Matične stanice i regenerativna i plastična medicina

Danas je malo liječnika u praksi koji ne znaju za razvoj novog smjera u liječenju najtežih bolesti, koje su prije bile neizlječive tradicionalnom i alternativnom medicinom. Govorimo o regenerativno-plastičnoj medicini, temeljenoj na korištenju regenerativnog potencijala matičnih stanica. Oko razvojnog smjera nastala je neviđena znanstvena rasprava i pseudoznanstvena pompa, uglavnom stvorena zahvaljujući informacijskim hiperbolama World Wide Weba. U vrlo kratkom vremenu, laboratorijske studije terapijskih mogućnosti matičnih stanica prešle su okvire eksperimenta i počele su se aktivno uvoditi u praktičnu medicinu, što je izazvalo mnoštvo problema znanstvene, etičke, vjerske, pravne i zakonodavne prirode. Državne i javne institucije očito su se pokazale nespremnima za brzinu prijelaza matičnih stanica iz Petrijevih zdjelica u sustave za intravenoznu primjenu, što nije korisno ni za društvo u cjelini ni za određenu osobu koja pati. Nije lako razumjeti nezamislivu količinu informacija o mogućnostima matičnih stanica, kako u količini tako i u kvaliteti, čak ni za stručnjake (kojih nema, budući da svi pokušavaju sami savladati novi znanstveni trend), a da ne spominjemo liječnike koji nisu izravno uključeni u regenerativnu plastičnu medicinu.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Zašto su takvi eksperimenti potrebni i jesu li uopće potrebni?

Na prvi pogled, stvaranje staničnih međuvrsnih himera plod je neobuzdane fantazije fanatičnog znanstvenika koji je zaboravio na bioetiku. Međutim, upravo je taj pristup značajno proširio naše temeljno znanje o embriogenezi, budući da je omogućio izračun broja stanica potrebnih za organogenezu (stvaranje jetre, mozga, kože i organa imunološkog sustava). Osim toga (možda je to glavno u biologiji ESC-a), genetičari su dobili na raspolaganje jedinstveni alat pomoću kojeg se tijekom himerizacije embrija može utvrditi funkcionalna svrha gena. Prvo se koristi posebna tehnika dvostrukog knockouta za „isključivanje“ proučavanog para gena u ESC-ima. Zatim se takvi ESC-i uvode u blastocistu i prate se promjene koje se događaju u tijelu himernog embrija u razvoju. Na taj su način utvrđene funkcije gena sf-1 (razvoj nadbubrežne žlijezde i spolnih organa), urt-l (bubrežni anlage), muoD (razvoj skeletnih mišića), gata-l-4 (anlage eritropoeze i limfopoeze). Osim toga, ljudski geni koji još nisu proučeni mogu se unijeti (transfektirati) u ESC laboratorijskih životinja kako bi se odredila njihova funkcija pomoću himernog embrija.

No, u pravilu, opravdavanje eksperimenta dobivanjem novih temeljnih znanja ne nailazi na podršku široke publike. Navedimo primjer primijenjenog značaja kimerizacije pomoću ESC-a. Prije svega, ovo je ksenotransplantacija, odnosno transplantacija životinjskih organa ljudima. Teoretski, stvaranje himera ljudsko-svinjskih stanica omogućuje nam dobivanje životinje koja je po antigenim karakteristikama mnogo bliža donoru ESC-a, što u raznim kliničkim situacijama (dijabetes melitus, ciroza jetre) može spasiti život bolesne osobe. Istina, za to prvo moramo naučiti kako vratiti svojstvo totipotentnosti genomu zrele somatske stanice, nakon čega se može unijeti u razvijajući svinjski embrij.

