantaciju i gensku terapiju s gledišta biologije stromalnih stanica, oprezniji su u svom razmišljanju. Postnatalna koštana srž tradicionalno se smatra organom koji se sastoji od dva glavna sustava jasno definiranih staničnih linija - samog hematopoetskog tkiva i potporne strome povezane s njim. Stoga su se mezenhimalne matične stanice koštane srži u početku smatrale isključivo izvorom stromalne osnove za proizvodnju regulatornih čimbenika hematopoetskog mikrookruženja. Zatim se pozornost istraživača prebacila na proučavanje uloge MSC-a kao matičnog izvora skeletnih tkiva. Najnoviji podaci ukazuju na neočekivani potencijal za diferencijaciju stromalnih stanica koštane srži s formiranjem živčanog ili mišićnog tkiva. Drugim riječima, mezenhimalne matične stanice pokazuju transgermalnu plastičnost - sposobnost diferencijacije u tipove stanica fenotipski nepovezane sa stanicama izvornog tkiva. Istodobno, neki aspekti biologije stromalnih stanica koštane srži ostaju nejasni i neriješeni kako u općem biološkom smislu tako i u pojedinačnim detaljima, uključujući identifikaciju, prirodu, podrijetlo, razvoj i funkciju in vivo stromalnih stanica koštane srži, kao i dopušteni potencijal diferencijacije ex vivo i mogućnosti terapijske primjene in vivo. Podaci dobiveni o potencijalu MSC-a, kao i rezultati studija regenerativnog potencijala drugih matičnih stanica, u oštroj su suprotnosti s dogmama utvrđenim u biologiji.

Kada se uzgajaju pri niskoj gustoći, stromalne matične stanice koštane srži tvore zasebne kolonije, od kojih svaka potječe iz jedne progenitorske stanice. Postotak stromalnih progenitorskih stanica u nukleiranim stanicama koštane srži, određen sposobnošću stvaranja kolonija, uvelike ovisi o uvjetima uzgoja i vrsti MSC-a. Na primjer, kod glodavaca je prisutnost ozračenih hraniteljskih stanica koštane srži i seruma u kulturi apsolutno neophodna za dobivanje maksimalnog broja stromalnih progenitorskih stanica, dok je kod ljudi učinkovitost stvaranja kolonija mezenhimalnih matičnih stanica neovisna i o hranitelju i o mediju za uzgoj. Broj poznatih mitogenih čimbenika koji stimuliraju proliferaciju stromalnih progenitorskih stanica je ograničen. To uključuje PDGF, EGF, FGF, TGF-b i IGF1. U optimalnim uvjetima uzgoja, poliklonske MSC linije mogu izdržati više od 50 staničnih dioba in vitro, što omogućuje dobivanje milijardi stromalnih stanica koštane srži iz 1 ml aspirata.

Međutim, populacija stromalnih stanica koštane srži je heterogena, što se očituje i varijabilnosti u veličinama kolonija, različitim brzinama njihovog formiranja i raznolikošću stanične morfologije, koja pokriva raspon od vretenastih do velikih ravnih stanica nalik fibroblastima. Tijekom razvoja takvih kultura, fenotipska heterogenost se također primjećuje nakon 20 dana. Neke kolonije karakterizira visoka ekspresija alkalne fosfataze, druge je uopće ne eksprimiraju, a kolonije trećeg tipa su fosfataza-pozitivne u središnjem području i fosfataza-negativne na periferiji. Pojedinačne kolonije tvore nodule koštanog tkiva (početak mineralizacije matrice označen je bojenjem alizarin crvenom bojom ili za kalcij prema Van Kossu). U drugim kolonijama dolazi do nakupljanja masti, što se identificira G-bojenjem uljno crvenom bojom. Rjeđe, kolonije mezenhimalnih matičnih stanica tvore hrskavice obojene alcian plavilom).

