Mesenchimalne matične stanice

Među regionalnim matičnim stanicama, mezenchimalne matične stanice (MSCs) zauzimaju posebno mjesto, čiji derivati čine stromalnu matricu svih organa i tkiva ljudskog tijela. Prioritet u istraživanju MSC-a pripada predstavnicima ruske biološke znanosti.

U sredini prošlog stoljeća u laboratoriju Friedenstein je prvi put izoliran homogenu kulturu multipotentnih strome koštane srži matičnih stanica. Mezenhimalne matične stanice vezan na supstrat dugo zadržavaju visoku stopu proliferaciju, i kulture pri niskom gustoćom nakon fiksiranja na podlogu načinjen od stanica fibroblasta klonova ima fagocitskih aktivnost. Zaustavljanje MSC proliferacije rezultiralo je njihovom spontanom in vitro diferencijacijom u kost, masnoću, hrskavicu, mišiće ili vezivnog tkiva. Daljnja istraživanja pokazala osteogenog potencijal fibroblastu sličnim strome koštane srži različitih vrsta sisavaca, kao i aktivnosti koje tvore kolonije. U in vivo pokusima se pokazalo da i hetero- i ortotopičnog transplantacija tvori stanice fibroblasta kolonija dovršen formiranje kosti, hrskavice, te vlaknaste masnog tkiva. Od strome matičnih stanica koštane srži karakterizira visoki kapacitet za samo-obnavljanja i diferencijacije kontrapunkta unutar iste stanične linije, oni su pozvani multipotentnih mezenhimalne ishodišnih stanica.

Treba napomenuti da su za 45 godina fundamentalnog istraživanja mezenhimalnih matičnih stanica stvoreni stvarni uvjeti za korištenje njihovih derivata u kliničkoj praksi.

Danas nema sumnje da su sva tkiva ljudskog tijela formirana iz matičnih stanica različitih staničnih linija kao rezultat procesa proliferacije, migracije, diferencijacije i sazrijevanja. Međutim, u novije vrijeme, vjerovalo se je da su matične stanice u odraslom tijelu specifične za tkivo, tj. Sposobne su proizvoditi specijalizirane stanične linije samo tkiva u kojima se nalaze. Ova konceptualna situacija opovrgnuta činjenicama transformacije hematopoetskih matičnih stanica ne samo u staničnim elementima periferne krvi, već iu ovalnim stanicama jetre. Osim toga, i neuronske matične stanice bile su u stanju stvoriti i neurone i glialne elemente, kao i rane linije hematopoetskih progenitorskih stanica. S druge strane, mezenhimalne matične stanice, koje obično proizvode stanične elemente kostiju, hrskavice i masnog tkiva, mogu transformirati u živčane matične stanice. Pretpostavlja se da su u procesu rasta, fiziološke i reparativne regeneracije tkiva neobvezene progenitorske stanice generirane iz tkivno specifičnih rezervnih stabljika. Na primjer, popravak mišićnog tkiva može se ostvariti pomoću mezenhimalnih matičnih stanica koje migriraju iz koštane srži na skeletne mišiće.

Iako takve križ zamjenjivost matične stanice prepoznaju ne sve istraživače mogućnost kliničke upotrebe mesenchvmal matičnih stanica kao izvor stanične transplantacije i stanica vektora genske informacije nije sporno što multipotentnim strome matičnih stanica koštane srži, što može biti relativno lako izolirati i propagiraju u kulturi in vitro. U isto vrijeme u znanstvenoj literaturi i dalje pojavljuju izvješća o potencijalu pluripotentne matične stanice strome koštane srži. Kao dokaz predstavila istraživačke protokole, koji pod utjecajem određene induciraju transdiferencijacija od MSC se pretvaraju u živčane stanice, kardiomiocitima i hepatocitima. Međutim, neki znanstvenici priliku da ponovno aktiviranje i ekspresije gena tijekom rane embriogeneze u ozbiljnu sumnju. U isto vrijeme, svatko razumije da, ako se nalaze uvjeti za proširenje multipotentnih mezenhimalne matične stanice za pluripotency od ESCs u regenerativne medicine i plastike automatski riješiti mnoge probleme etičkog, moralnog, religioznog i pravne prirode. Nadalje, budući da se u ovom slučaju izvor matičnih regenerativne sposobnosti pacijenta su autologne stanice strome je riješen i problem imunološkog odbacivanja transplantacije stanica. Koliko su stvarni takvi izgledi, pokazat će se bliska budućnost.

[1], [2], [3], [4]

Indikacije za postupak

Upotreba mezenhimalnih matičnih stanica u medicini

Korištenje Klinika derivata mczcnhimnog matičnih stanica je povezana prvenstveno smanjenje nedostataka tkiva uzrokovanih velikim i dubokim toplinskih oštećenja kože. Pretklinički eksperimentalno vrednovanje prikladnosti transplantiranih fibroblasta nalik mesenchvmal matičnih stanica za liječenje dubokih opeklina je provedena. Pokazano je da su fibroblasti poput koštane srži mesenchvmal matične stanice čine monosloj u kulturi, što ga čini moguće da ih presaditi kako bi se optimizirala regeneraciju dubokih opeklina. Autori navode da su slični objekti embrionalne fibroblaste, no klinička primjena potonji je ograničena na postojećim etičkim i pravnim problemima. Duboko toplinsko sagorijevanje s oštećenjem svih slojeva kože modelirano je na Wistar štakorima. Područje opeklina bilo je 18-20% ukupne površine kože. U prve pokusne skupine koja se sastoji od štakora s dubokim opeklinama i transplantacije alogeneičnih fibroblast-deriviranih mezenhimalnih matičnih stanica. Druga skupina koja se sastoji od životinja s dubokim opeklinama i trans-nasada alogeneičnih embrionalnih fibroblasta. Treća skupina kontrolnih štakora je omogućeno dubokim opeklinama, koji nije obavi staničnoj terapiji. Suspenzija fibroblast-deriviranih mezenhimalnih matičnih stanica i fibroblastu embriona je primijenjena na površini rane opeklina pipetirane u količini od 2 x 10 ⁴ stanica na 2. Dan nakon ekscizije snimanje modeliranje i nekrotične eshara formirana. Nakon transplantacije stanice snimiti površinu pokrivenu gazom natopljenom izotonične otopine natrijevog klorida s gentamicina. Ograda stanice koštane srži da bi se dobio MSC s potom indukcijom fibroblasta linije u mezenhimalnih matičnih stanica dobivenih u odraslih Wistar štakora iz femuri. Fetalna pluća fibroblasti dobiveni su od 14-17 dana embrija. Embrionalne fibroblasti i stanice koštane srži da bi se dobila pre-MSC uzgajane su u Petrijevim zdjelicama, na 37 ° C u C02 iikubatore, u atmosferi s 5% CO2 pri 95% vlažnosti. Embrionalne fibroblaste su rasle kroz 4-6 dana, dok je za formiranje jednoslojne MSC potrebno od 14 do 17 dana. Nakon toga održava MSC zamrzavanja kao polazni materijal za fibroblast-deriviranih mezenhimalnih matičnih stanica koje su pripravljene otapanja i uzgoj MSC tijekom 4 dana. Broj fibroblasta generirani mezenhimalnih matičnih stanica je više od 3 puta više od embrionalnih fibroblasta nastalih tijekom istog razdoblja kulture. Identificirati stanice u transtslantirovannyh opeklinama u koraku uzgajanja njihova genoma označeni pomoću virusnog vektora prijevoza na temelju rekombinantne adenovirus tipa V nosač 1 aS-2 gena, koji kodira ß-galaktozidaze E.coli. Žive stanice u različitim vremenima nakon transplantacije otkriven imunohistokemijski u kriosekcijama s dodano supstrata X-Gal, dajući karakterističan plavo-zelene boje. Kao rezultat vizualnog dinamičan, planimetric i histološkom stanju evaluacije opeklina, utvrđeno je da je čak i na 3. Dan nakon transplantacije stanica u izoliranim skupinama pojavljuju značajne razlike tijekom proces zacjeljivanja rana. Posebno različita, ova je razlika postala sedmo dana nakon transplantacije stanica. Životinje iz prve skupine, koji su presađena fibroblasta poput mesenchvmal matičnih stanica, zacjeljivanje stekla jednako ružičastu intenzivnu boju, granulacije tkiva rastao tijekom cijelog područja na razini epidermisa i spali površine je znatno smanjen u veličini. Nekoliko formira tanji kolagen film na površinu rane, ali ona i dalje pokriva cijelo područje opekline. Životinje u drugoj skupini, koja su transplantirane embrionalne fibroblaste, granulacije tkiva se podiže na razinu epidermis rubova rane, ali samo u nekim mjestima, u isto vrijeme plazmoreya iz rane je intenzivniji nego u skupini 1, a najprije nastaje kolagen filma gotovo nestala. U životinja koje nisu primile matičnih stanica terapija, na 7. Dan spali rana je bila blijeda, bez koštice, nekrotično tkivo, obložena s fibrinom. Plasmorrhea je primijećena na cijeloj površini sagorijevanja. Histološki, životinje 1. I 2. Skupine pokazala je smanjenje stanične infiltracije i razvoja krvnih žila, ti znakovi početnoj procesa regeneratora su strože u štakora u grupi 1. U kontrolnoj skupini pokazala znakove staničnog rana infiltraciju, histološke uzorak novoformiranih krvnih žila odsutnim. 15-30-og dana promatranja životinje 1. Površine grupa burn bio znatno manji nego u štakora drugih skupina te granulaciju površina bila razvijenija. U životinja opekline površine 2. Grupa također je smanjen u odnosu s veličinom opeklina u kontrolnoj skupini štakora koji je zbog marginalne epitelizacije. U kontrolnoj skupini burn mjesta na površini ostao blijede granulaciju s rijetkim, koji se pojavljuju na njoj pauk vene, otočići bili fibrinozan ploča i dalje umjereno plazmoreya preko burn površine, nešto što je teško odvojivi krastu ostao. Općenito, životinje iz skupine 3, također smanjuje veličinu rane, a rana i dalje podrytymi ruba.

Tako, u usporednoj studiji zacjeljivanja rana stopa pomoću fibroblast-deriviranih mezenhimalne matičnih stanica i fetusa fibroblaste i bez korištenje stanične terapije označen ubrzanje zarastanja opeklina površine kao rezultat transplantacije fibroblast-deriviranih mezenhimalnih matičnih stanica i embrionalne fibroblaste. Međutim, u slučaju korištenja alogeneičkog mesenchvmal matične stanice fibroblasta zacjeljivanju rana, stopa bila viša nego u transplantaciji embrionalne fibroblaste. To se očituje u ubrzanju promjenu regeneracije fazama procesa - smanjenje stanične infiltracije razdoblja, povećava brzinu proliferacije vaskularnih mreža, kao i stvaranje granulacijskog tkiva.

Rezultati dinamičkog planimetrije pokazuju da je stopa spontanog ozdravljenja opeklina (bez uporabe stanica terapija) je najniža. Na 15. I 30. Dana nakon transplantacije alogeneičkih mesenchvmal matičnih stanica fibroblasta zacjeljivanju rana, stopa bila viša nego u transplantaciji embrionalne fibroblaste. Histokemijska metoda za detekciju beta-galaktozidaze pokazala da je nakon transplantacije fibroblasta nalik mesenchvmal matičnih stanica i embrija fibroblasta tijekom cijelog razdoblja promatranja na površini i duboko obnavljaju rana transplantirane stanice ostaju održiva. Autori sugeriraju da je viša stopa ozljeda regeneracije burn pomoću mezenhimalne matične stanice fibroblasta uvjetovanog puštanja sa ovih stanica tijekom dozrijevanja rostostimuliruyushih bioaktivnih faktora.

Transplantacija autolognih ili transplantiranih keratinocita i fibroblasta alogeneičkim za liječenje opeklina i koriste u klinici. Treba napomenuti da je kirurško liječenje djece s velikim dubokim opeklinama je složen zadatak s obzirom na visoku mnoštva trauma i kirurških zahvata, značajan gubitak krvi, o različitim reakcijama koriste infuziju mediji. Glavne poteškoće u provedbi kože i plastične kirurgije sa velikim dubokim opeklinama, područje prelazi 40% površine tijela, s obzirom na ozbiljnost njezina stanja i nedostatka sredstava donatora kože. Korištenje mreže transplantata s velikim omjerom perforacija ne riješi problem, budući da je slika nakon epiteliziruyutsya stanica perforacije je vrlo sporo, a često kože presađivanje lizira ili suho. Takvi premazi opeklinama što ksenokozha, leševa transplantata, sintetske filmski premazi nisu uvijek dovoljno učinkovito, tako da razvoj novih metoda za zatvaranje burn površinskih slojeva kulturan keratinocita i fibroblasta. Konkretno, metoda zatvaranja burn površine pomoću kulturan allofibroblastov pruža tijekom transplantacije izgovara stimulativni učinak na proliferaciju epidermotsitov sačuvane na granici rane na opekline, a keratinocita presađivanje mreže mreže. U Budkevich L. I sur (2000) prikazuje rezultate primjene ove metode za liječenje opeklina u djece. U istraživanju je sudjelovalo 31 djece s termalnim ozljeda u dobi od 1 godine do 14 godina. U tri dječje ukupne površine opeklinama IIIA-B - IV stupanj bio je 40%, 25 - 50 - 70%, čak i na tri - 71-85% površine tijela. Rani kirurški necrectomy u kombinaciji s transplantacijom uzgajanih allofibroblastov i autodermaplasty. U prvom tretiranju faza je provedena nekrotično ekscizije tkiva, drugi - na transplantaciju uzgajanih allofibroblastov nosača folije, treći (48 sati nakon transplantacije uzgajanih allofibroblastov) - uklanjanje matriksa i kože preklopa s autodermoplasty omjer probijanje od 1: 4. Tri pacijenta primljena u bolnicu s teškim opeklinama bolesti, kulturan allofibroblasty transplantirani su na granulaciju rane. Transplantacija kulturan allofibroblastov obavlja jednom u 18 djece, dva puta - u 11, tri - dva pacijenta. Područje površine rane, može zatvoriti kulture stanica u rasponu od 30 do 3500 cm2. Učinkovitost kulturan allofibroblastov ocijenjen s ukupnim postotkom usadenosti kože zaliske, vrijeme zarastanja opeklina i broja umrlih teške toplinske ozljede. Primitkapresatka bio potpun u 86% bolesnika. Djelomična neprizhivlenie kože zaliske navedeno u 14% slučajeva. Unatoč liječenju, šest (19,3%) djece je umrlo. Ukupna površina kože lezije su u rasponu od 40 do 70% površine tijela. Transplantacija kulturan allofibroblastov nema nikakve veze s smrti spali ozljeda jednog bolesnika.