Danas se sposobnost ESC-a da se gotovo beskonačno dijele pod posebnim uvjetima uzgoja koristi za proizvodnju totipotentne stanične mase s njezinom naknadnom diferencijacijom u specijalizirane stanice, poput dopaminergičnih neurona, koji se zatim transplantiraju u pacijenta s Parkinsonovom bolešću. U tom slučaju, transplantaciji nužno prethodi ciljana diferencijacija dobivene stanične mase u specijalizirane stanice potrebne za liječenje i pročišćavanje potonjih od nediferenciranih staničnih elemenata.

Kako se kasnije ispostavilo, prijetnja karcinogeneze nije bila jedina prepreka transplantaciji stanica. Spontano se ESC u embrioidnim tijelima diferenciraju heterogeno, odnosno tvore derivate širokog spektra staničnih linija (neuroni, keratinociti, fibroblasti, endoteliociti). U vidnom polju mikroskopa u ovom slučaju, kardiomiociti se ističu među stanicama različitih fenotipova, od kojih se svaki kontrahira u svom ritmu. Međutim, za liječenje pacijenta potrebno je imati čiste stanične populacije: neurone - u slučaju moždanog udara, kardiomiocite - u slučaju infarkta miokarda, β-stanice gušterače - u slučaju dijabetesa melitusa, keratinocite - u slučaju opeklina itd.

Sljedeća faza u razvoju stanične transplantologije bila je povezana s razvojem tehnologija za dobivanje dovoljnog broja (milijuna stanica) takvih čistih staničnih populacija. Potraga za čimbenicima koji uzrokuju usmjerenu diferencijaciju ESC-a bila je empirijske prirode, budući da je slijed njihove sinteze tijekom embriogeneze ostao nepoznat. U početku je utvrđeno da se stvaranje žumanjčane vrećice inducira dodavanjem cAMP-a i retinoične kiseline u kulturu ESC-a. Hematopoetske stanične linije formirane su u prisutnosti 1L-3, SCF-a, faktora rasta fibroblasta (FGH), faktora rasta sličnog inzulinu (IGF-1), 1L-6 i faktora stimulacije kolonija granulocita (G-СSF) u mediju za kulturu. Stanice živčanog sustava formirane su iz ESC-a nakon uklanjanja LIF-a i sloja fibroblasta, koji je služio kao hranilica. Nakon tretmana retinoičnom kiselinom u prisutnosti fetalnog seruma, ESC-i su se počeli diferencirati u neurone, a kardiomiociti su dobiveni dodavanjem dimetil sulfoksida (DMSO), koji omogućuje ciljanu dostavu hidrofobnih signalnih molekula u jezgru stanice. U ovom slučaju, nakupljanje aktivnih kisikovih vrsta u mediju za kulturu, kao i električna stimulacija, pridonijeli su stvaranju zrelih kontraktilnih kardiomiocita.

Ogromni napori i resursi uloženi su u pronalaženje uvjeta za diferencijaciju ESC-a u stanice gušterače koje proizvode inzulin. Međutim, ubrzo je postalo jasno da niz specijaliziranih staničnih linija (β-stanice gušterače, imunološke i endokrine stanice, adipociti) ne nastaje iz ESC-a kada se stimuliraju prema načelu „jedan stimulirajući faktor - jedna stanična linija“. Pokazalo se da ovo načelo vrijedi samo za ograničen broj staničnih linija. Konkretno, stvaranje neurona može se inducirati retinoičnom kiselinom, linijom mišićnih stanica - transformirajućim faktorom rasta-β (TCP-β), eritroidnim linijama - 1L-6, monocitno-mijeloidnom linijom - 1L-3. Štoviše, učinci tih čimbenika na diferencijaciju ESC-a pokazali su se strogo ovisni o dozi.