Nakon ektopične transplantacije u eksperimentalne životinje, poliklonske MGK linije tvore ektopičnu kost s retikularnom stromom povezanom s mijelopoezom i adipocitima, a rjeđe s hrskavičnim tkivom. Kada se transplantiraju monoklonske linije stromalnih stanica koštane srži, u nekim slučajevima se opaža himerizam, u kojem se de novo kost sastoji od stanica koštanog tkiva, sadrži stromu i adipocite donorskog podrijetla, dok stanice hematopoetske loze i krvožilnog sustava potječu od primatelja.

Rezultati ovih studija potvrđuju matičnu prirodu progenitorskih stanica strome koštane srži iz kojih je izvedena klonska linija. Također ukazuju na to da nisu sve stanice klonogene u kulturi uistinu multipotentne matične stanice. Neki istraživači vjeruju, a mi dijelimo njihovo mišljenje, da se najpouzdanije informacije o stvarnom potencijalu diferencijacije pojedinačnih klonova mogu dobiti samo in vivo nakon transplantacije, a ne određivanjem fenotipa njihovih derivata in vitro. Ekspresija fenotipskih markera osteo-, hondro- ili adipogeneze u kulturi (određenih mRNA ili histokemijskim tehnikama), pa čak ni proizvodnja mineraliziranog matriksa, ne odražavaju stupanj pluripotentnosti pojedinačnog klona in vivo. Stoga je identifikacija matičnih stanica u skupini stromalnih stanica moguća samo a posteriori, pod odgovarajućim uvjetima biološkog transplantacijskog testa. Konkretno, hondrogeneza se vrlo rijetko opaža u otvorenim transplantacijskim sustavima, dok je stvaranje hrskavice daleko od neuobičajenog u zatvorenim sustavima poput difuzijskih komora ili in vitro mikromasenih kultura stromalnih stanica, gdje se postiže lokalna niska napetost kisika, što potiče stvaranje hrskavičnog tkiva. Stoga, čak i tehnika transplantacije, kao i nespecifični uvjeti in vitro kulture, značajno utječu na raspon diferencijacije MSC-a.

Eksperimentalna transplantacija pod određenim eksperimentalnim uvjetima zlatni je standard za određivanje potencijala diferencijacije stromalnih stanica koštane srži i ključni element u njihovoj identifikaciji. Povijesno gledano, studije o transplantaciji stromalnih stanica koštane srži povezane su s općim problemom transplantacije koštane srži. Utvrđeno je da se hematopoetsko mikrookruženje stvara transplantacijom staničnih linija strome koštane srži i omogućuje ektopični razvoj hematopoetskog tkiva u zoni transplantacije. Podrijetlo mikrookruženja od donora i hematopoetskog tkiva od domaćina omogućuje nam da ektopičnu kost smatramo pravom „invertiranom“ transplantacijom koštane srži. Lokalna transplantacija stromalnih stanica koštane srži potiče učinkovitu korekciju koštanih defekata, izraženiju nego kod spontane reparativne regeneracije. Nekoliko predkliničkih studija na eksperimentalnim modelima uvjerljivo je pokazalo mogućnost korištenja transplantacija stromalnih stanica koštane srži u ortopediji, iako je potreban najpažljiviji rad i analiza kako bi se optimizirale ove metode, čak i u najjednostavnijim slučajevima. Posebno, optimalni uvjeti za širenje osteogenih stromalnih stanica ex vivo još nisu uspostavljeni, struktura i sastav idealnog nosača, kao i broj stanica potrebnih za volumetrijsku regeneraciju kosti, ostaju nerazvijeni.

Osim upotrebe ex vivo ekspandiranih stromalnih stanica koštane srži za regeneraciju tkiva mezenhimalnog podrijetla, neortodoksna plastičnost MSC-a otvara potencijalne primjene za regeneraciju živčanih stanica ili isporuku genskih produkata u središnji živčani sustav. U načelu, to pojednostavljuje staničnu terapiju za oštećenje živčanog sustava, budući da nema potrebe za dobivanjem autolognih ljudskih živčanih matičnih stanica. Prijavljene su potencijalne primjene stanica koštane srži za stvaranje kardiomiocita i miogenih progenitornih stanica i pravog stromalnog i ekstrastromalnog podrijetla.