Analizirajući rezultate liječenja, zaključili su da je prethodni opekline nespojive sa životom, za liječenje duboke toplinska oštećenja površine kože od 35-40% površine tijela (za malu djecu - do 3 godine - ključni su duboke opekline s površinom od 30%, za stariju djecu dobne skupine - gore od 40% površine tijela). Kada je kirurški transplantacija kulturan necrectomy allofibroblastov autodermaplasty i naknadne presadaka kože s velikim opeklinama, perforacija faktor IIIB - IV stupnja i dalje kritično, ali u ovom trenutku postoje izgledi u mnogim slučajevima da se spasi život čak i takvih žrtava. Kirurški necrectomy u suradnji s transplantacijom uzgajanih allofibroblastov i autodermaplasty u djece s dubokim opeklinama pokazala se posebno učinkovit u bolesnika s naprednim lezija kože s deficitom od donatora stranice. Aktivno kirurška taktika i presađivanje kulturan allofibroblastov promicanju brzog stabilizacije općeg stanja takvih pacijenata, smanjenje broja zaraznih komplikacija burn bolesti, stvaranje povoljnih uvjeta za presađivanja, smanjiti vrijeme za vraćanje izgubljene kožu i trajanje bolničkog liječenja, smanjenja incidencije smrtnosti u bolesnika s velikim opeklinama. Dakle, transplantacija kulturan allofibroblastov slijedi autodermaplasty kože zaliske postiže oporavak djece s teškim opeklinama, koja su prethodno bila osuđena na propast.

Opće je priznato da je primarni cilj liječenja bolesti spaljivanja maksimiziranje punog i brzog oporavka oštećene kože kako bi se spriječio toksični učinci, zarazne komplikacije i dehidracija tijela. Rezultati primjene kultiviranih stanica u velikoj mjeri ovise o pripravnosti za transplantaciju samog plamena. U slučajevima transplantacije kultiviranih keratinocita na površinu rane nakon kirurškog necrectomy prizhivlyaetsya prosječno 55% (po području) transplantiranih stanica, dok se za granulaciju rane primanje presatka brzina se smanjuje na 15%. Stoga, uspješno liječenje opsežnih opekotina duboke kože zahtijeva, prvenstveno, aktivnu kiruršku taktiku. U prisustvu plastičnih rana IIIB-IV, površina sagorijevanja odmah se oslobađa iz nekrotičnih tkiva kako bi se smanjili učinci opijenosti i smanjili broj komplikacija bolesti spaljivanja. Uporaba takvih taktika je ključ za smanjenje vremena od vremena spaljivanja do zatvaranja rane i dužinu boravka pacijenata s opsežnim opeklinama u bolnici, ali i značajno smanjuje broj smrtnih slučajeva.

Prva izvješća o uspješnoj uporabi kultiviranih keratinocita za pokrivanje površine opeklina pojavila su se početkom osamdesetih godina prošlog stoljeća. Kasnije, ova manipulacija je provedena uz pomoć slojeva kultiviranih keratinocita, dobivenih najčešće iz autostruktura, mnogo rjeđe od allokeratinocita. Međutim autokeratinotsitoplastiki tehnologija ne dopušta da se stvoriti staničnu banku, a vrijeme potrebno za proizvodnju dovoljne površine mladica iz keratinocita, visoka i iznosi 3-4 tjedna. Tijekom tog perioda, rizik od razvoja zaraznih i drugih komplikacija bolesti sagorijevanja se značajno povećava, što znatno produžuje ukupnu duljinu boravka pacijenata u bolnici. Nadalje, gotovo bez autokeratinotsity prizhivlyayutsya transplantacija za granuliranje opekline, a visoke cijene specijaliziranih medija rasta i biološki aktivni stimulanse rasta keratinocita značajno ograničava njihovu kliničku primjenu. Ostali biotehnološke metode kao što kollagenoplastika transplantacije ksenokozhi krio konzerviran kao i korištenje različitih biopolimera premaza povećati učinkovitost površinsku obradu opsežnih, ali ne duboko opeklina. Postupak prevlačenja površine rane s kultiviranim fibroblastima bitno je različit u tome što glavna komponenta kultiviranog staničnog bazena nije keratinociti, već fibroblasti.

Preduvjet za razvoj metode služio kao dokaz da pericitima koje okružuju male žile su pro- genitornymi mezenhimalne stanice sposobne za transformaciju u fibroblaste, koje proizvode mnoge faktore rasta i pružaju zacjeljivanje rana zbog jakog stimulirajućeg učinka na proliferaciju i prianjanje keratinocita. Korištenjem kultiviranih fibroblasta za zatvaranje rana površine odmah identificiran je niz značajnih prednosti ove metode u odnosu na uporabu kulturan keratinocita. Konkretno, priprema fibroblasta u kulturi ne zahtijeva upotrebu posebnih kultura medija i rasta promotora, što smanjuje troškove transplantacije više od 10 puta trošak dobivanja keratinocita. Fibroblasti lako podvrgnuti pasaža, tijekom kojeg su djelomično gube površina tkivne podudarnosti antigena, što pak omogućuje korištenje za proizvodnju transplantatima stanica i stvaranje svojih korita. Skraćuje primanjem transplantata, spremne za upotrebu u klinici, od 3 tjedna (keratinocita) 1-2 dana (za fibroblaste). Primarne kulture fibroblasta može se dobiti kultiviranjem stanica iz kože fragmenata uzetih u autodermoplasty i stanica za sijanje gustoće subkulture Po primitku humanih fibroblasta je samo 20 × 10 ³ po 1 cm ².

Za proučavanje učinaka fibroblasta i njihove regulatorne proteine u proliferaciji i diferencijaciji keratinocita, usporednu analizu karakteristika i morfologiju proliferaciju keratinocita na podloge kolagena tipa I i III i fibronektina u ko-kulturi s ljudskim fibroblaste. Ljudske keratinocite izolira se od komadića kože bolesnika s opeklinama, snimljene tijekom autodermoplasty rada. Gustoća keratinocita bila je 50 x 103 stanica po cm2. Klinička učinkovitost transplantacije kultiviranih fibroblasta procijenjena je 517 pacijenata. Svi pacijenti su bili podijeljeni u dvije skupine: 1. - odrasle žrtve s opeklinama IIA, The - IV stupnja; 2. - djeca s dubokim opeklinama IIIB - IV stupnja. Procjena dinamike strukturne i funkcionalne organizacije u hranidbeni lanac fibroblasta s obzirom na ulogu u procesu regeneracije glukozaminoglikana, fibronektina, kolagen, te se ostavi autori kako bi se utvrdilo je treći dan kako najpovoljnijim uvjetima korištenja kultura fibroblasta za proizvodnju presadnica. Istraživanje utjecaja na proliferaciju fibroblasta i diferencijaciju keratinocita pokazali da se pod in vitro fibroblasti imaju izraženu stimulirajući učinak, prvenstveno na keratinocita procesima adhezijskih, povećanje broja athcrcntnih stanica i stopu popravljajući više od 2 puta. Adhezije stimulacija procese praćene povećanom intenziteta sinteze DNK i razine proliferacije keratinocita. Nadalje, nađeno je da prisustvo fibroblasta i ekstracelularnog matriksa nastalog od njih je preduvjet za nastanak tonofibrillyarnogo Uređaj keratinocita međustanične veze, i na kraju, za diferencijacijom keratinocita i stvaranja bazalne membrane. U liječenju djece s dubokim opeklinama osnovana kliničku djelotvornost transplantacija allofibroblastov kulture, osobito u bolesnika s velikim lezijama donatora kože mjesta u deficitu. Kompleks morfofunktcionalnoe studija pokazala je da graft naznačen fibroblasti aktivni sinteze DNA, kao i kolagen, fibronektin i glikozaminoglikani, koji nastaju u stanicama ekstracelularnog matriksa. Autori sugeriraju visok postotak usadenosti transplantiranih fibroblaste (do 96%), oštro smanjenje u smislu njihove pripreme (u roku od 2-3 sati umjesto od 24-48 tjedana u slučaju keratinocita), znatno ubrzanje epitelizacije površine spali, i značajno smanjenje cijene (u 10 puta) graft raste tehnologija fibroblasta u usporedbi s transplantacijom keratinocita. Korištenje transplantacije uzgajanih allofibroblastov omogućuje spasiti živote djece s kritičnim opeklina - opeklinama preko 50% tjelesne površine, koji je prethodno mislilo nespojiva sa životom. Važno je napomenuti da alogeneična transplantacija embrionalnih fibroblasta i uvjerljivo pokazao ne samo brži regeneraciji rana i oporavak bolesnika s različitim stupnjem opekotina i područja, ali i značajno smanjenje smrtnosti.

Autologna fibroblasti su korišteni u tom kompliciranom i plastične kirurgije kao oštećenje korekcije zamjena glasnica. Obično se koristi za tu svrhu goveda kolagena, trajanje djelovanja, koja je ograničena imunogenosti. Biti stranog proteina, goveda kolagena, kolagenazom osjetljiv na primatelja i može uzrokovati imunološke reakcije, kako bi se smanjio rizik koji su razvijeni tehnologija kolagenih priprema, umreženi s glutaraldehidom. Njihova prednost je veća stabilnost i manje imunogenosti, koji je našao praktičnu primjenu u uklanjanju nedostataka i glasnica atrofije. Autologna kolagen injekcije su prvi put korišteni u 1995. Metode uvjetom očuvanje primarne strukture autolognih kolagenih vlakana, uključujući enzimima kataliziranu intramolekularnih međuveza. Činjenica da se prirodna vlakna kolagena su otporni na razgradnju kolagena proteazama od rekonstituiranog telopeptida kod kojega se reže. Integritet telopeptida važno za kvaterne strukture kolagenih vlakana i umreženja kolagena između susjednih molekula. Za razliku od pripravaka iz volovskog kolagena, autologne kolagen ne uzrokuje imuni odgovor kod primatelja, ali to nije dovoljno učinkovito ispunja kao sredstvo. Uporna korekcija se može postići s obzirom na lokalnu proizvodnju autologne transplantacije kolagena fibroblaste. Međutim, istraživanje učinkovitosti transplantacije autolognih fibroblasta u klinici otkrila neke poteškoće. U ranom razdoblju poslije transplantacije fibroblasta klinički učinak bio slabiji u usporedbi s onom nakon davanja volovskog kolagena. Kada kulturan autologna fibroblasti ne može isključiti mogućnost transformacije normalnih fibroblasta u abnormalne, tzv miofibroblasta, odgovorne za razvoj fibroze i ožiljaka, o čemu svjedoče smanjenje kolagen gela, zbog specifične interakcije fibroblasta i kolagenskih vlakana. Nadalje, nakon serijskog pasaže su fibroblasti in vitro gube sposobnost za sintezu proteina izvanstaničnog matriksa.

Međutim, trenutno eksperimentalna tehnika usavršio uzgoj ljudskih autolognih fibroblaste, koji eliminira gore navedene nedostatke i dovodi do onkogenim transformaciju normalnih fibroblasta. Autologni fibroblasti dobiveni ovom metodom koriste se za popunjavanje nedostataka mekih tkiva lica. U studiji G. Keller et al (2000) su primili tretman od 20 pacijenata u dobi od 37 do 61 godina, s bora i atrofičnog ožiljaka. Biopsijom (4 mm) BTE regija se transportirati u laboratorij u sterilne epruvete koje sadrže 10 ml medija za kulturu (Dulbecco antibiotika mikoseptikom, piruvat i fetalni goveđi serum). Materijal je stavljen unutar 3-5 jela kulture promjera 60 mm i inkubiran u termostatu s atmosferom koja sadrži 5% CO2. Nakon 1 tjedan, stanice su uklonjene iz posuda pomoću tripsina i stavljene u fiole od 25 cm2. Stanice se daju pacijentima u iznosu od 4 x 107. Značajan i dugotrajan klinički učinak bio je u bolesnika s korekciju nasolabial nabora, te u bolesnika s ožiljcima nakon 7 i 12 mjeseci nakon trećeg transplantacije autolognih fibroblaste. Prema protočnoj citometriji, uzgojeni fibroblasti proizvode veliku količinu kolagena tipa I. In vitro studije prikazane su normalne kontraktilnosti injekcijskih fibroblasta. Nakon 2 mjeseca nakon supkutane injekcije kulturi fibroblasta u dozi od 4 x 107 stanica u golim miševima, otkrivene su tumori. Injekcijski fibroblasti nisu uzrokovali nastanak ožiljaka i difuznu fibrozu kod bolesnika. Prema autoru, primanje presatka autolognih fibroblasta su u stanju dosljedno proizvoditi kolagen koji daju kozmetički pomlađivanje. U ovom slučaju, budući da je vijek trajanja diferenciranih stanica je ograničen, fibroblasti, preuzete iz mladog pacijenta, su učinkovitiji od onih dobivenih u starijih osoba. U budućnosti, pretpostavlja se mogućnost zamrzavanja kultiviranih fibroblasta uzetih od mladog donatora biti transplantirani kasnije starijeg pacijenta vlastitih mlade stanice. U zaključku, to nije sasvim točno zaključak da autologna fibroblasti, pod uvjetom da njihova funkcionalna sigurnost idealni su za ispravljanje nedostataka lica mekih tkiva. U tom slučaju, i sam autor ističe da je tijekom istrage pojavile i neke problematične situacije u vezi s uporabom autologne sustava kolagena fibroblasta. Klinički učinak bio je često slabiji nego kod uporabe goveđeg kolagena, što je izazvalo razočaranje kod bolesnika.