Započela je faza traženja kombinacija faktora rasta koje bi unaprijedile ESC u kasnije faze embriogeneze s formiranjem mezoderma (izvor kardiomiocita, skeletnih mišića, epitela bubrežnih tubula, mijeloeritropoeze i stanica glatkih mišića), ektoderma (epidermis, neuroni, mrežnica) i endoderma (epitel tankog crijeva i sekretornih žlijezda, pneumocita). Priroda je kao da je prisilila istraživače da krenu naprijed putem embriogeneze, ponavljajući njezine faze u Petrijevoj zdjelici, ne dajući priliku da odmah i lako postignu željeni rezultat. I takve su kombinacije faktora rasta pronađene. Aktivin A u kombinaciji s TGF-β pokazao se snažnim stimulatorom formiranja mezodermalnih stanica iz ESC, dok blokira razvoj endoderma i ektoderma. Retinoična kiselina i kombinacija signala morfogenetskog proteina koštane srži (BMP-4) i epidermalnog faktora rasta (EGF) aktiviraju formiranje ekto- i mezodermnih stanica, zaustavljajući razvoj endoderma. Uočava se intenzivan rast stanica sva tri zametna sloja uz istovremeni učinak dvaju čimbenika na ESC - faktora rasta hepatocita (HGF) i faktora rasta živčanih stanica.

Dakle, za dobivanje potrebnih staničnih linija potrebno je prvo prenijeti embrionalne matične stanice do stadija formiranja stanica nekog zametnog sloja, a zatim odabrati novu kombinaciju faktora rasta sposobnih za induciranje usmjerene diferencijacije ekto-, mezo- i endoderma u specijalizirane stanice potrebne za transplantaciju pacijentu. Broj kombinacija faktora rasta danas je u tisućama, većina ih je patentirana, neke biotehnološke tvrtke uopće ne otkrivaju.

Bilo je vrijeme za pročišćavanje dobivenih stanica od nediferenciranih staničnih nečistoća. Stanice diferencirane u kulturi označene su markerima zrelih staničnih linija i propuštene kroz brzi laserski imunofenotipski sorter. Laserska zraka pronašla ih je u općem staničnom toku i usmjerila ih zasebnim putem. Laboratorijske životinje bile su prve koje su primile dobiveni pročišćeni stanični materijal. Bilo je vrijeme za procjenu učinkovitosti korištenja ESC derivata na modelima bolesti i patoloških procesa. Jedan od takvih modela bila je eksperimentalna Parkinsonova bolest, koja se dobro reproducira kod životinja korištenjem kemijskih spojeva koji uništavaju dopaminergičke neurone. Budući da se bolest kod ljudi temelji na stečenom nedostatku dopaminergičnih neurona, primjena nadomjesne stanične terapije u ovom slučaju bila je patogenetski opravdana. Kod životinja s eksperimentalnim hemiparkinsonizmom, oko polovica dopaminergičnih neurona dobivenih iz ESC i uvedenih u moždane strukture se ukorijenila. To je bilo dovoljno da značajno smanji kliničke manifestacije bolesti. Pokušaji vraćanja funkcije oštećenih struktura središnjeg živčanog sustava kod eksperimentalnih moždanih udara, ozljeda, pa čak i ruptura leđne moždine pokazali su se prilično uspješnima.

Međutim, treba napomenuti da su gotovo svi slučajevi uspješne upotrebe diferenciranih ESC derivata za korekciju eksperimentalne patologije provedeni u akutnom razdoblju simulirane patološke situacije. Rezultati udaljenog liječenja nisu bili toliko utješni: nakon 8-16 mjeseci, pozitivan učinak transplantacije stanica nestao je ili se naglo smanjio. Razlozi za to su prilično jasni. Diferencijacija transplantiranih stanica in vitro ili in loco morbi neizbježno dovodi do ekspresije staničnih markera genetske stranosti, što izaziva imunološki napad tijela primatelja. Kako bi se riješio problem imunološke nekompatibilnosti, korištena je tradicionalna imunosupresija, paralelno s kojom su klinička ispitivanja počela shvaćati potencijal transdiferencijacije i genetske korekcije autolognih hematopoetskih i mezenhimalnih matičnih stanica koje ne uzrokuju imunološki sukob.

Što je regenerativna plastična medicina?