Provode se eksperimenti o sistemskoj transplantaciji stromalnih stanica koštane srži za liječenje uobičajenih bolesti kostura. Nema sumnje da su stromalne stanice koštane srži populacija odgovorna za genetske poremećaje u bolestima kostura, što dobro ilustrira vektorski prijenos genetskih informacija pomoću tih stanica, što dovodi do stvaranja patološkog koštanog tkiva kod eksperimentalnih životinja. Međutim, sposobnost stromalnih stanica da se implantiraju, usađuju, proliferiraju i diferenciraju u kostima kostura nakon unošenja u opći krvotok još nije dokazana.

To je dijelom zato što se kod standardne transplantacije koštane srži stroma ne transplantira zajedno s hematopoetskim tkivom, pa strogi kriteriji za procjenu uspješnog usađivanja sistemski primijenjenih stromalnih stanica tek trebaju biti razvijeni. Treba imati na umu da prisutnost marker gena u tkivnim ekstraktima ili izolacija stanica donorskog podrijetla u kulturi ne ukazuje na usađivanje stanica, već samo na njihovo preživljavanje. Čak i intraarterijska injekcija stromalnih stanica koštane srži u mišji ud može dovesti do praktički nultog usađivanja, unatoč činjenici da se stanice donorskog podrijetla nalaze u velikom broju unutar mikrovaskulature koštane srži. Nažalost, takve se stanice obično opisuju kao "usađene" jednostavno na temelju detekcije marker gena za donorske stanice u ex vivo kulturi. Osim toga, moraju se pružiti uvjerljivi dokazi o dugoročnoj integraciji diferenciranih i funkcionalno aktivnih stanica donorskog podrijetla u proučavana tkiva. U mnogim objavljenim radovima koji izvještavaju o usađivanju stromalnih stanica koštane srži u kostur, upečatljiv je nedostatak jasnih podataka ove vrste. Međutim, treba napomenuti da su neki ispravni pokusi na životinjama doista utvrdili ograničeno, ali stvarno usađivanje stromalnih progenitorskih stanica nakon njihove sistemske primjene.

Ovi podaci su u skladu s rezultatima studija o mogućnosti dostave miogenih progenitorskih stanica koštane srži u mišić putem krvožilnog sustava. Međutim, ne treba zaboraviti da se i skeletno i mišićno tkivo formiraju tijekom razvoja i rasta na temelju ekstravaskularnih kretanja stanica koja koriste migracijske procese koji ne uključuju cirkulaciju krvi. Ako postoji neovisan cirkulacijski put za dostavu progenitorskih stanica u tkiva čvrste faze, je li moguće pretpostaviti postojanje fiziološki cirkulirajućih mezenhimalnih progenitorskih stanica? Koje je podrijetlo tih stanica i u organizmu u razvoju i u postnatalnom organizmu i kako prodiru u krvožilnu stijenku? Rješenje ovih pitanja čini se apsolutno nužnim i zahtijeva najpažljiviju predkliničku analizu. Čak i nakon što se pronađu odgovori na ova pitanja, problematični kinetički aspekti povezani s rastom kostura i pregradnjom vezivnog tkiva ostat će neriješeni. Istodobno, liječenje poremećaja osteogeneze zamjenom cijele populacije mutiranih skeletnih progenitorskih stanica zdravim stromalnim elementima čini se stvarnom kliničkom perspektivom. U ovom slučaju, lokalne zone prijeloma ili deformacije zbog patološke osteogeneze, kao i destruktivne promjene u koštanom tkivu, mogu se ispraviti korištenjem stromalnih matičnih stanica uzgajanih in vitro. Stoga je preporučljivo usmjeriti buduća istraživanja na probleme transformacije ili genetske korekcije autolognih mutiranih osteogenih progenitorskih stanica ex vivo.

