Imunofenotipizacija hemoblastoza

Značajan napredak u hematološkim istraživanjima posljednjih godina povezan je s korištenjem modernih imunoloških metoda i automatiziranih sredstava za analizu i sortiranje stanica periferne krvi i koštane srži - protočnih citometara. Tradicionalne morfološke i citokemijske studije stanica supstrata bolesti (krv, crvena koštana srž, limfni čvorovi, slezena itd.) u mnogim slučajevima, posebno kod limfoproliferativnih bolesti, ne dopuštaju nam da identificiramo svu raznolikost varijanti među morfološki sličnim oblicima i utvrdimo izvor podrijetla patološkog klona. Ove probleme možemo riješiti samo proučavanjem imunoloških karakteristika stanica. Svaka faza diferencijacije hematopoetskih stanica odgovara vlastitom skupu antigena, koji se prema međunarodnoj klasifikaciji nazivaju diferencijacija i podijeljeni su u diferencijacijske klastere, označene CD.

Kod neoplastičnih promjena, blok diferencijacije može se pojaviti u bilo kojoj fazi normalnog razvoja stanica, što rezultira stvaranjem klona patoloških stanica koje određuju supstrat bolesti i imaju iste imunološke (ili fenotipske) karakteristike. Provođenjem studija ovih markera na stanicama moguće je utvrditi kojem obliku i varijanti bolesti odgovaraju, odnosno na temelju imunološkog fenotipa stanica provesti diferencijalnu dijagnostiku, što je najteže kod limfoproliferativnih bolesti, jer su glavna stanica patološkog supstrata bolesti morfološki gotovo identične stanice.

Fenotipizacija omogućuje korištenje monoklonskih antitijela za tipizaciju blastnih i zrelih krvnih stanica mijelo-, mono- i limfocitne serije prisutnošću diferencijacijskih antigena (receptora) u staničnoj stijenci. Odjeljak "Procjena imunološkog statusa tijela" djelomično opisuje karakteristike i dijagnostičku vrijednost proučavanja staničnih markera; u nastavku je kratak opis antigenskih markera stanica u odnosu na dijagnozu hemoblastoza. Sljedeći antigeni (markeri) mogu se otkriti na membranama krvnih stanica i crvene koštane srži.

• CD2 je monomerni transmembranski glikoprotein. Prisutan je na površini svih T-limfocita koji cirkuliraju u krvi i na nekim NK-limfocitima. CD2 je uključen u proces alternativne aktivacije T-limfocita. Detekcija CD2 pomoću monoklonskih antitijela u kliničkoj praksi koristi se za fenotipizaciju akutne T-stanične leukemije, limfoma, kroničnih upalnih i imunodeficijentnih stanja.
• CD3 je proteinski kompleks povezan s antigen-specifičnim T-staničnim receptorom, glavni je funkcionalni marker T-limfocita. Olakšava prijenos aktivacijskog signala s membrane u citoplazmu stanice. Određivanje CD3 indicirano je za dijagnozu akutne T-stanične leukemije, limfoma (CD3 se ne eksprimira u limfoidnim neoplazmama koje nisu T-stanice) i bolesti imunodeficijencije.
• CD4 je transmembranski glikoprotein koji eksprimira subpopulacija T-pomagačkih stanica (induktora), koje čine 45% limfocita periferne krvi. U ranim fazama razvoja limfocita u timusu, CD4 antigene, kao i CD8, eksprimiraju svi kortikalni limfociti. Medularni timociti, čiji je fenotip sličan zrelim CD4+ T-stanicama periferne krvi (T-pomagačkim stanicama), već eksprimiraju ili CD4 ili CD8 receptore. U perifernoj krvi do 5% stanica nosi i CD4 i CD8 markere. Manja ekspresija CD4 moguća je na nekim stanicama monocitne serije. CD4 se eksprimira u većini slučajeva T-staničnih limfoma, uključujući mycosis fungoides, kao i kod HTLV-povezane T-stanične leukemije (HTLV - humani T-limfotropni virus).
• CD5 je jednolančani glikoprotein prisutan na svim zrelim T limfocitima i većini timocita, a slabo ga eksprimiraju B limfociti. CD5 se detektira na neoplastičnim stanicama kronične limfocitne leukemije B-stanica i centrocitnog limfoma. Kod drugih vrsta malignih limfoidnih bolesti - folikularnog limfoma, leukemije dlakavih stanica, limfoma velikih stanica - CD5 se ne eksprimira.
• CD7 je jednolančani protein, najraniji marker diferencijacije T-stanica. Pro-T-limfociti ga eksprimiraju čak i prije njihove migracije u timus. CD7 se detektira na većini NK stanica, slaba ekspresija se uočava na monocitima. B-limfociti i granulociti ne sadrže ovaj antigen. Određivanje CD7 koristi se za dijagnosticiranje limfoma, dječje T-stanične limfoblastne leukemije.
• CD8 je protein koji se sastoji od dva polipeptidna lanca povezana disulfidnim mostovima. Ekspresira ga subpopulacija citotoksičnih i supresorskih T limfocita, koji čine 20-35% limfocita periferne krvi. Ovaj antigen također ekspresiraju NK limfociti, kortikalni timociti, 30% medularnih timocita i subpopulacija stanica crvene koštane srži. CD8 se proučava kako bi se kvantificirao sadržaj T supresora (vidi odjeljak „Supresorski T limfociti u krvi“ gore).