Evolucija je odredila dvije glavne mogućnosti za kraj života stanice - nekrozu i apoptozu, koje na razini tkiva odgovaraju procesima proliferacije i regeneracije. Proliferacija se može smatrati vrstom žrtvovanja, kada se popunjavanje defekta oštećenog tkiva događa zbog njegove zamjene elementima vezivnog tkiva: uz održavanje strukturnog integriteta, tijelo djelomično gubi funkciju zahvaćenog organa, što određuje naknadni razvoj kompenzacijskih reakcija s hipertrofijom ili hiperplazijom strukturnih i funkcionalnih elemenata koji ostaju netaknuti. Trajanje kompenzacijskog razdoblja ovisi o volumenu strukturnih lezija uzrokovanih čimbenicima primarne i sekundarne promjene, nakon čega u velikoj većini slučajeva dolazi do dekompenzacije, naglog pogoršanja kvalitete i smanjenja trajanja ljudskog života. Fiziološka regeneracija osigurava procese remodeliranja, odnosno zamjenu starih i umirućih stanica mehanizmima prirodne stanične smrti (apoptoze) novima koje potječu iz rezervi matičnih stanica ljudskog tijela. Procesi reparativne regeneracije također uključuju stanične resurse matičnih prostora, koji se, međutim, mobiliziraju u patološkim stanjima povezanim s bolešću ili oštećenjem tkiva, pokrećući staničnu smrt mehanizmima nekroze.

Pažljiva pozornost znanstvenika, liječnika, tiska, televizije i javnosti na problem proučavanja biologije embrionalnih matičnih stanica (EMS) posljedica je, prije svega, visokog potencijala stanične ili, kako je mi nazivamo, regenerativno-plastične terapije. Razvoj metoda za liječenje najtežih ljudskih bolesti (degenerativna patologija središnjeg živčanog sustava, ozljede leđne moždine i mozga, Alzheimerova i Parkinsonova bolest, multipla skleroza, infarkt miokarda, arterijska hipertenzija, dijabetes melitus, autoimune bolesti i leukemija, opekline i neoplastični procesi čine daleko od potpunog popisa) temelji se na jedinstvenim svojstvima matičnih stanica koje omogućuju stvaranje novih tkiva koja zamjenjuju, kako se prije vjerovalo, nepovratno oštećena područja tkiva oboljelog organizma.

Napredak teorijskih istraživanja biologije matičnih stanica u posljednjih 10 godina ostvaren je spontano nastalim područjima regenerativno-plastične medicine, čija metodologija nije samo prilično podložna sistematizaciji, već je i zahtijeva. Prvo i najbrže razvijajuće područje praktične upotrebe regenerativnog potencijala matičnih stanica postala je nadomjesna regenerativno-plastična terapija. Njezin put se prilično lako prati u znanstvenoj literaturi - od pokusa na životinjama s miokardijalnom nekrozom do radova posljednjih godina usmjerenih na obnavljanje postinfarktnog deficita kardiomiocita ili nadoknađivanje gubitka β-stanica gušterače i dopaminergičnih neurona središnjeg živčanog sustava.

Transplantacija stanica

Osnova supstitucijske regenerativno-plastične medicine je transplantacija stanica. Potonju treba definirati kao kompleks medicinskih mjera tijekom kojih tijelo pacijenta ima izravan kontakt s održivim stanicama auto-, alo-, izo- ili ksenogenog podrijetla tijekom kratkog ili duljeg vremenskog razdoblja. Sredstvo transplantacije stanica je suspenzija matičnih stanica ili njihovih derivata, standardizirana brojem transplantacijskih jedinica. Transplantacijska jedinica je omjer broja jedinica koje tvore kolonije u kulturi i ukupnog broja transplantiranih stanica. Metode transplantacije stanica: intravenska, intraperitonealna, potkožna primjena suspenzije matičnih stanica ili njihovih derivata; primjena suspenzije matičnih stanica ili njihovih derivata u ventrikule mozga, limfne žile ili cerebrospinalnu tekućinu.