Genetski inženjering stanica, kratkoročni ili trajni, postao je osnova stanične i molekularne biologije, izvor mnogih znanstvenih otkrića o ulozi pojedinih proteina u staničnom metabolizmu in vitro i in vivo. Korištenje molekularnih tehnologija za korekciju nasljedne patologije i ljudskih bolesti vrlo je obećavajuće za praktičnu medicinu, budući da svojstva stromalnih matičnih stanica koštane srži omogućuju razvoj jedinstvenih transplantacijskih shema za korekciju genetskih bolesti kostura. Istovremeno, mezenhimalne prekursorske stanice mogu se lako dobiti od budućeg primatelja, podložne su genetskoj manipulaciji i sposobne su se razmnožavati u velikim količinama u kratkom vremenskom razdoblju. Korištenje mezenhimalnih matičnih stanica omogućuje izbjegavanje ograničenja i rizika povezanih s izravnom dostavom genetskog informacijskog materijala pacijentu putem intravaskularnih vektorskih konstrukata. Slična strategija primjenjiva je i na embrionalne matične stanice, ali autologne postnatalne stromalne stanice koštane srži poželjniji su materijal, budući da njihovo uvođenje isključuje moguće imunološke komplikacije nakon transplantacije. Za postizanje kratkoročnog učinka, na primjer, za ubrzanje regeneracije kostiju, najoptimalnija metoda je genetska modifikacija mezenhimalnih matičnih stanica korištenjem elektroporacije, kemijske fuzije, lipofekcije, plazmida i adenovirusnih konstrukata. Posebno se virusna transfekcija u stromalne stanice koštane srži BMP-2 pokazala učinkovitom u ubrzavanju regeneracije kostiju kod eksperimentalne politraume. Stvaranje adenovirusnih vektorskih konstrukata je poželjnije zbog odsutnosti toksičnosti. Međutim, genetska modifikacija stromalnih stanica koštane srži u ovom slučaju karakterizira se izuzetno niskom stabilnošću. Osim toga, normalne transformirane stromalne stanice koštane srži zahtijevaju upotrebu vektorskih nositelja genetskih informacija koji su 10 puta zarazniji od drugih tipova stanica, što značajno povećava postotak smrti transficiranih stanica.

Liječenje recesivnih bolesti uzrokovanih niskom ili nultom biološkom aktivnošću određenih gena zahtijeva dugotrajnu ili trajnu modifikaciju mezenhimalnih matičnih stanica, što zahtijeva upotrebu adeno-asociiranih virusa, retrovirusa, lentivirusa ili adeno-retrovirusnih himera. Transportne regije ovih virusa sposobne su za prijenos velikih DNA transfekata (do 8 kb). Znanstvena literatura već je izvijestila o egzogenoj biološkoj aktivnosti stromalnih stanica koštane srži transficiranih retrovirusnim konstruktima koji kodiraju sintezu regulatornih i marker molekula - IL-3, CD2, faktora VIII, kao i enzima uključenih u sintezu L-DOPA. Međutim, čak i u tim studijama autori ističu niz ograničenja koja je potrebno prevladati prije praktične primjene ove tehnologije. Prvi problem je optimizacija procesa modifikacije MSC-a ex vivo. Poznato je da dugotrajna (3-4 tjedna) proliferacija stromalnih stanica koštane srži in vitro smanjuje njihovu transfekciju. Istodobno, za postizanje visoke razine genetske modifikacije MSC-a potrebno je provesti nekoliko ciklusa transfekcije. Drugi problem povezan je s trajanjem terapijske ekspresije gena, koje još ne prelazi četiri mjeseca. Prirodno smanjenje učinkovite ekspresije gena posljedica je inaktivacije promotora i smrti modificiranih stanica. S općim izgledima prijenosa genetskih informacija pomoću mezenhimalnih matičnih stanica, rezultati preliminarnih studija ukazuju na potrebu za daljnjom optimizacijom ex vivo metoda transfekcije, odabirom adekvatnog promotora koji regulira biološku aktivnost u željenom smjeru i povećanjem sposobnosti modificiranih stromalnih stanica koštane srži za samoodržavanje in vivo nakon transplantacije. Treba napomenuti da upotreba retrovirusnih konstrukata za modificiranje stromalnih stanica koštane srži u željenom smjeru ne zahtijeva uvijek njihovo obvezno usađivanje. Transficirane mezenhimalne matične stanice mogu obavljati korektivnu funkciju na pozadini stabilnog boravka i bez obveznog aktivnog fizičkog uključivanja i funkcioniranja u vezivnom tkivu. U ovom slučaju, treba ih smatrati biološkom mini-pumpom koja in vivo proizvodi faktor čiji nedostatak određuje manifestaciju genetske patologije.