Općenito govoreći, podaci o izgledima kliničke upotrebe mezenhimalnih matičnih stanica vrlo su optimistični. Pokušaji se koriste za uporabu autolognih multipotentnih mezenhimalnih progenitor stanica koštane srži za liječenje degenerativnih lezija zglobova. Prva klinička ispitivanja kultiviranih mezenhimalnih progenitorskih stanica u liječenju složenih fraktura kostiju provode se. Autolognih i alogene mezenhimalne stanice strome koštane srži koji se koriste za generiranje hrskavice tkiva za transplantaciju u korekciju grešaka zglobne hrskavice zbog traume ili autoimunih lezija. Prakticiraju metode kliničke primjene multipotentnih mesenchvmal ishodišne stanice ispraviti koštanih defekata u djece s teškim tijeku osteogenesis uzrokovane mutacijama gena kolagena tipa. Nakon mieloabelyatsii djece-primatelja presađenog koštane srži iz HLA-kompatibilnim zdravog donora kao nefrakcionirani koštane srži mogu sadržavati dovoljnu količinu matičnih stanica mezenhimalnih napuniti ozbiljne nedostatke kosti. Nakon transplantacije, alogeneične koštane srži takva djeca obilježila pozitivna histološke promjene u trabekularnom kosti, povećanje stope rasta i smanjenje pojavnosti prijeloma kostiju. U nekim slučajevima, pozitivan klinički rezultat postiže se presađivanjem blisko povezanih alogena koštane srži i osteoblasta. Za liječenje kongenitalne krhkosti kosti zbog neravnoteže osteoblasta i osteoklasta u koštanom tkivu, također se koristi transplantacija MSK. Obnova stvaranja kosti u ovom slučaju postiže se zbog kimerizacije bazena stromnih stanica stabljike i progenitora u koštanom tkivu pacijenata.

Postupci genetske modifikacije donorskih mezenhimalnih matičnih stanica poboljšavaju se kako bi se ispravili genetski defekti stromalnih tkiva. Pretpostavlja se da mezenhimalne ishodišne stanice uskoro će se koristiti u neurologiji za stanice smjera kimerizacijom mozga i stvoriti bazen zdrave stanice, sposobne za generiranje nedovoljan enzima ili faktor odgovoran za kliničke manifestacije bolesti. Transplantaciju matičnih stanica mezenhimalnih može koristiti za vraćanje stromi koštane srži u pacijenata s karcinomom, nakon kemoterapije i radioterapije, te u kombinaciji sa stanicama koštane srži, - za obnovu hematopoeze. Razvoj supstitucijske terapije u cilju otklanjanja nedostatke lokomotornog sustava korištenjem MSC promicati inženjeringa u matricu ili biomaterijala biomimics tvore kostura obitavaju na potomstvo mezenhimalnih matičnih stanica.

Priprema

Izvori mezenhimalnih matičnih stanica

Glavni izvor mezenhimalnih matičnih stanica koštane srži hematopoetskih matičnih stanica koje u sisavaca stalno diferenciraju u krvnih stanica i imunološkog sustava, dok su mezenhimalne matične stanice predstavili male populacije fibroblasta poput koštane srži stanica strome i pomažu u održavanju nediferencirani stanje krvotvornih matičnih stanica. Pod određenim uvjetima, mezenhimalne matične stanice se razlikuju u stanicama hrskavice i koštanog tkiva. Kada stavljene na mediju za kulturu u niskom gustoćom sadnje strome mononuklearnih stanica koštane srži tvore kolonije priljepljenih stanica, koji, u stvari, su fibroblasti multipotentnih mezenhimalne stanice preteče. Neki autori su predložili da koštana srž pohranjena neopredijeljeni mesenchvmal matične stanice koje, zahvaljujući sposobnosti kako bi se obnovile i visoki potencijal diferencijacije, pružaju sve tkiva u tijelu prethodnika mesenchvmal stanice strome tijekom života organizmu sisavaca.

U koštanoj srži elementi stromalnih stanica tvore mrežu koja ispunjava prostor između sinusoidnih i koštanog tkiva. Sadržaj uspavane MSC-a u koštanoj srži odrasle osobe usporediv je s brojem hematopoetskih matičnih stanica i ne prelazi 0,01-0,001%. Mesenchimalne matične stanice izolirane od koštane srži i nisu podvrgnute uzgoju su bez molekula ljepila. Takvi MSC ne eksprimiraju CD34, ICAM, VCAM, kolagene tipa I i III, CD44 i CD29. Stoga, u vitro mezenhimalne matičnih stanica nije fiksiran na podlozi kulture i napredniji ishodišne izveden mezenhimalnih matične stanice su formirana citoskeltne komponente i aparatura receptora molekula stanične adhezije. Stromalne stanice s fenotipom CD34 se nalaze čak iu perifernoj krvi, iako su mnogo manje u koštanoj srži od CD34 pozitivnih mononuklearnih stanica. Stanice CD34 izolirane iz krvi i prebačene u kulturu pričvršćene su na supstrat i tvore kolonije fibroblastičnih stanica.

Poznato je da u embrionalnom razdoblju stromalna baza svih organa i tkiva sisavaca i ljudi proizlazi iz zajedničkog bazena mezenhimalnih matičnih stanica prije i u fazi organogeneze. Stoga se vjeruje da bi u zrelom tijelu većina mezenhimalnih matičnih stanica trebala biti u vezivnom i koštanom tkivu. Utvrđeno je da većina staničnih elemenata strome labavog vezivnog i koštanog tkiva predstavlja predane progenitorske stanice koje, međutim, zadržavaju sposobnost proliferacije i stvaranja klonova in vitro. Uvođenjem takvih stanica u ukupni protok krvi, više od 20% mezenhimalnih progenitorskih stanica se ugrađuju među stromalnim elementima hematopoetskog tkiva i parenhima organa.

Potencijalni izvor mezenhimalnih matičnih stanica masnog tkiva, među kojima počinio matičnih stanica koje se nalaze u različitim stupnjevima adipocita preteča. Najmanje zreli ishodišne elementi masnog tkiva - strome vaskularne stanice, koji je isti kao i mezenhimalne multipotentnih preci koštane srži se diferenciraju u adipocite pod djelovanjem glukokortikoida, inzulinu sličan faktor rasta i inzulina. U kulturi stanica strome vaskularnih diferenciraju u adipocite i hondrocite i masnih stanica koštane srži za tkivo-izvedeni tvore adipocita i osteoblasta.

U mišićima su pronađeni izvori stromalnih stabljika. Primarne stanice kulture izolirane iz ljudskog skeletnog mišića, ukazuje obliku zvijezde stanice i multinuklearni myotubes. U prisutnosti zvjezdastih stanica konjskog seruma proliferirati in vitro bez znakova cytodifferentiation i nakon dodatka deksametazona u medij kulture diferencijacije karakteriziran pojavom staničnim elementima stanica s fenotipu kostura i glatkih mišića, kosti, hrskavice, i masno tkivo. Prema tome, u ljudskom mišićno tkivo predstavljao kao počinjene i neopredijeljeni multipotentnim mezenhimalnim preteča. Pokazano je da je populacija nezrelih stanica prisutnih u skeletnim mišićima dolazi iz neopredijeljeni multipotentnih koštane srži mesenchvmal ishodišnih stanica, a razlikuje se od miogenih satelitske stanice.

U miokarda od novorođenih štakora su također otkrili zvjezdaste stanice ljepila, prikladne za diferencijaciju potencijala multipotentnih mesenchvmal ishodišnih stanica, kao i pod utjecajem deksametazona su diferenciraju u adipocite, osteoblasta, hondrocita, glatkim mišićnim stanicama, myotubes u skeletnim mišićima i srčanih miocita. Pokazano je da su stanice glatkih mišića krvnih žila (pericita) izveden multipotentnih nediferencirani perivaskularnom mezenhimalne stanice preteče. U kulturi perivaskularnih mezenhimalnih matičnih stanica eksprimiraju-aktin glatkih mišića i receptor faktora rasta dobivenog iz trombocita i mogu se razlikovati najmanje glatke mišićne stanice.

Posebno mjesto u smislu matičnih rezervi uzima hrskavice, a vrlo niska reparativni potencijal se vjeruje da se zbog nedostatka multipotentnih mesenchvmal ishodišne stanice ili diferencijaciju i faktora rasta. Pretpostavlja se da prekommitirovannye da hondro- i osteogenesis multipotentnim mesenchvmal ishodišne stanice ulaze u tkiva hrskavice iz drugih izvora tkiva.

Porijeklo tkiva i uvjeti za provođenje mezenhimalnih progenitorskih stanica u tetivu također nisu utvrđeni. Ekspermentalnye opažanja ukazuju na to da ranog postnatalnog zečji Ahilove tetive stanica u primarnim kulturama u prvom prolazu i zadržati ekspresiju kolagenom tipa I i dekorin, a nakon daljnje kulture gube tenotsitov diferencijacije markera.

Treba napomenuti da je odgovor na pitanje je li doista lokaliziran u različitim tkivima multipotentnih mezenhimske ishodišne stanice su uvijek prisutne u stromi ili tkiva bazen mezenhimalnih matičnih stanica kompenzira migracije strome koštane matičnih srži stanica, to je još uvijek čekala.

Također, koštane srži i drugih mesenchvmal tkiva zone odraslih drugi izvor MSC može biti krvi iz pupkovine. Dokazano je da pupčana vrpca vena krv sadrži stanice koje imaju slične morfološke i antigene karakteristike s multipotentnih mezenhimske ishodišne stanice su sposobne prianjanja, a ne zaostaje multipotentnih mesenchvmal ishodišne stanice porijekla koštane srži, diferenciraju potencijal. U kulturama mezenhimalnih matičnih stanica krvi pupčane vrpce otkrivene 5 do 10% nedodijeljen multipotentnih mezenhimalnih preteča. Ispostavilo se da je njihov broj u krvi pupkovine je obrnuto proporcionalna gestacijske dobi, što je indirektni dokaz o migraciji multipotentnih mezenhimske nezrelih stanica u različitim tkivima tijekom fetalnog razvoja. Bilo je prve informacije o kliničkoj primjeni mezenhimnim matičnih stanica izoliranih iz krvi pupčane vrpce, kao i embrionalni izvedeni biomaterial, koji se temelji na poznatom sposobnost fetusa matičnih stanica integrirati i funkcija prizhivlyatsya u organima i sustavima tkiva odraslih primatelja.

Potraga za novim izvorima mezenhimalnih matičnih stanica

Korištenje mezenhimske matičnih stanica zametka porijekla, kao i drugih fetalnih stanica, stvara niz etičkih, pravnih, zakonskih i regulatornih pitanja. Stoga, potraga za ekstraembrijskim staničnim donatorskim materijalom nastavlja se. Pokušaj je bio neuspješan klinička primjena ljudskih fibroblasta kože, to je određena ne samo visoku financijsku sposobnost tehnologije, ali i brzu diferencijaciju fibrocita u fibroblasta koji imaju znatno manje potencijalni proliferaciju i proizvodnju ograničen broj faktora rasta. Daljnji napredak u području biologije i MSC su multipotentnih mezenhimalne koštane srži ishodišne stanice dopušteno da se razvije strategiju za kliničku uporabu autolognih mezenhimske matičnih stanica. Tehnologija njihovo izdvajanje, uzgoj, razmnožavanje ex vivo, a režirao diferencijacije potrebno, prije svega, proučavanje spektra molekularnih markera MSC. Njihova analiza je pokazala da je u primarnim kulturama ljudskog koštanog tkiva, postoji nekoliko tipova multipotentnih mezenhimske ishodišne stanice. Proosteoblastov fenotip pronađena u stanicama koje eksprimiraju marker ishodišne stanice mož-1 stromalni, ali ne nose obilježivača osteoblasta - alkalnu fosfatazu. Takve stanice su karakterizirani slabom mogućnošću da se dobije mineralizirano koštani matriks, kao i nedostatak ekspresije osteopontina i paratiroidni hormon receptora. Derivati stroboskop-1 pozitivnih stanica koje ne izražavaju alkalnu fosfatazu, privremenom i potpuno diferencirane osteoblasta. Utvrđeno je da su stanični elementi kloniranih linija mož-1 pozitivnih stanica ljudskog trabekularne kosti su sposobni razlikovanja u zrele adipocite osteocite i. Smjeru diferencijacije ovih stanica ovisi o izloženosti polinezasićenih masnih kiselina, - proupalnih citokina IL-1B i faktora tumorske nekroze (TNF-a), kao protu-upalni i imunosupresivna TGF-b.

Kasnije je utvrđeno da multipotentnih mezenhimalne stanice preteče nedostaju specifična samo njima svojstveni fenotip, ali izraziti kompleksne markere karakteristične za mesenchvmal, endotelne, epitelne i mišićnim stanicama u nedostatku izraza hematopoetskih stanica immunophenotypic antigena - CD45, CD34 i CD14. Osim toga, matične stanice i mezenhimalne konstitutivno induciran proizvodnju hematopoetskih i nehematopoetskih faktora rasta, interleukini, kemokini, te i u multipotentnih mezenhimalnih stanica prekursora izražene receptora za neke faktore rasta i citokina. Među stanice strome osnove ljudskog tijela pronađena dormantnye ili odmaraju stanice s imunofenotipa, gotovo identične antigenske profil sirove 5-fluorouracil multipotentnih mesenchvmal ishodišne stanice - one i druge stanice izražavaju CD117, označavanje „za odrasle” matične stanice.

Stoga, marker stanica koji je jedinstven za mezenhimalne matične stanice još nije uspostavljen. Pretpostavlja se da se odmaraju stanice su neopredijeljeni populacije multipotentnih mezenhimalnih stanica prekursora jer oni ne izražavaju stanica markere predan osteoartritisa (Cbfa-1) ili adipogenezu (PPAR-y-2). Produžena izloženost mirujućih polako proliferaciju stanica s fetalnim telećim serumom rezultira stvaranjem terminalno diferencirane prekursora, koji karakterizira brzog rasta. Klonalni rast takvih matičnih stanica matičnih stanica podržava FGF2. Čini se da je genom-izvedeni strome matične stanice „zatvorene” široka dovoljno je izvijestio o nedostatku spontanog diferencijacije u MSC -. Bez posebnih uvjeta za počinjenju ni oni ne pretvaraju u stanice mczcnhimnog serije.