Alo- i autologna transplantacija stanica koriste dva fundamentalno različita metodološka pristupa u ostvarivanju pluri-, multi- ili polipotentnog potencijala matičnih stanica - in vivo ili in vitro. U prvom slučaju, unošenje matičnih stanica u tijelo pacijenta provodi se bez njihove prethodne diferencijacije, u drugom - nakon reprodukcije u kulturi, ciljane diferencijacije i pročišćavanja od nediferenciranih elemenata. Među brojnim metodološkim tehnikama nadomjesne stanične terapije, tri skupine metoda se prilično jasno razlikuju: zamjena koštane srži i krvnih stanica, zamjena stanica organa i mekog tkiva, zamjena krutih i čvrstih elemenata tijela (hrskavica, kost, tetive, srčani zalisci i kapacitivne žile). Potonji smjer treba definirati kao rekonstruktivnu i regenerativnu medicinu, budući da se potencijal diferencijacije matičnih stanica ostvaruje na matrici - biološki inertnoj ili apsorbirajućoj strukturi oblikovanoj poput zamijenjenog područja tijela.

Drugi način povećanja intenziteta regenerativno-plastičnih procesa u oštećenim tkivima je mobilizacija vlastitih matičnih resursa pacijenta korištenjem egzogenih faktora rasta, poput faktora stimulacije kolonija granulocita i granulocitno-makrofagnih kolonija. U ovom slučaju, ruptura stromalnih veza dovodi do povećanja oslobađanja hematopoetskih matičnih stanica u opći krvotok, koje u području oštećenja tkiva osiguravaju procese regeneracije zbog svoje inherentne plastičnosti.

Dakle, metode regenerativne medicine usmjerene su na poticanje procesa obnove izgubljene funkcije - bilo mobilizacijom vlastitih matičnih rezervi pacijenta, bilo uvođenjem alogenog staničnog materijala.

Važan praktični rezultat otkrića embrionalnih matičnih stanica je terapijsko kloniranje temeljeno na razumijevanju okidača embriogeneze. Ako je početni signal za početak embriogeneze pre-mRNA kompleks koji se nalazi u citoplazmi oocita, tada bi unošenje jezgre bilo koje somatske stanice u enukleiranu jajnu stanicu trebalo pokrenuti program razvoja embrija. Danas već znamo da u provedbi programa embriogeneze sudjeluje oko 15 000 gena. Što se s njima događa kasnije, nakon rođenja, tijekom razdoblja rasta, zrelosti i starenja? Odgovor na ovo pitanje dala je ovca Dolly: oni su sačuvani. Korištenjem najsuvremenijih istraživačkih metoda dokazano je da jezgre odraslih stanica zadržavaju sve kodove potrebne za stvaranje embrionalnih matičnih stanica, zametnih slojeva, organogenezu i restrikcijsko sazrijevanje (izlaz u diferencijaciju i specijalizaciju) staničnih linija mezenhimalnog, ekto-, endo- i mezodermalnog podrijetla. Terapijsko kloniranje kao smjer formirano je već u najranijim fazama razvoja stanične transplantologije i predviđa povratak totipotentnosti vlastitim somatskim stanicama pacijenta kako bi se dobio genetski identičan transplantacijski materijal.