• CD10 je endopeptidaza povezana sa staničnom membranom. CD10 eksprimiraju mladi oblici B limfocita i subpopulacija kortikalnih limfocita. CD10 eksprimiraju sve ALL stanice.
• CD11c se eksprimira na staničnoj membrani makrofagima, monocitima, granulocitima, NK stanicama i stanicama leukemije dlakavih stanica.
• CD13 je glikoprotein koji eksprimiraju stanice mijelomonocitne loze (progenitorske stanice, neutrofili, bazofili, eozinofili, monociti i stanice mijeloične leukemije). Odsutan je u T i B limfocitima, eritrocitima i trombocitima.
• CD14 je površinski membranski glikoprotein. Uglavnom ga eksprimiraju monociti i makrofagi. CD14 se detektira na više od 95% monocita u perifernoj krvi i koštanoj srži. Snažna ekspresija CD14 uočena je kod akutne mijeloblastične leukemije. Ovaj antigen se ne eksprimira kod akutne i kronične limfoblastne leukemije.
• CD15 je oligosaharid. Sudjeluje u fagocitozi i kemotaksiji. Ovaj antigen prisutan je na površini zrelih granulocita i Berezovsky-Sternbergovih stanica. Ekspresija antigena CD15 detektirana je kod Hodgkinove bolesti. Kod ne-Hodgkinovih limfoma, CD15 se u većini slučajeva ne detektira.
• CD16 se eksprimira na površini granulocita, monocita, makrofaga i NK stanica. Svi limfociti koji eksprimiraju ovaj antigen imaju sposobnost stanične citotoksičnosti ovisne o antitijelima. CD16 se određuje tijekom tipizacije kroničnih mijelocitnih leukemija, kako bi se karakterizirale NK stanice.
• CD19 je glikoprotein prisutan na svim perifernim B limfocitima i svim prekursorima B-stanica. Odsutan je iz plazma stanica. To je najraniji marker B-stanica i igra važnu ulogu u regulaciji aktivacije i proliferacije B-stanica. CD19 se eksprimira na svim neoplastičnim stanicama akutne leukemije B-staničnog podrijetla, a prisutan je i u nekim oblicima akutne monoblastične leukemije.
• CD20 je neglikozilirani protein. U ontogenezi B-limfocita, antigen CD20 pojavljuje se nakon CD19 u fazi pre-B-stanične diferencijacije limfocita. Odsutan je iz plazma membrane plazma stanica. Eksprimiran je u ALL-u, kroničnoj limfocitnoj leukemiji B-stanica, leukemiji dlakavih stanica, Burkittovom limfomu i vrlo rijetko u akutnoj monoblastičnoj leukemiji.
• CD21 je glikoprotein prisutan u značajnim količinama na B-limfocitima u limfoidnim organima i u malim količinama na B-stanicama u perifernoj krvi. CD21 je receptor za Epstein-Barr virus.
• CD22 je protein koji se sastoji od dva polipeptidna lanca. Eksprimira se na membrani većine B limfocita, uključujući prekursorske stanice (prolimfocite). Antigen se ne eksprimira na B limfocitima (plazma stanicama) nakon njihove aktivacije. Najizraženija ekspresija CD22 detektirana je na stanicama dlakavoćelijske leukemije, slaba - kod mijeloične leukemije i ne-T-ćelijske ALL.
• CD23 je glikoprotein koji u mnogo većoj mjeri eksprimiraju aktivirani B limfociti periferne krvi. CD23 posreduje IgE-ovisnu citotoksičnost i fagocitozu makrofaga i eozinofila.
• CD25 je jednolančani glikoprotein identificiran kao receptor niskog afiniteta za IL-2. Ovaj receptor se eksprimira na aktiviranim T limfocitima i, u manjoj gustoći, na aktiviranim B stanicama. U perifernoj krvi zdravih osoba, antigen je prisutan na više od 5% limfoidnih stanica.
• CD29 je fibronektinski receptor. Široko je rasprostranjen u tkivima i eksprimiraju ga leukociti. Detekcija CD29 na perifernim krvnim stanicama koristi se za tipizaciju subpopulacije T stanica s fenotipom CD4+CD29+, koje se nazivaju pomoćne stanice tipa 2 (Th2). Ove stanice sudjeluju u humoralnom imunološkom odgovoru proizvodnjom limfokina.
• CD33 je transmembranski glikoprotein. Prisutan je na površini stanica mijeloidne i monocitne serije. Nalazi se na površini monocita i, u manjoj mjeri, granulocita u perifernoj krvi. Otprilike 30% stanica crvene koštane srži eksprimira CD33, uključujući mijeloblaste, promijelocite i mijelocite. Antigen je odsutan iz membrana pluripotentnih matičnih stanica. Određivanje CD33 koristi se za karakterizaciju stanica u leukemijama mijeloičnog podrijetla. Stanice leukemije limfoidnog i eritroidnog podrijetla ne eksprimiraju CD33.
• CD34 je fosfoglikoprotein koji eksprimiraju hematopoetske progenitorske stanice, uključujući monopotentne matične stanice. Najizraženija ekspresija Ag opažena je u ranim progenitorskim stanicama; kako stanice sazrijevaju, ekspresija markera se smanjuje. CD34 se također nalazi na endotelnim stanicama. Određivanje CD34 koristi se za karakterizaciju stanica u akutnim mijeloblastičnim i limfoblastičnim leukemijama. U kroničnim limfocitnim leukemijama i limfomima, ekspresija CD34 antigena nije detektirana.