Proučiti strukturu populacije izveden mezenhimalne matične stanice pretražuju markera diferencijacije proteina na stanične linije strome i primarnim kulturama. U klonalnim testa kolonije stanica koštane srži in vitro utvrđeno da kada se podvrgne primarnim kulturama EGF povećava prosječnu veličinu kolonija i smanjuje klonsku ekspresiju alkalne fosfataze, dok dodatak hidrokortizona aktivira ekspresiju alkalne fosfataze koja je biljeg osteogenske diferencijacije MSC orijentacije. Monoklonska protutijela mož-1 omogućio je da se razdvajanje i studija populacije mož-1 pozitivnih stanica u adherentne heterogenom sistemu Dexter kulturama. Spektar citokina regulirati ne samo na proliferaciju i diferencijaciju hematopoetskih i limfne stanice, već također sudjeluju u formiranju, formiranja i resorpcije koštanog tkiva od strane para, auto-i endokrinih mehanizama. Receptora posredovano otpuštanje sekundarnih glasnika, kao što su, diacilglicerol cAMP, inozitol trifosfata i Ca2 + se također koristi za marker analizu različitih kategorija stromalnih tkiva stanica koje izlučuju relevantne receptore. Upotreba monoklonskih antitijela kao markeri mogu uspostaviti limfoidne organe strome pripadaju stanice retikularni za T i B-ovisnih zone.

Već neko vrijeme nastavio znanstvenu raspravu oko pitanja o mogućnosti podrijetlu MSC iz krvotvornih matičnih stanica. Doista, kada uzimanju suspenzije stanica koštane srži u hranidbeni lanac u kojem diskretne kolonije rastu fibroblaste. Međutim, pokazalo se da prisutnost prekursori fibroblasta kolonija i raznih klica diferencijacije krvotvornog tkiva kao dio koštane srži nije dokaz njihovog zajedničkog porijekla krvotvornih matičnih stanica. Koristeći diskriminantne analize matičnih stanica koštane srži utvrđeno da mikrookolina na heterotopične transplantacije, hematopoetske stanice koštane srži se prenosi, što dokazuje postojanje, u koštanoj srži neovisno od histogenetskih MSC populaciji hematopoietičnih stanica.

Osim toga, selektivna metoda kloniranja otkriva u jednoslojne kulture koštane srži stanica strome u novu kategoriju stanica prekursora odrediti njihov broj, na studij njihova svojstva, proliferativna i diferencijacije potencijal. Utvrđeno je da in vitro stanice strome fibroblastima sličnim proliferaciju i formiraju kolonije diploidnih kad reverzne transplantacije u tijelu osigurava formiranje novih organa krvotvornih. Rezultati istraživanja pojedinih klonova pokazuju da je populacija stanica u proliferativni i diferencijacije potencijal moći potraživati ulogu matičnih stanica strome tkiva, Gistogeneticheskaja neovisno o krvotvornih matičnih stanica u strome ishodišne stanice. Stanice populaciji karakterizira samoodrživog rasta prekurzorskih stanica i diferencirane elemenata kost, hrskavicu i koštane srži mrežaste tkiva.

Od velikog interesa su rezultati ispitivanja Chailakhyan R. Et al (1997-2001), koje su uzgojene dobiveni iz koštane srži strome ishodišne stanice zečevi, zamorci, i miševi a-MEM medija kulture nadomještenog s fetalnim telećim serumom. Uzimanju autori izvodi sa početnom gustoćom 2-4 x 103 stanica po srži 1 cm2. Što se koriste za umetanje homologni ili heterologni inaktiviranim zračenjem stanica koštane srži na umetanje doze potpornog djelovanja, ali potpuno blokirala proliferacije. Dvotjedne primarne diskretne kolonije fibroblasta su tripsinizirane da bi se proizveli monoklonalni sojevi. Dokaz klonske podrijetlo kolonije su dobiveni korištenjem kromosomskih markera u mješovitim kulturama koštane srži muških i ženskih zamoraca, vrijeme koje je proteklo snimanje živih kultura, kao i mješovitim kulturama koštane srži singeničnih miševa i CBA SVAT6T6. Transplantacija suspenzija svježe izoliranih stanica koštane srži uzgojenih in vitro ili stromalnih fibroblaste pod bubrežnu kapsulu provedeno je u porozni ivalonovyh skela ili želatina, kao i inaktivirane zečjim koštanu matricu. Transplant klonovi u poklopac kosti bedra zamorac očišćenog od mekog tkiva i periost, izrezati epifize i temeljito pranje koštane srži. Kost je izrezana na ulomke (3-5 mm), sušena i ozračena u dozi od 60 Gy. U koštunskim poklopcima, pojedinačne kolonije fibroblasta bile su postavljene i implantirane intramuskularno. Za intraperitonealnom transplantacije strome fibroblasta, uzgaja in vitro, upotrijebili smo tipovi difuzijsku komoru (V = 0,015 cm3, h = 0, l mm) i D (V = 0,15 cm 3, h = 2 mm).

Pri proučavanju dinamike rasta sojeva klonske Chailakhyan R. Et al (2001) su utvrdili da su pojedinačne stanice, fibroblaste formiraju kolonije, kao i njihovi potomci imaju veliki potencijal proliferacije. Od 10 prolaza broj fibroblasta u nekih sojeva je 1,2-7,2 x 10 ⁹ stanica. U procesu njihovog razvoja, izvršili su do 31-34 stanične dupliciranja. Tako heterotopičku transplantaciju sojeva dobiveni iz koštane srži formiranih strome prekursora nekoliko desetaka klonova dovelo do prijenosa mikrookoliša koštane srži i obrazovanju u novom zone hematopoetskog transplantacije organa. Autori postavio pitanje da li pojedini klonovi mogu tolerirati koštane srži mikrookoliša stanica strome, ili to zahtijeva suradnju nekoliko različitih klonogene strome pretka? A ako pojedini klonovi će biti u mogućnosti prenijeti mikroklima, da li je puna sva tri klice krvi, ili različite klonovi osigurati formiranje hematopoetskih mikro okolinu za različite klica? Za rješavanje tih problema je razvijena tehnologija uzgoj strome nezrelih stanica u kolagen gela koji vam omogućuje snimanje s površine fibroblasta uzgojenih kolonija za naknadnu heterotopične transplantacije. Pojedinačni klonovi stromalnog fibroblasta, stanice koštane srži se uzgajaju iz CBA miševa i zamoraca, rezano, zajedno s fragmentom prevlakom gela i transplantiranih heterotopične - pod bubrežnu kapsulu sinergičkih miševa ili autologne mišića trbuh zamoraca. Kada su transplantacije u mišiće, kolonije na gelu bile su smještene u kožne pokrivače.

Našli smo da je 50-90 dana nakon presađivanja koštane srži fibroblasta kolonija u 20% slučajeva su uočene u razvoju transplantacije kost ili kosti i krvotvornog tkiva. U 5% životinja primatelja oblikovan džepove kosti koje imaju šupljinu ispunjen koštane srži. Unutar koštane cilindrima takvi žarišta imaju zaobljen oblik i kapsula napravljena od koštanog tkiva, s osteocite i razvijenu osteoblasta sloj. šupljine koštane srži sadrži mrežaste tkanine s mijeloidne i eritroidnih stanica, proporcije koja se ne razlikuju od onih u normalnom koštane srži. Graft bubreg je tipičan medularni tijelo formira nativnog transplantacije koštane srži, gdje kosti kapsula obuhvaća samo medularni šupljinu od renalnu kapsulu. Olovno tkivo uključivalo je mieloidne, eritroidne i megakariocitne elemente. Strom medularne šupljine imao je dobro razvijen sinusni sustav i sadržavao je tipične masne stanice. U isto vrijeme na području transplantacije neke kolonije kosti bez znakova hematopoeze utvrđeno je pod bubrežnu kapsulu. Proučavanje proliferativni i diferencijacije potentnosti pojedinih klonova monoklonskih nastavljeno sojevima kunića koštane srži, a stanice su resuspendirane u mediju za kulturu i u posebnom ivalonovoy spužve težine 1-2 mg tucked pod bubrežnu kapsulu donatora zec koštane srži. Takva autotransplantacija podvrgnuta je stanicama od 21 monoklonska soja. Rezultati su uzeti u obzir tijekom 2-3 mjeseca. Autori su otkrili da 14% transplantiranih koštane srži monoklonskih sojeva formira tijelo sastoji od kosti i koštane srži šupljinu ispunjen hematopoetskih stanica. U 33% slučajeva transplantirane sojeva formira kompaktni kost s različitih veličina šupljina ostootsitami uglavljen u osteoblastičke i razvijenim sloja. U nekim slučajevima, spužve transplantirane klonovi razvio retikulum bez kosti ili hematopoetskih stanica. Ponekad retikularne formiranja strome dogodilo s dobro razvijenom mrežom sinusoida, ali ne i naselili hematopoetskih stanica. Tako su dobiveni rezultati bili slični onima dobivenim u transplantaciji klonova na kolagenskom gelu. Međutim, ako je transplantacija klonovi narasli na podlogu za posljedicu formiranje tkiva koštane srži je 5% kosti - 15%, a retikularni tkanina - u 80% slučajeva, transplantacija monoklonsko sojevi formiranje stanica koštane srži zabilježen je u 14% slučajeva kosti - u 53% i retikularno - u 53% slučajeva. Prema autorima, to znači da su uvjeti za provedbu proliferativni i diferencijaciju potencijala strome fibroblasta kada transplantirane na poroznom skele su više od optimalnog s njihovim transplantacija u kostima i obuhvaća supstrat kolagena. Nije isključeno da je korištenje naprednijih metoda uzgoja i transplantacije klonova povratne informacije može poboljšati uvjete za provedbu svojih klonova diferencijaciju potencijala i promjenu tih odnosa. Jedan ili drugi način, ali glavna vrijednost istraživanja leži u činjenici da su neki od klonova stanice strome sposobni za formiranje koštanog tkiva uz osiguranje strome hematopoetskih mikroklima odmah tri klice krvi koštane srži: eritroidnih, mijeloidnih i megakariocitičnih, stvara dovoljno velik uporišta hematopoetskih tkiva i neka koštana masa.

Nadalje, autori su riješili problem sposobnosti za ove vrste stanične diferencijacije pojedinih klonskih stromalnih progenitorskih stanica u uvjetima zatvorenog sustava difuzijskih komora. Nadalje, bilo je potrebno utvrditi je li pojedini klonovi pluripotentno izlagati ili zaslon za razlikovanje potencijala zahtijeva kooperativni interakciju nekoliko klonova s fiksnom znak cytodifferentiation, drugačiji odnos koji određuje povlašteni formiranje kostiju, hrskavice ili reticular. Kombiniranjem dvaju metodoloških pristupa - monoklonalno izolira koštane srži strome ishodišne stanice i presaditi ih u difuzijski komora, Chailakhyan R. Et al (2001) Dobiveni rezultati koji smiju pristupiti razumijevanje strukturne organizacije stromi koštane srži. Transplantacije monoklonska sojevi strome progenitorskih stanica u tip O stanica rezultirala formiranjem kosti i hrskavice oba tkiva, pokazujući mogućnost potomaka jednog kolonije stanica strome istovremeno formiraju kosti i hrskavice. Pretpostavka da kosti i hrskavi tkivo potječu iz zajedničke stromalne progenitorske stanice više puta se izražavaju. Međutim, ova hipoteza nije imala ispravnu eksperimentalnu potvrdu. Kosti i stvaranje hrskavice u difuzijski komora je potrebno dokazati postojanje matičnih stanica uključuju koštane srži stroma stanice preteče zajedničke ove dvije vrste tkiva.

Zatim 29 klonalne sojevi drugi i treći prolaza, primarne kulture izvedene iz koštane srži zeca se stave u difuzijski komore i intraperitonealno implantirane homologni životinjski. Istraživanja su pokazala da 45% monoklonskih sojeva koštane srži ima osteogene potencije. Izuzetno retikulirani materijal sadržan komore 9, ali s kosti i hrskavice tkiva je još uvijek prisutna u komorama 13, što predstavlja 76% svih sojeva. U komorama tipa O, gdje je diferencijacija bila moguća i kod kostiju i hrskavičnog tkiva, ispitivalo se 16 sojeva. U četiri komore (25%) formirao se i koštano i hrskavo tkivo. Ponovno Treba napomenuti da su istraživanja Chailakhyan R. Et al (2001) pojedinačne ishodišne stanice su podvrgnuti stanica soj koji sadrži od 31 do 34 dioba, a njihovo potomstvo bila 0.9-2.0 x 10 ⁹ stanice. Broj mitoze koji je izložen prekursorske stanice poliklonska sojeva ne razlikuju se od monoklonalnih sojeva stanica. Tako je stopa razvoja poliklonskih sojeva, osobito u prvoj fazi njihova nastajanja, u velikoj mjeri ovisi o broju kolonija koriste za pokretanje sojeva. Diploidnih sojeva humanih embrionalnih fibroblasta (WI-38) za 12-15 reklonirovanii th dvostrukom razine također formiraju kolonije različite promjera i u sadržaju stanica. Velike kolonije koje sadrže više od 103 stanica bile su samo 5-10%. S porastom broja podjela, postotak velikih kolonija se smanjio. Mono- i poliklonalna strome koštane srži sojeva fibroblasta zadržala diploidni skup kromosoma nakon 20 ili više dioba, a tendencija razvoja bio usporediv s dinamikom diploidnih sojeva embrionalnog fibroblasti. Analiza diferencijacije potencijala specifičnih strome koštane srži prekurzorskih stanica, koje je proveo presađivanja sojeva monoklonskih u difuzijski komorama je pokazala da je polovina od njih osteogenog. Velike kolonije činile su 10% ukupnog broja. Posljedično tome, broj stanica koje stvaraju osteogene kolonije odgovara približno 5% ukupne populacije. U ukupnoj masi osteogenih progenitorskih stanica identificiranih od strane autora postojale su stanice sposobne simultano stvarati koštano i hrskavo tkivo. Po prvi put utvrdio da je za ove dvije vrste tkiva u odraslom organizmu je zajednički prethodnik stanica: 25% testiranih klonova su stvoreni sličnim stanicama, a njihov broj u općoj populaciji nezrelih stanica nije bila manja od 2,5%.

