Kariotipizacija

Za proučavanje kromosoma najčešće se koriste kratkotrajne hemokulture, stanice koštane srži i kulture fibroblasta. Krv s antikoagulansom dostavljena u laboratorij centrifugira se kako bi se eritrociti taložili, a leukociti se inkubiraju u mediju za kulturu 2-3 dana. Uzorku krvi dodaje se fitohemaglutinin, jer ubrzava aglutinaciju eritrocita i potiče diobu limfocita. Najprikladnija faza za proučavanje kromosoma je metafaza mitoze, pa se kolhicin koristi za zaustavljanje diobe limfocita u ovoj fazi. Dodavanje ovog lijeka u kulturu dovodi do povećanja udjela stanica u metafazi, odnosno u fazi staničnog ciklusa kada su kromosomi najvidljiviji. Svaki kromosom se replicira (proizvodi vlastitu kopiju) i, nakon odgovarajućeg bojenja, vidljiv je kao dvije kromatide pričvršćene na centromeru, odnosno središnju konstrikciju. Stanice se zatim tretiraju hipotoničnom otopinom natrijevog klorida, fiksiraju i boje.

Za bojanje kromosoma najčešće se koriste Romanovsky-Giemsa boja, 2%-tni acetarmin ili 2%-tni acetarsein. One boje kromosome u cijelosti, ravnomjerno (rutinska metoda) i mogu se koristiti za otkrivanje numeričkih anomalija ljudskih kromosoma.

Za dobivanje detaljne slike strukture kromosoma, identifikaciju (definiranje) pojedinačnih kromosoma ili njihovih segmenata koriste se različite metode diferencijalnog bojenja. Najčešće korištene metode su Giemsa, kao i G- i Q-pruganje. Prilikom pregleda preparata mikroskopijom duž duljine kromosoma otkriva se niz obojenih (heterokromatin) i neobojenih (eukromatin) pruga. Priroda poprečne prugavosti dobivene na ovaj način omogućuje identifikaciju svakog kromosoma u skupu, budući da su izmjena pruga i njihove veličine strogo individualne i konstantne za svaki par.

Metafazne ploče pojedinačnih stanica se fotografiraju. Pojedinačni kromosomi se izrezuju s fotografija i lijepe redom na list papira; ta slika kromosoma naziva se kariotip.

Korištenje dodatnog bojenja, kao i nove metode za dobivanje kromosomskih preparata koji omogućuju istezanje kromosoma u duljinu, značajno povećavaju točnost citogenetske dijagnostike.

Razvijena je posebna nomenklatura za opis ljudskog kariotipa. Normalni kariotip muškarca i žene označava se kao 46, XY odnosno 46, XX. Kod Downovog sindroma, koji karakterizira prisutnost dodatnog kromosoma 21 (trisomija 21), kariotip žene opisuje se kao 47, XX 21+, a muškarca kao 47, XY, 21+. U prisutnosti strukturne anomalije kromosoma potrebno je naznačiti promijenjeni dugi ili kratki krak: slovo p označava kratki krak, q označava dugi krak, a t označava translokaciju. Dakle, u slučaju delecije kratkog kraka kromosoma 5 (sindrom cri du chat), ženski kariotip opisuje se kao 46, XX, 5p-. Majka djeteta s translokacijskim Downovim sindromom, nositeljica balansirane translokacije 14/21, ima kariotip 45, XX, t(14q; 21q). Translokacijski kromosom nastaje spajanjem dugih krakova kromosoma 14 i 21, a kratki krakovi se gube.

Svaki krak je podijeljen na regije, koje su pak podijeljene na segmente, a oba su označena arapskim brojevima. Centromera kromosoma je početna točka za brojanje regija i segmenata.

Dakle, za topografiju kromosoma koriste se četiri oznake: broj kromosoma, simbol kraka, broj regije i broj segmenta unutar regije. Na primjer, unos 6p21.3 znači da govorimo o kromosomu 6 6. para, njegovom kratkom kraku, regiji 21, segmentu 3. Postoje i dodatni simboli, posebno pter - kraj kratkog kraka, qter - kraj dugog kraka.

Citogenetska metoda istraživanja omogućuje otkrivanje delecija i drugih promjena u kromosomima veličine samo približno 1 milijun baza (nukleotida).

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]