• CD41a eksprimiraju trombociti i megakariociti. Monoklonska antitijela za detekciju CD41a koriste se za dijagnosticiranje megakarioblastične leukemije. Kod Glanzmannove trombastenije, ekspresija ovog antigena je odsutna ili značajno suprimirana.
• CD42b je membranski glikoprotein koji se sastoji od dva polipeptidna lanca. Marker se detektira na površini trombocita i megakariocita. U kliničkoj praksi, detekcija CD42b koristi se za dijagnosticiranje trombocitopatije - Bernard-Soulierovog sindroma.
• CD45RA pripada klasi transmembranskih glikoproteina. To je uobičajeni leukocitni antigen. Eksprimira se na staničnoj membrani B limfocita, u manjoj mjeri T limfocita i na zrelim medularnim timocitima. Granulociti ne eksprimiraju marker.
• CD45RO je niskomolekularni izoform CD45RA, uobičajenog leukocitnog antigena. Detektira se na T stanicama (memorijski T limfociti), subpopulaciji B limfocita, monocitima i makrofagima. Monoklonska antitijela na CD45RO interagiraju s većinom timocita, subpopulacijom mirujućih CD4+ i CD8+ T limfocita te zrelim aktiviranim T stanicama. Stanice mijelomonocitnog podrijetla, granulociti i monociti također nose ovaj antigen. Detektira se u centroblastičnim i imunoblastičnim limfomima.
• CD46 je O-glikozilirani dimer. Široko je rasprostranjen u tkivima i eksprimiraju ga T i B limfociti, monociti, granulociti, NK stanice, trombociti, endotelne stanice, fibroblasti, ali ga nema na površini crvenih krvnih stanica. CD46 pruža zaštitu tkiva od komplementa.
• CD61 je trombocitni antigen. Ekspresira se na trombocitima periferne krvi i crvene koštane srži, kao i na megakariocitima i megakarioblastima. Njegovo određivanje koristi se kao marker u akutnoj megakarioblastičnoj leukemiji. Ekspresija antigena je odsutna ili je potisnuta u bolesnika s Glanzmannovom trombastenijom.
• CD95, također nazvan Fas ili APO-1, je transmembranski glikoprotein, član obitelji receptora faktora tumorske nekroze. Ekspresira se u značajnim količinama na T limfocitima (CD4+ i CD8+) u perifernoj krvi i, u manjoj mjeri, na B limfocitima i NK stanicama. Ovaj antigen se također ekspresira na granulocitima, monocitima, stanicama tkiva i neoplastičnim stanicama. Vezanje CD95 na Fas ligand (CD95L) inducira apoptozu u stanicama.
• CD95L, ili Fas ligand, je membranski protein koji pripada obitelji receptora faktora tumorske nekroze. Ovaj antigen eksprimiraju citotoksični T limfociti, NK stanice i vrlo često tumorske stanice; glavni je induktor apoptoze u stanicama.
• HLA-DR je monomorfna determinanta molekula klase II ljudskog glavnog kompleksa histokompatibilnosti (HLA). Marker se eksprimira na Langerhansovim stanicama, dendritičnim stanicama limfoidnih organa, određenim vrstama makrofaga, B limfocitima, aktiviranim T stanicama i stanicama timskog epitela. Proučavanje ovog markera koristi se za kvantitativno određivanje aktiviranih T limfocita s CD3+ HLA-DR+ fenotipom.

Korištenjem različitog odabira monoklonskih antitijela na markere moguće je stvoriti fenotipski portret stanica karakterističnih za određeni oblik leukemije.

Osim korištenja metoda imunofenotipizacije za dijagnostiku i diferencijalnu dijagnostiku hemoblastoza, posebno važnom pokazala se njihova upotreba u procesu liječenja za procjenu stanja remisije i rezidualne populacije leukemijskih stanica. Poznavajući fenotipski "portret" blastnih stanica tijekom razdoblja dijagnoze, ovi markeri omogućuju detekciju stanica leukemijskog klona tijekom razdoblja remisije, a povećanjem njihovog broja - predviđanje razvoja relapsa mnogo prije (1-4 mjeseca) pojave njegovih kliničkih i morfoloških znakova.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]