Dakle, heterotopičkog transplantacija fibroblasta koštane srži pojedinačni klonovi otvorio nove aspekte strukturne organizacije populacije mezenhimalnih ishodišne stanice. Pronađeno strome ishodišne stanice sposobne za prijenos određeni mikrookoliša odmah za sve hemopoetskog kljun koji broj između ispitanih klonova veće na različitim modelima je od 5 do 15% (0,5-1,5% od ukupnog broja stanica detektira prekurzorskih). Uz klonova, prijenos kompletan mikroklima koštane srži, tu su ishodišne stanice, deterministički samo za formiranje kosti, koji oblik kada prebačen na otvoreni sustav, kosti koja ne podržava razvoj hematopoeze. Njihov broj iz ukupnog broja progenitorskih stanica iznosi 1,5-3%. Neke od tih stanica mogu oblikovati koštano tkivo s ograničenim vremenom samoodržanja. Slijedom toga, populacija stromalnih progenitorskih stanica heterogen je u svom potencijalu diferencijacije. Među njima postoji kategorija stanica, tvrdi ulogu strome matičnih stanica sposobnih za razlikovanje u sve tri dimenzije svojstvene koštane srži strome tkiva, formiranje kostiju, hrskavice i retikulirani tkiva. Ovi podaci nam omogućiti da se nadam da će uz pomoć raznih markera stanica će biti moguće utvrditi doprinos svakog tipa stanica strome u mikro okolini specifične organizacije i poduprijeti hematopoezu u Dexter kultura.

Tehnika

Značajke mezenhimalnih matičnih stanica

Posljednjih godina, su otkrili da u stacionarnim kulturama koštane srži mezenhimalne multipotentnih ishodišne stanice prikazana ograničen broj malih agranular stanica stanica (RS-1), koje karakterizira niska sposobnost kolonizacije i odsutnosti ekspresije Ki-67 antigen specifičan za razmnožavanje stanica. Antigene parametri dormantnyh RS-1 stanice se razlikuju od spektra počinjenih antigena brzo rastućim strome ishodišnih stanica. Utvrđeno je da je visoka proliferacija počinjenih progenitorskih stanica promatrana samo u prisustvu RS-1 stanica. S druge strane, RS-1 stanica povećava stopu rasta pod utjecajem čimbenika koje luče najdorađenijim izvedeni ishodišne stanice multipotentnim mezenhimalnim. Čini se da su stanice RS-1 podskup nekompliciranih MSC-a koji su sposobni za recikliranje. In vitro otporne na 5-fluorouracilu progenitorskih stanica strome koštane srži karakteriziran niskim sadržajem RNA i visoke razine ekspresije gena ornitin dekarboksilaze - marker nije proliferirajućim stanicama.

Intenzivna reprodukcija stromalnih progenitor stanica počinje nakon fiksacije na supstratu. Kada je to izražava marker profil slabo diferenciranih stanica: SH2 (TGF-receptor (3), SH3 (domena signalnih proteina), kolagen tipa I i III, fibronektin, VCAM-1 receptor (CD106) i ICAM (CD54), kadherin-11 , CD44, CD71 (transferin receptor), CD90, CD120a i CD124, ali bez ekspresije karakterističnih biljega hematopoetskih matičnih stanica (CD34, CD14, CD45). Klonske rasta omogućuje puta propušten mezenhimalne matičnih stanica kako bi se dobilo kulturu mnogih genetski homogene strome matične pluripotentne stanice. Cerea 2-3 prolaz njihov broj doseže 50-300 milijuna. U kulturi dovoljne gustoće nakon zaustavljanja širenja strome ishodišnih stanica, za razliku od hematopoetskih fibroblasti tkiva diferenciraju u adipocite, mišićnim stanicama, stanica hrskavice i koštanog tkiva. Kombinacija tri diferencijaciju regulatornih signala u koji sadrži 1-metil-izobutilksantin (induktorom unutarstaničnog formiranja cAMP), deksametazon (inhibitor fosfolipaze a i C) i indometacina (inhibitorom ciklooksigenaze, tromboksana i sniženje aktivnosti) pretvara se u adipociti do 95% progenitornih mezenhimalnih stanica. Tvorba adipocita nezrelih stanica strome potvrdila ekspresija gena lipoprotein lipaze, histokemijskim identifikaciju i apolipoproteina peroxysomal receptora. Stanice istog klona utjecajem TGF-b u mediju bez seruma stvara homogenu populaciju kondrocita. Kultura višeslojnog stanica hrskavice ekstracelularnog matriksa je naznačen razvija se sastoji od proteoglikana i kolagena tipa II. Hranjivi medij sa 10% fetalnog seruma učinak diferencijacije signala kompleks koji se sastoji od b-glicerofosfata (donator anorganski fosfat), askorbinska kiselina i deksametazon, u istim kulture strome ishodišnih prekurzorskih stanica dovodi do stvaranja agregata stanica. U takvim stanicama, postoji progresivno povećanje u aktivnosti alkalne fosfataze i osteopontin razine, što ukazuje na nastanak mineralizacije kostiju koje stanice potvrđena progresivno povećanje međustaničnog kalcija.

Prema nekima, sposobnost mezenhimalnih matičnih stanica podijeliti na neodređeno vrijeme, te umnožavanje različitih vrsta mczcnhimnog loze stanica u kombinaciji s visokim stupnjem plastičnosti. Kada se primjenjuje u klijetki, ili bijele tvari mezenhimalnih matične stanice migriraju u parenhimu živčanog tkiva i diferenciraju u neuronske i glija stanične linije izvedene. Osim toga, postoji informacija o MSC transdiferencijacija u hematopoetskih matičnih stanica in vitro, i in vivo. Više in-dubina analiza u nekim studijama utvrđene izuzetno visoke žilavosti MSC, koja se očituje u njihovu sposobnost diferencijacije u astrociti, oligodcndrocitc, neurona, kardiomiocitima, glatkih mišićnih stanica i stanica skeletnog mišića. U nekoliko studija transdifferentsirovochnogo potencijal MSC in vitro i in vivo su otkrili da multipotentnih mezenhimalne stanice preteče porijekla koštane srži terminalno diferenciraju u staničnim linijama koje tvore kosti, hrskavice, mišići, živci i masno tkivo, te tetiva i stromi koja podržava hematopoiezisa ,

Međutim, u drugim studijama, nema znakova ograničenja pluripotency genoma mezenhimalnih matičnih stanica te se ne može otkriti strome praotac stanične populacije, ali za provjeru mogućih pluripotentne stanice strome je istraženo više od 200 MSC klonovi izolirane iz primarne kulture. Velika većina in vitro klonova zadržala sposobnost da se diferenciraju u osteogeničkim, chondrogenic i adopogcnskoj smjerovima. Kada bez vjerojatnost migracije stanica primatelja nakon transplantacije mezenhimalnih matičnih stanica pod bubrežnu kapsulu ili u difuzijski komora pokazalo se da strome ishodišne stanice in situ zadržavaju heterogenog fenotip, što ukazuje ili odsutnost zone transplantata restrikcijskih faktora ili odsutnost sama pluripotentnih MSC. Istovremeno dozvoljeno postojanje rijetke vrste somatskih pluripotentne matične stanice, koje su zajedničke prekursori odraslih matičnih stanica.

Na multi, ali nije istina pluripotentne mezenhimalne matične stanice čine vrlo mali dio stanica koštane srži i sposobni, u određenim okolnostima, kada se uzgajaju in vitro se razmnožavati bez dolaska u diferencijacije, kao što pokazuje njihovu izazvanog loze opredjeljenje stanica u kosti, hrskavice, masti, mišićno tkivo , kao iu tenocitima i stromalnim elementima koji podupiru hematopoezu. Tipično, kontinuirano izlaganje u mediju za kulturu s fetalnim telećim serumom izaziva izlazne MSC u strome od angažiranih ishodišnih stanica, potomstvo koje prolazi kroz spontanu konačne diferencijacije. In vitro moguće postići formiranje smjera osteoblasta dodavanjem u medij uređaj deksametazon, ß-glicerofosfata i askorbinska kiselina, dok je kombinacija diferencijacije signala deksametazon i inzulin potiče tvorbu adipocitima.

Utvrđeno je da prije ulaska u fazu terminalne diferencijacije koštane srži MSC stvoriti određene uvjete kulture početku diferenciraju u fibroblasta nalik mesenchvmal matičnih stanica. Derivati tih stanica in vivo su uključeni u formiranju kosti, hrskavice, tetiva, masti i mišićnog tkiva, kao i strome podršku hematopoeze. Mnogi autori razumiju pojam „multipotentnih mezenhimalne ishodišne stanice”, kako zapravo MSC, a predani strome ishodišnih stanica i koštane srži mezenhimalne tkiva. Klonska analiza mezenhimalnih multipotentnih ishodišne stanice porijeklom iz koštane srži pokazala je da je nešto više od jedne trećine od klonova diferenciranih u osteoreumatoidnog hondro- i adipocite, dok druge klonove stanica imaju osteogenog potencijal i oblik samo hondro- i osteocitima. Ovaj klon multipotentnih mezenhimalnih stanica prekursora kao IUD-9, u odgovarajućim uvjetima mikrookruženje razlikuju u stanicama s fenotip i funkcionalnih svojstava ne samo iz osteoblasta, hondrocita i Adic potsitov ali stanice strome koji podupiru hematopoezu. Izoliran iz fetalnih stanica koštane srži štakora klon RCJ3.1 razlikuju mezenhimalne stanice različitih fenotipa. Kombiniranim djelovanjem askorbinske kiseline, b-glicerofosfata, i deksametazon iz staničnih elemenata tog klona je prvo dobiven multinuklearni miocite, a zatim sukcesivno, adipociti hondrociti i otočići mineralizirana kosti. Populacija granuliranih stanica iz periosteum fetusa štakora odgovara nedodijeljen multipotentnih mezenhimalnih prekurzorskih stanica, što karakterizira niska stopa proliferacije, ne eksprimiraju markera diferencijacije i razlikuju se u uvjetima kulture kako bi se dobilo hondro-, osteo- i adipocita i glatkih mišićnih stanica.

Dakle, treba priznati da je pitanje plyuri- ili multipotency genoma mezenhimalnih matičnih stanica je još uvijek otvoren, što posljedično utječe na prikaz diferencijacije potencijala strome ishodišne stanice, što također nije u potpunosti instaliran.

Eksperimentalno dokazano i važna karakteristika mezenhimske matičnih stanica je njihova sposobnost da napusti niša tkiva i distribuirati u općoj cirkulaciji. Da bi se aktivirao genetski program diferencijacije, takve cirkulirajuće matične stanice trebaju pasti u odgovarajući mikro okoliš. Pokazano je da kada se primjenjuju sistemski krvotok MSC životinja primatelja nezrele stanice implantirane u različitim organima i tkivima, a zatim diferencira u krvne stanice, stanica mišića, adipocite, hondrociti i fibroblaste. Prema tome, u područjima lokalnog tkiva javlja signal-regulatorni interakciju počinio i neopredijeljeni strome ishodišnih stanica, kao i između njih i okolnih zrelih stanica. Pretpostavlja se da je indukcija diferencijacija provodi parakrina regulatorne čimbenike mezenhima i nemezenhimalnogo (faktori rasta, eikozanoida, izvanstanični molekula Matrix) koje daju prostornu i vremensku odnose u mikro okolini multipotentnog mezenhimalnim preteča. Dakle, lokalna oštećenja tkiva mezenhimalnog bi trebalo dovesti do stvaranja mikro okolinu zona multipotentnih mezenhimalne stanice preteče kvalitativno razlikuju od kompleksnih regulatornih signala netaknut tkiva u kojoj fiziološke procese javljaju umjesto reparativni regeneracije. Ova razlika je izuzetno važna u smislu specijalizacije staničnog fenotipa u normalnom i oštećenom mikrookruženju.

Prema idejama, ovdje su položeni mehanizmi temeljne razlike dvaju poznatih procesa - fiziološke regeneracije i upalne proliferacije. Prva od njih završava restauracijom specijaliziranog staničnog tkiva i njezine funkcije, a rezultat proliferacijskog procesa je stvaranje zrelih elemenata vezivnog tkiva i gubitak funkcije oštećenog područja tkiva. Dakle, za razvoj optimalnih programa za korištenje multipotentnih mezenhimalnih progenitorskih stanica u regenerativno-plastičnoj medicini potrebno je pažljivo proučiti karakteristike utjecaja faktora mikrookruženja na diferencijaciju MSC-a.

Ovisnost strukture odjeljka matičnih stanica na staničnim para i autokrinim regulatorima, čija je ekspresija modulirana vanjskim signalima, nitko ne sumnja. Među funkcijama regulatornih čimbenika najvažnije su kontrola asimetrične podjele MSC i ekspresija gena koji određuju stupnjeve komisije i broj podjela stanica. Vanjski signali, na kojima ovisi daljnji razvoj MSC-a, osiguravaju njihovo mikro okruženje. Kod nezrelih MSC razmnožiti dovoljno dugo vremena, a zadržava sposobnost da se diferenciraju u adipocite linija, miofibroblasta, hematogeni strome tkiva, stanica hrskavice i kosti. Nađeno je da ograničena populacija cirkulirajućih SB34-negativne elemente strome stanica iz krvotok se vraća koštane srži strome tkiva, pretvara se u liniju gdje CD34 pozitivnih hematopoetskih matičnih stanica. Ova zapažanja ukazuju da mezenhimalne stanice za recirkulaciju ishodišnih u krvi tkiva pruža podršku za ravnotežu matičnih stanica strome u raznim organima pomoću mobiliziranja zajednički bazen nezreo koštane srži stromalne stanice. Diferencijacija MSC u stanice s više mezenhimalnih fenotipova i njihovo sudjelovanje u popravak ili regeneraciju kosti, hrskavice, tetiva i masno tkivo in vivo pokazali adoptivni transfer modela u eksperimentalnih životinja. U skladu s drugim autorima, udaljeno migracija MSC žile je u kombinaciji s lokalnim ili premještanje korotkodistantnym multipotentnih mezenhimalnih stanica prekursora unutar tkiva na popravak hrskavice, regeneracije mišića, i drugih reakcija redukcije.

Lokalni rezerve matičnih temelji strome tkiva igraju izvor ulogu stanica u fiziološkim regeneracije tkiva procese i puniti udaljenih prometnih MSC što potrošnja strome matičnih tkiva resursa. Međutim, u potrebi za hitne mobilizaciju staničnog reparativni kapaciteta, kao što su multipla trauma, u reparativni postupku regeneracije sudjeluje MSC cijeli vlak, a periferija kroz krvotok regrutiraju mezenhimalne stanice preteče koštane srži.