Upotreba transformiranih stromalnih stanica koštane srži za liječenje dominantne genetske patologije, koju karakterizira ekspresija gena s patološkom ili abnormalnom biološkom aktivnošću, mnogo je problematičnija, budući da je u tom slučaju potrebno blokirati prijenos ili implementaciju iskrivljenih genetskih informacija. Jedna od metoda genetskog inženjeringa je homologna rekombinacija embrionalnih matičnih stanica kako bi se stvorile transgene životinje. Međutim, izuzetno nizak stupanj homologne rekombinacije u kombinaciji s problemima identifikacije, odvajanja i širenja takvih rekombinanata vjerojatno neće doprinijeti širokoj upotrebi ove metode u bliskoj budućnosti, čak i ako se razviju nove tehnološke metode. Drugi pristup u genskoj terapiji dominantne patologije temelji se na automatskoj korekciji oštećene DNA, budući da se genetske mutacije mogu ispraviti uvođenjem egzogene DNA sa željenim slijedom (kratki DNA oligonukleotidi ili himerni RNA/DNA oligonukleotidi), koja se veže na homologe u oštećenom genomu. Treća opcija uključuje blokiranje prijenosa patoloških informacija, što se postiže upotrebom posebno dizajniranih oligonukleotida koji se vežu na specifični gen kako bi formirali ternarnu spiralnu strukturu koja eliminira mogućnost transkripcije.

Iako korekcija genetske bolesti na razini genoma ostaje najoptimalnija i najpoželjnija terapijska metoda, mRNA je također obećavajući vektor (moguće čak i pristupačniji) za blokiranje dominantno negativnog gena. Proteinske molekule s antisense oligonukleotidima ili potpunim sekvencama koje blokiraju vezanje mRNA na stanični biosintetski aparat dugo se koriste za inhibiciju translacije i/ili povećanje degradacije mRNA. Osim toga, dvolančana RNA inducira brzu degradaciju mRNA, čiji mehanizam ostaje nejasan. Međutim, malo je vjerojatno da će sama eliminacija mRNA transkribiranih s mutantnog alela s kratkim ili pojedinačnim mutacijama potaknuti ekspresiju mRNA normalnog alela. Alternativa je upotreba ribosinteza tipa čekićaste i ukosnice, koje imaju sposobnost vezanja na visoko specifične regije mRNA s naknadnom indukcijom njihovog cijepanja i inaktivacije tijekom translacije. Mogućnost korištenja ove metode u terapiji patološke osteogeneze trenutno se proučava. Bez obzira na to što je točno cilj - genomski ili citoplazmatski elementi, uspjeh novih tehnologija genske terapije bit će određen učinkovitošću uključivanja reagensa u stromalne stanice koštane srži ex vivo, optimalnim odabirom specifičnog vektora i stabilnom sposobnošću mezenhimalnih matičnih stanica da in vivo eksprimiraju potrebne faktore.

Dakle, otkriće mezenhimalnih matičnih stanica s njihovim neočekivanim svojstvima stvara novu konceptualnu shemu za razvoj staničnih linija. Međutim, potrebna su daljnja interdisciplinarna istraživanja kako bi se razumjela biološka uloga stromalnih matičnih stanica, njihova priroda, sposobnost transdiferencijacije ili dediferencijacije, njihov fiziološki značaj tijekom embrionalnog razvoja, postnatalnog rasta, sazrijevanja i starenja, kao i kod ljudskih bolesti.