Transplantacija mezenhimalnih matičnih stanica

Pratiti neke paralele između fiziološkim procesima regeneracije tkiva i formiranju vrijeme fetalnog razvoja. Embriogeneza ljudi i sisavaca, formiranje različitih tipova specijaliziranih stanica dobivenih iz ecto, mezo i endodermal klice slojeva bazenu, ali uz obavezno sudjelovanje mezenhimu. Odstranjena celularna mreža embrionalnog mezenhimalnog tkiva izvodi brojne regulatorne, metaboličke, skeletne i morfogenetske funkcije. Bookmark provizorne tijela provodi se tek nakon kondenzacije mezenhimu na štetu rasta kolonija klonogenih ishodišne stanice koje stvaraju primarni morfogenetski signala organogeneze. Stromalni derivati embrionalnog mesenchima stvaraju stanični okvir privremenih organa i čine osnovu za njihovu buduću opskrbu energijom uzgojem primarne krvi i limfnih žila. Drugim riječima, stromalni elementi mikrokružne jedinice fetalnih organa pojavljuju se prije stvaranja njihovih strukturno-funkcionalnih jedinica. Osim toga, aktivni migracija mezenhimalnih stanica tijekom organogeneze pruža prostorna orijentacija u razvoju organa zbog obilježavanja svoje granice volumena Ograničenje homeotic Hox-tepov. Na strome javlja kostur i montaže konstrukcijskih i funkcionalnih jedinica parenhima organa, koji često uključuje morfogenetskom i funkcionalno vrlo različite stanice. Prema tome, u embriogeneze mezenhimu su primarna funkcija, a provodi ga generira regulatornih signala za aktiviranje regionalnog širenja progenitor i diferencijaciju epitelnih stanica. Embrionalne mezenhimu stanice proizvode faktore rasta, kao što su na noge, HGF-b, CSF, za koje postoje receptori odgovaraju na parenhimske ishodišnih stanica. Zrele diferencirane tkiva odraslog organizma mreže strome stanica također generira signale za održavanje održivost i proliferaciju ishodišne stanice nemezenhimalnogo podrijetlo. Međutim, spektar strome regulatorni signali u postnatalne ontogeneza drugi (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, itd.) I ima za cilj pružiti fiziološku regeneraciju ili popravak oštećenih zona tkiva. Štoviše, spektralna svojstva stromalnih regulatornih čimbenika u svakoj vrsti tkiva, pa čak i unutar istog organa su različita. Konkretno, hematopoeze i-stanica na umnažanje i diferencijaciji hematopoetskih i imunokompetentnih stanica pojavljuje samo u određenim organima, u sklopu kojeg djeluje strome mikrookruženje koji će osigurati uvjete za sazrijevanje hematopoetskih i limfnih stanica. To je do regulatornih čimbenika mikrookoliša ovisi o sposobnosti hematopoetskih i limfne stanice za repopulate tijelo na proliferaciju i zrele u svojim mikrostrukturnih nišama.

Između komponenti ekstracelularnog matriksa, koje proizvode multipotentnih mezenhimalne stanice preteče, treba napomenuti fibronektin, laminin, kolagen i proteoglikane kao i CD44 (hijaluronan i osteopontin receptora) prima ima glavnu ulogu u organizaciji međustanične interakcije i formiranje ekstracelularnog matriksa u koštanoj srži i kosti , Dokazano je da mesenchvmal koštane srži, multipotentnih stanice stvaraju redshestvenniki strome mikroklima, pod uvjetom da je induktivna i regulatorne signale ne samo MSC, ali i hematopoetskih prekursora i nemezenhimalnye koštane srži matičnih stanica. Poznato je da su uključeni u hematopoezu MSC mjerena preko njihove sposobnosti da diferenciraju u stromalnim stanicama koje podupiru hematopoezu, naznačen time, da je aktivna MSK vođenje signala dobivenih izravno iz hematopoetskih matičnih stanica. Zato je kultura mreže strome ishodišne stanice je osnova za hranjenje svih klonova hematopoetskih stanica.

U zrelim organizma intenziteta hemodijalize i-stanica u stanju dinamičke ravnoteže s „rashoda” zrelih krvnih stanica i imunološkog sustava stanica na periferiji. Od stanice strome koštane srži i limfnim organima rijetko ažuriraju, značajne strome restrukturiranje strukture ne pojavljuje u njih. Donesite sustav dinamičke ravnoteže je moguće uz pomoć mehaničkih oštećenja bilo organi hemo ili limfopoezu, što dovodi do istog tipa uzastopnih promjena koje utječu ne samo i ne toliko hematopoetskih ili limfne stanice, kao strome strukture oštećen organ. U postupku regeneracije reparativnim primarno nastale strome okvir, koji tada repopulacije hematopoetskih ili imunih stanica. Ovaj dugo poznata činjenica čini posttraumatski regeneracije prikladan model za proučavanje strome mikroklima organa krvotvornih. Konkretno, za istraživanje reparativni regeneracije koštane srži se koristi mehanička pražnjenje medularni šupljine dugih kostiju - kiretaža, omogućujući brzo i učinkovito donijeti hematopoetskih tkiva iz stanja dinamičke ravnoteže. Pri proučavanju proces reparativnim regeneracije hematopoetskih i strome koštane srži komponente nakon mehaničke pražnjenja medularnog šupljine tibije zamoraca pronađeno da među pokazatelji regeneraciju hematopoetskih i stanica strome (broj hematopoetskih stanica, koncentracija i količina strome progenitorskih stanica), ne postoji izravna korelacija. Osim toga, utvrđeno je da je povećanje populacije strome ishodišne stanice se pojavljuje na raniji datum nakon kiretaže, i sami strome fibroblasti su fosfatazopolozhitelnymi, što je karakteristično za osteogenske tkiva. Također je utvrđeno da je kiretaža 3-5 dugih kostiju dovodi do rasta populacije stanica u koštanoj srži i ne rade na kosti još u slezeni, koji kod zamoraca je samo lymphopoietic tijelo.

Morfološke slika reparativnim procesi u koštanoj srži kyuretirovannyh tibial zamorci uglavnom odgovara podacima iz literature dobivene u pokusima na životinjama drugih vrsta, dinamika promjene koje se događaju nakon uklanjanja krvotvornog tkiva je isti za sve vrste i razlika odnosi se samo na vremenske parametre , Morfološki postupak za obnavljanje faza hematopoiezisa u medularnim šupljini se prazni u uzastopnim postupcima organizaciji krvni ugrušak gruba vlakna formiranja kosti, njegov resorpciju, od sinusoide i retikularno stvaranje stromi, koji se dalje repopulacije hematopoetskih elemenata. Broj hematopoetskih progenitorskih stanica koštane srži regeneracija tkiva postupka povećanja paralelno povećanje sadržaja hematopoetskih matičnih stanica.

Gerasimov Yu et al (2001), dok se promjene u broju stanica i hematopoetskih količinu strome staničnih prekursora u pojedinim fazama procesa regeneracije. Utvrđeno je da kvantitativna promjena u stanicama koštane srži u kosti kyuretirovannoy odgovara dinamici morfoloških karakteristika regeneracije. Smanjenje u prva tri dana sadržaja stanica na regeneraciju autori pripisuju gubitak hematopoetskih stanica, zbog štetnog djelovanja mikrookoliša, koji stvara retikulirani tkivo raste u preostalom koštane srži u epifize, a potonji se oblikuje žarište osteoida i oštećenja krvnih žila sa kiretaža. 7-12-og dana od podizanja yaderosoderzhaschih stanice se podudara s pojavom individualnog žarišta u mijeloidne krvotvornih strome stanica proliferacije zona. 20. Dana postoje značajne dijelove regenerira koštane srži i dobro razvijenih sinusa, što je popraćeno značajnim porastom ukupnog broja stanica. Međutim, broj hematopoetskih elemenata u ovom razdoblju iznosi 68% kontrolne razine. To je u skladu sa ranije objavljenim podacima koji pokazuju da je broj stanica krvotvornih nakon kiretaže dosegne standarde samo 35-40 dana nakon operacije.

U ranom posttraumatskom razdoblju glavni stanični izvor za obnovu hemopoeze jest stanični elementi sačuvanih u curettageu. Kasnije, glavni izvor regeneracije hematopoetskog tkiva koštane srži jesu matične stanice, repopulirajući slobodne stromalne zone. Što se tiče određenih kategorija stromalnih stanica (endotelni, retikularni i osteogeni), izvori koji daju formiranje tijekom rekonstrukcije medularne šupljine ostaju neobjašnjeni. Rezultati Yu.V. Gerasimova et al (2001), pokazuju da je u ostatku koštanoj srži nakon koncentriranja kiretaža stanica fibroblasta koloniziranja značajno više nego u normalnom koštane srži. Autori smatraju da s kiretaža intenzivnije selektivno eluacija hematopoetskih stanica u usporedbi sa stanicama strome koloniziranja koji su uključeni u formiranje strome i čvrsto spojeni sa osnovnom tvari od hematopoetskih stanica.

Dinamika promjene u broju stanica koje formiraju kolonije fibroblaste korelira s intenzitetom osteogenesis procesa zatim trabekularne resorpcija kosti i formiranje strome retikulirani koji popuniti hematopoetskih stanica. Većina strome prekurzorskih stanica u ovim uvjetima Regeneracija formira grubu-fibered koštanog tkiva i retikulirani stromu. Za frakture bedrene kosti u uvjetima produljene osteosinteze na 5. Dan u zoni regeneracije povećava koncentraciju stanica i broj koloniziranja fibroblasta, te na formiranje kostiju intenzivno njihov broj je povećana 6 puta. Poznato je da stanice koštane srži koje formiraju kolonije fibroblasta posjeduju osteogena svojstva. Broj stromalnih progenitor stanica povećava se prije kolonizacije područja koštane srži hematopoetskih stanica. Ovo je u dobrom suglasju s dokazima da stromalne stanice omogućuju formiranje hematopoetskog mikro okruženja. Očito, stvaranje hematopoetskog mikrookoliša odgovara određenoj razini regeneracije tkiva strome i povećava broj hematopoetskih stanica nakon ekspanzije strome mosni pogodan za hematopoezu.

Od najvećeg interesa su podaci autora koji neposredno nakon curetege povećavaju broj stromalnih progenitor stanica u udaljenim dijelovima kostura. Počevši od šestog sata, a dvadesetog dana, uključiv i kontralateralnoj tibije se promatra u više od dva puta povećanje koncentracije, a broj stanica koje formiraju kolonije fibroblaste. Mehanizam ovog fenomena vjerojatno povezan s činjenicom da masivna ozljeda koštane srži rezultira u formiranju velikog broja krvnih ugrušaka, a ugibaju značajan broj trombocita i otpuštanje u krvi faktora rasta iz trombocita-(RBSK), koji je poznat da uzrokuje proliferaciju stanica koje stvaraju kolonije fibroblasti koji se nalaze u tijelu izvan proliferativnog bazena. U pokusima na kunićima lokalna uprava MSC potiče obnovu kirurški oštećene hrskavice u koljenu, koji može biti povezan sa stvaranjem hondrocita izvedenih iz MSC uveo. Međutim, reparativna regeneracija koštanih defekata u laboratorijskim štakorima uvelike se poboljšava primjenom mezenhimalnih matičnih stanica okruženih keramičkim okvirom. Dakle, možemo pretpostaviti da ako ne RBOK, onda bilo koji drugi faktor, proizlazi iz oštećenih stanica strome, ima daleki stimulirajući učinak na proliferaciju mezenhimalnih nezrelih stanica u netaknutim područjima koštane srži i potiče njihovu migraciju u području tkiva kvar koštane srži. S druge strane, to protivno literature podacima iz prethodnih godina, što znači da stanice strome su odgovorni za mikro okoliš, za razliku od hematopoetskih stanica nisu u mogućnosti migrirati i dolaze iz lokalnih izvora.

Ipak, rezultati istraživanja Gerasimov Yu i sur (2001) ukazuju na to da primjena mehaničke traume uzrokuje ne samo oštar restrukturiranje strome tkiva u kyuretirovannoy kostima, ali i značajne promjene u stromi udaljenim kosti netaknute, što je, tu je sustavni odgovor stromalno tkivo za lokalnu traumu. A kada se primjenjuju višestrukom - višestruki kiretaža - ta reakcija je pojačan i promatrati ne samo u operiranog kosti i udaljene dijelove kostura, ali iu limfnim organima, posebno slezene. Mehanizam takvog sustavnog odgovora stromnog tkiva koštane srži i slezene lokalnoj traumi i polytraumi ostaje nepoznat. Pretpostavlja se da je taj proces je povezan s djelovanjem humoralnog faktor objavljenom mesenchvmal stroma medularni koštana šupljina srži. Mogućnost izrade stanice strome koštane srži i slezena organonespetsificheskogo humoralni faktor odgovoran za proliferaciju stanica, fibroblasta formiraju kolonije pokazuju podaci o njihovu aktivnost stimulacije kolonija u jednoslojnim kulturama koštane srži.

U tom smislu, to je napomenuti da kada se primjenjuju sistemski multipotentnih mezenhimalne stanice preteče repopulacije njihove derivate, ne samo koštane srži, ali i drugih tkiva, koja se koristi, naročito za gensku terapiju. Pokazano je da nakon intravenske primjene velikih količina MSC s genom divljeg tipa miševa s mutant kolagena gen I donora stanica zamijeniti do 30% stanica u kosti i hrskavice tkiva primatelja, a koje su transfektirane mezenhimalnih matičnih mišjih stanica koje luče IL-3 i čovjeka, 9 mjeseci efektivno podupire hematopoezu u slučaju njihove istodobne primjene s ljudskim hematopoetskih matičnih stanica u imunodeficijentne miševa.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]

Genetska modifikacija mezenhimalnih matičnih stanica

Dodatni eksperimentalni uspjeh genetske modifikacije treba istaknuti MSC transfekcije faktor IX gen ljudskog MSC slijedi prijenos stanica transfektanti imunodeficijentnih miševa, što dovodi do pojave u krvi Antihemophilic faktor B više od 8 tjedana nakon transplantacije. U ovom su eksperimentu provedene posttranslacijske modifikacije faktora IX s y-glutamil karboksilazom u transfektiranim stanicama. Transdukcija iz MSC s retrovirusni vektor kodira humani faktor IX, je manje uspješni - naknadno uvođenje ovih stanica s hemofilije psa u terapijske razine faktora IX, koji podržava normalne hemostaze koagulacijski intenzitet samo za 12 dana.

Transplantacija mezenhimalnih matičnih stanica u mozgu parenhima životinja pokazala je da su donorske nezrelene stanice transformirane i u populaciji neurona i glia. Primanje presatka neuronske derivati zdravi donor mezenhimalnih tkivo teoretski omogućuje korekciju genetskih abnormalnosti metabolizma mozga kod pacijenata s Gaucherovabolest i drugih poremećaja metabolizma lipida, ugljikohidrata ili gangliozida.

Nastavlja eksperimentalne uvjete traženja transdiferencijacija matičnih stanica koštane srži na stroma stanica prekursora u živčanom i jetrenog tkiva. Pozornost istraživača usmjerena je na kombinacije induktora diferencijacije i posebnih medija za kondicioniranje. Posebno, za izoliranje primarne kulture s 10% fetalnog telećeg seruma, stanice koštane srži strome isprane i resuspendirane u DMEM mediju / F12 za uzgoj (1/1) su nasađene u gustoći od 200,000 / cm2. Nakon 24 sata, stanice su uklonjene nonadherent i vezan plastične fibroblasti su kultivirane tjedan dana. Za diferencijaciju stanice strome koštane srži u neuroblasts koriste kondicionirani medij dobiven kultiviranjem trodnevni kulture primarnih fibroblastu embriona miša, kao i među DMEM / F12 (1/1), s 2% fetalnog goveđeg seruma i uz dodatak 20 ng / ml ili 10-6 M LIF retinoične kiseline (neyroinduktory koji se primjenjuju za neuralne diferencijaciju mišjih embrija matičnih stanica i čovjeka). Diferencijaciju koštane srži stromalnih stanica u prekurzorske stanice u hepatocitima je inducirana uvjetovanu okoline nastaje kao rezultat tri dana uzgajanja kulture primarnih stanica mišjeg embrija jetre u DMEM / F12 mediju (1/1) obogaćenom s 10% fetalnog telećeg seruma.

Ovdje se opet treba naglasiti da su stanice koštane srži koje stvaraju koloni heteromorfne i mogu se podijeliti u dvije vrste. Prvi tip uključuje stanice poput fibroblasta koje tvore filopodijske stanice s velikim jezgrama i jedan ili dva nukleola. Drugi tip predstavljaju male stanice oblika oblika vretena. U obje vrste stanične kulture u kondicioniranom mediju dobivenog na umetanje sloja primarne fibroblastu embriona miša, a na Z-4-og dana kulture stanica pojavljuju Slično neuroblasts. U ovoj fazi često imaju formu vretena s jednim ili dva dugotrajna procesa koji završavaju filopodijom. Stanice piramidalne ili zvjezdane stanice s kratkim dendritima manje su uobičajene. Dendrita jedan neuroblasts imaju tipičnu širenje (rast) i bubrega grananja u distalnom dijelu, a drugi - s jasnim konusa rasta filopodija, kroz koje se odvija rast dendrita. Slični morfološke osobine (stožaca rasta bubrega, andfilopodia a) svojstven neuroblastoma, diferenciraju u neuronima, su detaljno opisani u radovima po neurogeneze. Na temelju toga, neki autori zaključuju da su stanice koje otkrivaju u kulturi neuroblasti. Posebno Schegelskaya E. Et al (2002), nakon primarne kulture stanica strome kultiviranih dva tjedna u zamjenjiva na svakom Z-i-4 dana kondicioniranom mediju pronađeno da dio proliferacijom stanica, nediferencirani zadržavanje stanja. Izvana, takve su stanice izgledale kao fibroblasti i identificirani su u kulturi uz razlikovanje neuroblasta. Većina stanica (oko 80%) bila je u različitim fazama diferencijacije u stanice živčanog tkiva, uglavnom u neurone. Dendritičke procesi tih stanica u bliskom kontaktu jedni s drugima, tako da se postupno stanice formiraju na dijelove supstrata neuronske mreže u obliku dugih niti višestaničnih. Dendritički procesi neuroblasta rastu puno duže, od kojih su neki 8-10 puta veći od duljine tijela neurona. Postupno se povećava udio piramidalnih i zvjezdanih stanica. Dendriti stelatnih stanica razgranati. Prema autorima, kasnije diferencijacija piramidalnih i zvjezdastih stanica u usporedbi s vretenastih odgovara slijedu normalnih faza neurogeneza u životinja. Kao rezultat toga, autori zaključuju da matične stanice koštane srži stanica strome su izloženi inducirani neurogenezu u kojima postupak in vitro generira neuroblasts iz sve tri glavne vrste neurona. Prekursori neuronskih stanica su nađeni u kulturi stanice strome koštane srži za 3-4 dana u mediju s 2% fetalnog seruma i 20 ng / ml, LIF. No, u ovom slučaju matične stanice su bile jako podijeljene, diferencijacija neuroblasta dogodila se samo u 30% slučajeva i nisu formirale neuronske mreže. Koristeći kao diferencijacija živčanih stanica induciraju retinoičnom kiselinom, autori su dobiveni u kulturi na 25-30% živčanih stanica s prevlast glija stanica astrocita i oligodendrocita -. Neuroni su činili samo jednu trećinu svih živčanih stanica, iako su ih zastupale sva tri tipa: fusiformne, piramidalne i zvjezdane stanice. Na 6. Dan stanice strome uzgoja u retinoična kiselina srednjih živčanih stanica postala diferencirana, a pronađeni su pojedini aksoni od piramidalnih neurona koji u normalnom neuroontogenesis pojaviti kasnije formiranje dendritičke procesa. Prema autorima, usprkos niskom prinosu živčanih stanica, postupak induciranja retinska kiselina ima prednosti: astrocita i oligodendrocita i mijelinacijskih upravljati funkcijama hrane tijekom rasta aksona i dendrita i potrebni za tvorbu normalno živčanog tkiva. Dakle, da popravi svoje oštećenih mjesta in vivo neurona bolje iskoristiti suspenzije obogaćen u glija stanica.

U drugom nizu pokusa, autori pokušali inducirati diferencijaciju stanice strome koštane srži u stanicama jetre. Nakon tri dana kulture koštane srži strome matičnih stanica u prilagodeni medij dobiven inkubaciju mišjeg embrija hepatocitima, velike, sferni obliku stanice su pronađeni, često dva nuklearna, citoplazmatske inkluzije s različitim veličinama. Te stanice su na različitim stupnjevima diferencijacije, a razlikuju se u veličini, broj jezgri i citoplazmi inkluzije. U većini tih stanica je otkrivena glikogen, čime smo ih identificirali kao hepatocita stanica prekursora. Od kulture bez stanica nađene su Slično neuroblasts, nakon čega je zaključak da u kondicioniranom mediju dobivenog kultiviranjem embrionalnih hepatocitima, ne postoje faktori diferencijacije živčanih stanica i, s druge strane, postoje faktori koji induciraju diferencijaciju stanice strome koštane srži u prekurzorskih stanica hepatocitima , Autori ukazuju na prisutnost pluripotentne stanice iz strome koštane srži, jer oni razlikuju in vitro u stanicama jetre ili živčanog tkiva, ovisno o specifičnim uvjetovano medijima i prigušnice.

U nekim djelima, diferencijacija stroma stanica koštane srži u kardiomiokite, hrskavicu, kosti i stanice neuronskih tkiva uistinu je pravilno prikazana. Postoje informacije da među stanicama koštane srži postoje populacije matičnih stanica koje se mogu razlikovati u hepatocitima. U svjetlu ovih rezultata navedenih pokusa na miševima i dalje može smatrati kao još jedna potvrda prisutnosti u koštanoj srži pluripotentne mesenchvmal matičnih stanica koje imaju sposobnost diferencijacije u stanice različitih tkiva odraslog organizma.

Transplantacija mezenhimalnih matičnih stanica

U kliničkoj transplantacije ljudskih mezenhimske matičnih stanica može koristiti za proširenje hematopoetskih matičnih stanica i njihovih ranih potomci prekommitirovannyh. Posebno, uvođenje autolognih hematopoetskih matičnih stanica i bolesnika s karcinomom MSC nakon kemoterapije po visokoj ubrzava oporavak neutrofila i trombocita u perifernoj krvi. Autolognih i alogeneična transplantacija mezenhimalnih matičnih stanica se koriste u liječenju multiplog mijeloma, aplastična anemija, spontani trombocitopeniju - bolesti povezanih s primarnim defektom hematopoetska strome tkiva. Učinkovitost stanica terapija u hematološkim patologije u mnogim slučajevima navedenim, a uvođenje strome i hematopoetskih matičnih stanica, koje se očituje smanjenje postoperativnom razdoblja oporavka, krvi, smanjenje broja smrtnih slučajeva zbog neselektivnim uništavanja regionalne i cirkulirajućih tumorskih stanica u kojima je umrijeti i njegovi vlastiti ishodišne hematopoetskih pacijent stanice. MSC obećavaju programe i druge multipotentnih mezenhimalne stanice preteče u kliničkoj praksi zbog svoje relativno lake dobivanje aspirata koštane srži, širenje kulture i transfekcije terapijskog gena. Tako nadoknaditi nedostatke lokalne tkiva mogu koristiti lokalni implantacija multipotentnih mezenhimalnih stanica prekursora i na sustavne disfunkcije tkiva mezenhimalnog podrijetla nije isključeno njihovo unošenje u krvotok.

Oprezniji u svojim argumentima Autori radova u kojima su perspektive MSC za lokalnu, sistemsku transplantacije i genske terapije analizirani s aspekta biologije stanice strome. Postnatalna koštana srž tradicionalno se smatra organom koji se sastoji od dva glavna sustava jasno izraženih staničnih linija - stvarnog hematopoetskog tkiva i pridružene strome potpore. Dakle, koštane srži mesenchvmal matične stanice podrijetlom smatrati samo kao izvor strome osnova za proizvodnju regulacijskih faktora hematopoetskih okoline. Zatim je pozornost istraživača prešla na proučavanje uloge MSC-a kao izvora kostiju koštanog tkiva. Najnoviji podaci ukazuju na neočekivan potencijal diferencijacije stromalnih stanica koštane srži formiranjem neuralnog ili mišićnog tkiva. Drugim riječima, mesenchvmal matične stanice pokazuju transgermalnuyu plastičnost - sposobnost da se diferenciraju u staničnim tipovima koji fenotipski ne-originalni tkivo. Međutim, neki aspekti biologije stanice strome koštane srži ostaju nejasni i neriješeno u općem biološkom planu, te u nekim detaljima, uključujući i identifikaciju, prirode, nastanka i razvoja i funkcije in vivo koštane strome srži stanicama, kao i dopuštenu potencijalni diferencijacije ex vivo i mogućnost terapijsku upotrebu in vivo. Podaci o potencijalnim mogućnostima MSC, kao i rezultati istraživanja drugih regenerativnim potencijala matičnih stanica, u oštrom kontrastu s utvrđenim dogmama u biologiji.

Kada se uzgajaju u uvjetima niske gustoće, stromalne stanice stabla koštane srži formiraju različite kolonije, od kojih je svaki derivat jednog stanice prekursora. Postotak strome stanica prekursora u stanicama koštane srži jezgrom definira njihovu sposobnost da se formira kolonije u velikoj mjeri ovisi o uvjetima kulture i vrste na MSC pripadaju. Na primjer, u glodavaca da se dobije maksimalnu količinu strome prekurzorskih stanica je nužno u prisutnosti ozračenog umetanje kulture stanica koštane srži i seruma, a koloniziranja učinkovitost humanih mezenhimalnih matičnih stanica neovisan od izvoda ili iz medija za kulturu. Broj poznatih mitogenih čimbenika koji stimuliraju proliferaciju stromalnih progenitorskih stanica je ograničen. To uključuje PDGF, EGF, FGF, TGF-b, kao i IGF1. Pod optimalnim uvjetima kultiviranja MSC poliklonska linije održava in vitro za više od 50 dioba stanice, što omogućuje primanje milijarde stanica strome koštane srži od 1 ml aspirata it.

Međutim, populacija stanica strome koštane srži je heterogena, koja se manifestira kao varijabilnosti u veličinama od kolonija, različitih brzina njihovo oblikovanje i razne stanične morfologije, koja obuhvaća niz fibroblasta poput vretena za veće ravne stanice. Uz razvoj takvih usjeva nakon 20 dana, zabilježena je i fenotipska heterogenost. Dio kolonije odlikuje se visokom ekspresijom alkalne fosfataze, drugi ne izražavaju, a kolonije Treća vrsta su fosfatazopozitivnymi u središnjem dijelu i fosfatazonegativnymi na periferiji. Odvojene kolonije stvaraju čvoriće koštanog tkiva (početak matrične mineralizacije označava se kada je bojila alizarin crvenom ili na kalcij Van-Koss). U ostalim kolonijama dolazi do nakupljanja masnoća, identificiranog s G-obojenjem crvenom uljem. Češće kolonije mezenhimalnih matičnih stanica tvore hrskavice koje su obojene alcyan blue).

Nakon transplantacije ektopične u eksperimentalnih životinja poliklonska MGK linije oblikuju ectopic kosti stromi s setchatoobraznoy povezan s mijelopoezu i adipocite, kao i, ali rijetko s tkiva hrskavice. U monoklonskim linije transplantacije koštane srži stanica strome, u nekim slučajevima postoji himerizam, naznačen time da je de novo koštano tkivo formira se sastoji od koštanih stanica, adipocitima sadrži strome i donatora porijekla, dok se linija stanica hematopoetskih i vaskularni sustav izveden od primatelja.

Rezultati tih studija potvrđuju stabljinu prirode stromalnog prekursora koštane srži, od kojih je dobivena klonalna linija. Istodobno istodobno pokazuju da nisu svi klonirani u kulturnim stanicama doista multipotentne matične stanice. Neki istraživači vjeruju, i mi dijelimo svoje mišljenje, da je najtočnije informacije o stvarnom potencijalu diferencijacije pojedinih klonova može se dobiti samo in vivo nakon transplantacije, nego određivanjem fenotipa njihovih derivata u uvjetima in vitro. Ekspresija u osteo- kulture fenotipskih markera hondro- ili stvaranja masnog tkiva (određena putem mRNA ili histokemijskim tehnikama), pa čak i proizvodnja mineraliziranog matriksa ne odražava stupanj pluripotency jednog klona in vivo. Stoga je identificiranje matičnih stanica u stromalnoj skupini moguće samo posteriori, pod odgovarajućim uvjetima biološkog presađivanja. Posebno, hondrogenezu rijetko promatrana u transplantacije otvorenim sustavima, dok se tvorba hrskavice Nije neuobičajeno u zatvorenom sustavu, kao što je difuziju komore, ili u mikromassnyh kulturama stromalnih stanica in vitro, pri čemu je postignuta lokalno niskog tlaka kisika, pridonose formiranju hrskavice. Stoga čak i tehnika transplantacije, kao i nespecifični uvjeti kultiviranja in vitro, značajno utječu na raspon MSC diferencijacije.

Eksperimentalna transplantacija uz poštivanje danih eksperimentalnih uvjeta je zlatni standard za određivanje potencijala za diferencijaciju stromalnih stanica koštane srži i ključni element njihove ispravne identifikacije. Povijesno gledano, studije transplantacije koštane srži stromalne koštane srži povezane su s zajedničkim problemom presađivanja koštane srži. Utvrđeno je da hemopoetski mikrookoliš nastaje transplantacijom stromalnih stanica koštane srži i osigurava ektopski razvoj hemopoetskog tkiva u zoni presađivanja. Podrijetlo mikrookoliša od donora i hematopoetskog tkiva - od domaćina nam omogućuje liječenje ektopičke kosti kao pravi "obrnuti" transplantaciju koštane srži. Lokalna transplantacija stromalnih stanica koštane srži promiče učinkovitu korekciju oštećenja kostiju, izraženiji nego kod spontane reparativne regeneracije. U nekoliko pretkliničkim ispitivanjima na životinjskim modelima uvjerljivo dokazao mogućnost transplantacije stanica strome koštane srži u ortopediji, iako bi optimizirali ove metode, čak iu najjednostavnijim slučajevima, potrebna je većina pažljiv rad i analizu. Konkretno, još nisu uspostavljeni optimalni uvjeti za širenje osteogenih stromalnih stanica ex vivo, struktura i sastav idealnog nosača ostaju neiskorišteni, kao i broj stanica potrebnih za skupnu regeneraciju kostiju.

Osim primjene ex vivo propagira koštane srži stromalnih stanica za regeneraciju tkiva mezenhimalnog porijekla neobičan kovanja MSC otvara potencijalnu uporabu za regeneraciju živčanih stanica, ili isporuku genskih produkata u CNS. U načelu, to olakšava staničnu terapiju za živčanog oštećenja sustava, jer nema potrebe za autolognih ljudskim matičnim stanicama neuralne. Izvijestio o mogućnosti korištenja stanica koštane srži za proizvodnju kardiomiocitima i miogenih predaka kao istinski strome tako vnestromalnogo podrijetla.

U tijeku su eksperimenti na sistemskoj transplantaciji stromalnih stanica koštane srži za liječenje zajedničkih bolesti kostiju. Bez sumnje, strome koštane srži stanice su nanesene odgovorni za genetske bolesti u bolesti skeleta, koji je dobro ilustrirana prijenos vektora pomoću genetske informacije stanica, što dovodi do formiranja patološkog koštanog tkiva u eksperimentalnih životinja. Međutim, još nije dokazana sposobnost stromalnih stanica da implantiraju, rastu, razmnožavaju i diferenciraju u kostima kostura nakon uvođenja u opću struju krvi.

To je djelomično zbog činjenice da je standardni postupak strome koštane srži ne transplantiraju krvotvornog tkiva, tako stroge kriterije za vrednovanje uspješno usađivanje sistemskim davanjem stanice strome tek treba razviti. Treba imati na umu da je prisutnost marker-genima u ekstraktima tkiva ili otpuštanje u kulturi stanica donora-derived svjedoči ne usađenosti stanica, ali samo njihov opstanak. Čak i unutar arterijska injekcija koštane srži stanica strome u miša ud može dovesti do gotovo nula usadenosti rezultata, unatoč činjenici da su stanice donora izvedeni naći u velikom broju unutar mreže krvnih žila po koštane srži. Nažalost, takve se stanice obično opisuju kao "zahvaćene" samo na temelju rezultata određivanja gena darivatelja markera u uvjetima ex vivo kulture. Osim toga, potrebno je osigurati uvjerljive dokaze dugoročne integracije u tkivima diferenciranih i funkcionalno aktivnih stanica donorskog podrijetla. U mnogim objavljenim radovima, gdje se bilježi o presađivanju stromalnih stanica koštane srži u kostur, nedostaje jasni podaci ove vrste. Ipak, valja napomenuti da je u nekim ispravnim pokusima na životinjama, međutim, ograničeno, ali stvarno uključivanje stromalnih progenitorskih stanica nakon njihove sistemske primjene.

Ti su podaci u skladu s rezultatima studije o mogućnosti isporuke miogenih stanica prekurzora koštane srži na mišiće kroz vaskularni sustav. Međutim, ne treba zaboraviti da se oba skeletna i mišićna tkiva formiraju tijekom razvoja i rasta na temelju ekstravaskularnih pokreta stanica koji koriste migracijske procese koji ne uključuju cirkulaciju u krvi. Ako doista postoji neovisni krvožilni put za isporuku prekursorskih stanica tkiva čvrste faze, može li se dopustiti postojanje fiziološki cirkulirajućih mezenhimalnih progenitorskih stanica? Kakvo je podrijetlo tih stanica u razvoju i postnatalnom organizmu, i kako oni prodiru u krvožilni zid? Rješenje ovih pitanja je apsolutno neophodno i zahtijeva najtočniju pretkliničku analizu. Čak i nakon što se pronađu odgovori na ta pitanja, problematični kinetički aspekti povezani s rastom koštane strukture i preoblikovanjem vezivnog tkiva ostaju neriješeni. Istodobno, čini se da liječenje poremećaja osteogeneze zamjenjujući čitavu populaciju mutiranih skeletnih progenitorskih stanica sa zdravih stromalnih stanica predstavlja pravu kliničku perspektivu. U ovom slučaju lokalne zone fraktura ili deformacije zbog patološke osteogeneze, kao i destruktivne promjene koštanog tkiva, mogu se korigirati kultiviranim in vitro stromalnim matičnim stanicama. Stoga bi smjer budućih istraživanja trebao biti usmjeren na probleme transformacije ili genetske ispravke autolognih mutiranih osteogenih progenitorskih stanica ex vivo.

Genetski inženjering stanica, privremeno ili trajno, postao temelj stanične i molekularne biologije, izvor mnogih znanstvenih spoznaja koje se odnose na ulogu pojedinih proteina u stanični metabolizam in vitro tvari i in vivo. Upotreba molekularnih tehnika ispraviti nasljedne bolesti i ljudskih bolesti je vrlo obećavajuće za praktičnu medicinu, jer su svojstva strome koštane srži matičnih stanica dopušteno da se razvije jedinstveni krugova transplantacija za ispravljanje genetskih bolesti skeleta. U tom slučaju, mezenhimalne ishodišne stanice mogu se dobiti vrlo lako iz budućeg primatelja, oni su podvrgnuti genetskom manipulacijom i moći uzgajati u velikom broju u kratkom vremenskom razdoblju. Upotreba mezenhimalnih matičnih stanica izbjegava ograničenja i rizika povezanih s dostavom genetičke informacije materijala izravno u pacijenta kroz vrtrusnye vektor konstrukata. Ova strategija je primjenjiv na pl embrionalnih matičnih stanica, a postnatalne autologne stanice strome koštane srži - poželjan materijal, jer njihovo unošenje isključuje moguće imunološke posttransplantation komplikacije. Kako bi se postigla kratkoročni učinak, na primjer, kako bi se ubrzao regeneraciju kosti, optimalna metoda je genetska modifikacija mezenhimalnih matičnih stanica pomoću kemijski elektroporatsrsh, fuzija, lipofekcija, plazmida i adenovirusnim konstruktima. Osobito virusne transfekcije u stanicama strome koštane srži BMP-2, bilo je učinkovito u ubrzavanju regeneraciju kosti u eksperimentalnom višestrukom. Izrada adenovirusnih vektorskih struktura je poželjna zbog nedostatka toksičnosti. Međutim, genetska modifikacija stromalnih stanica koštane srži u ovom slučaju karakterizira izuzetno niska stabilnost. Nadalje, normalne transformirane stanice strome koštane srži, zahtijevaju upotrebu vektora nosača genetskog podataka 10 puta više od infektivnog drugim tipovima stanica, što znatno povećava postotak smrti transfektiranih stanica.

Za liječenje bolesti uzrokovanih recesivne niske ili nula biološke aktivnosti određenih gena potrebno dugotrajno ili trajno mijenjanje mezenhimalnih matičnih stanica, što zahtijeva korištenje adeno-povezani virusi, retrovirusi, i adeno-lentivirusa retrovirusni himerni protein. Prijevozna mjesta ovih virusa mogu nositi velike DNA transfekte (do 8 kb). Znanstvena literatura je već došlo do informacija o biološkom aktivnošću egzogenih koštane srži stromalnim stanicama transfektiranim s Retrovirusni konstrukti kodiraju sintezu regulatornih molekula i markera - IL-3, CD2, faktor VIII, i enzimi koji su uključeni u sintezu L-DOPA. No, u ovim radovima autori ističu niz ograničenja koja se moraju prevladati prije početka praktične primjene ove tehnologije. Prvi je problem optimizirati MCK ex vivo modifikaciju procesa. Poznato je da produljena (3-4 tjedna) proliferacija stromalnih stanica koštane srži in vitro smanjuje njihovu transfekciju. Istodobno, potrebno je nekoliko ciklusa transfuzije kako bi se postigla visoka razina genetske modifikacije MSC-a. Drugi problem vezan je uz trajanje ekspresije terapeutskog gena koji još ne prelazi četiri mjeseca. Prirodno smanjenje efektivne ekspresije gena posljedica je inaktivacije promotora i smrti modificiranih stanica. U općem prijenos izgledima genetskih informacija pomoću mezenhimalne matičnih stanica rezultati preliminarnih istraživanja ukazuju na potrebu daljnje optimizacije metode transfekcije ex vivo, odabiru adekvatne promotor regulira biološke aktivnosti u pravom smjeru, i poboljšati sposobnost modificiranog koštane strome srži stanicama kako bi se obnovile in vivo nakon transplantacije. Treba napomenuti da je uporaba retrovirusnih konstrukata za modificiranje koštane srži stanica strome u željenom smjeru ne uvijek zahtijevaju njihovo obvezno usađivanje. Transfektirane mezenhimalnih matičnih stanica može izvesti korektivne funkciju na pozadini stabilna i boravka bez potrebe ugradnje aktivne fizičke i djelovanje u vezivno tkivo. U tom slučaju treba ih smatrati biološkom mini-pumpom koja proizvodi in vivo čimbenik, čiji manjak određuje manifestaciju genetske patologije.

Upotreba transformiranih strome srži stanica koštane za liječenje dominantne genetske bolesti koje karakterizira ekspresija gena ili abnormalnom patološke biološke aktivnosti, mnogo je problematično jer se u tom slučaju potrebno je blokirati prijenos ili prodaju genetičke informacije iskrivljene. Jedna od metoda genetičkog inženjeringa - homologna rekombinacija embrionalnih matičnih stanica za stvaranje transgenih životinja. Međutim, vrlo niska razina homologne rekombinantne, u kombinaciji s problemima identifikacije, razdvajanje i širenje takvih rekombinanta je vjerojatno da će promovirati široku primjenu ove tehnike u bliskoj budućnosti, čak i ako se razvoj novih tehnoloških metoda. Drugi pristup genskoj terapiji je zasnovan na dominantnom patologije automatsku korekciju oštećene DNA kao genetske mutacije mogu ispraviti uvođenje egzogene DNA sa željenom redoslijedu (kratke DNA oligonukleotidi ili himernih RNA / DNA oligonukleotidi) koji se vežu na homologa u oštećenom genoma. Treća izvedba daje patološko brava prijenos informacije koja se postiže upotrebom posebno dizajniranih oligonukleotida koji se vežu za određeni gen da formiraju spiralno ternarnom strukturu, koja se isključuje mogućnost transkripcije.

Iako je korekcija genetskih bolesti u razini genoma je optimalno i poželjan terapijski postupak, mRNA je također obećavajuća vektor (možda još dostupne) za blokiranje dominantno negativnog gen. Za inhibiciju prevođenja i / ili povećanje degradaciju mRNA dugo su se s proteinskih molekula antisense oligonukleotid slijeda ili pun blokiranje vezanja mRNA biosintezu uređaja stanice. Osim toga, dvolančana RNA izaziva brzu degradaciju mRNA, čiji mehanizam ostaje nejasan. Međutim, malo je vjerojatno da sama uklanjanje mRNA prepisane iz nekog mutanta alela s kratkim ili pojedinačne mutacije će promovirati mRNA ekspresije u normalnim alela. Alternativa je korištenje ribozinov čekića i ukosnica, imaju sposobnost da se vežu na visoko specifična mjesta mRNA s naknadnim indukciju ili cijepanje i inaktivacije tijekom prevođenja. Trenutno se proučava mogućnost korištenja ove metode u liječenju patološke osteogeneze. Bez obzira na to što je točno meta - genomske ili citoplazmatske elemenata Uspjeh nove genske terapije tehnologije bit će određena efikasnost uključivanjem reagensa u koštane strome srži stanice ex vivo, optimalan odabir pojedinog vektora i stabilnog sposobnost mezenhimalnih matičnih stanica koje eksprimiraju željene faktora in vivo.

Stoga, otkriće mezenhimalnih matičnih stanica sa svojim neočekivanim svojstvima stvara novu konceptualnu shemu za razvoj staničnih linija. No, za razumijevanje biološke uloge strome matičnih stanica, od svoje prirode, sposobnost da transdiferencijacija ili dediferencijacije, njihov fiziološki značaj u procesu embrionalnom razvoju, postnatalne rasta, sazrijevanja i starenja, kao i ljudskih bolesti zahtijevaju dodatno interdisciplinarnih istraživanja.