Otkriće matičnih stanica započelo je „od kraja“, budući da se termin koji je u biologiju i medicinu uveo A. Maksimov odnosio na matične stanice koštane srži, koje daju sve zrele stanične elemente periferne krvi. Međutim, hematopoetske matične stanice, kao i stanice svih tkiva odraslog organizma, također imaju svog, manje diferenciranog prethodnika. Zajednički izvor za apsolutno sve somatske stanice je embrionalna matična stanica. Treba napomenuti da koncepti „embrionalnih matičnih stanica“ i „embrionalnih matičnih stanica“ nipošto nisu identični. Embrionalne matične stanice izolirao je J. Thomson iz unutarnje stanične mase blastociste i prenio ih u dugovječne stanične linije. Samo te stanice imaju faksimil „ESC-a“. Leroy Stevens, koji je otkrio embrionalne matične stanice u pokusima na miševima, nazvao ih je „embrionalnim pluripotentnim matičnim stanicama“, misleći na sposobnost ESC-a da se diferenciraju u derivate sva tri zametna sloja (ekto-, mezo- i endoderm). Međutim, sve stanice embrija u kasnijim fazama razvoja također su matične stanice, budući da daju ogroman broj stanica koje tvore tijelo odrasle osobe. Kako bismo ih definirali, predlažemo termin „embrionalne pluripotentne progenitorske stanice“.

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Vrste matičnih stanica

Suvremena klasifikacija matičnih stanica temelji se na principu njihove podjele prema sposobnosti (potenciji) da daju stanične linije, što se definira kao toti-, pluri-, multi-, poli-, bi- i unipotentnost. Totipotentnost, odnosno sposobnost ponovnog stvaranja genetski programiranog organizma kao cjeline, posjeduju zigotne stanice, blastomeri i embrionalne matične stanice (stanice unutarnje mase blastociste). Drugu skupinu totipotentnih stanica, koje se formiraju u kasnijim fazama embrionalnog razvoja, predstavljaju primarne zametne stanice embrionalne genitalne zone (genitalni tuberkuli). Pluripotentnost, što je sposobnost diferencijacije u stanice bilo kojeg organa ili tkiva, svojstvena je embrionalnim stanicama triju zametnih slojeva - ekto-, mezo- i endoderma. Smatra se da je multipotentnost, tj. sposobnost stvaranja bilo kojih stanica unutar jedne specijalizirane linije, karakteristična samo za dvije vrste stanica: takozvane mezenhimske matične stanice, koje se formiraju u neuralnom grebenu i prekursori su svih stanica vezivnog tkiva tijela, uključujući neuroglijske stanice, kao i hematopoetske hematopoetske matične stanice, koje daju početak svim linijama krvnih stanica. Osim toga, razlikuju se bi- i unipotentne matične stanice, posebno prekursorske stanice mijeloidnih, limfoidnih, monocitnih i megakariocitnih hematopoetskih klica. Postojanje unipotentnih matičnih stanica jasno je dokazano na primjeru stanica jetre - gubitak značajnog dijela tkiva jetre nadoknađuje se intenzivnom diobom diferenciranih poliploidnih hepatocita.

Tijekom razvoja, svi organi i tkiva nastaju kao rezultat proliferacije i diferencijacije unutarnje stanične mase blastociste, čije su stanice, u strogom smislu, totipotentne embrionalne matične stanice. Prvi rad na izolaciji embrionalnih matičnih stanica proveo je Evans, koji je pokazao da blastociste implantirane u mozak miševa daju teratokarcinome, čije stanice, kada se kloniraju, tvore linije pluripotentnih embrionalnih matičnih stanica (izvorni naziv tih stanica - stanice embrionalnog karcinoma ili u kratici ECС - trenutno se ne koristi). Ovi podaci potvrđeni su u nizu drugih studija u kojima su embrionalne matične stanice dobivene uzgojem stanica blastociste miševa i drugih životinjskih vrsta, kao i ljudi.

Posljednjih godina literatura sve više izvještava o plastičnosti matičnih stanica, koja se ne smatra samo sposobnošću potonjih da se diferenciraju u različite tipove stanica u različitim fazama razvoja, već i da prođu dediferencijaciju (transdiferencijaciju, retrodiferencijaciju). To jest, priznaje se temeljna mogućnost povratka somatski diferencirane stanice u stadij embrionalnog razvoja s rekapitulacijom (povratkom) pluripotentnosti i njezinom provedbom u ponovljenoj diferencijaciji s formiranjem stanica drugačijeg tipa. Posebno se navodi da su hematopoetske matične stanice sposobne za transdiferencijaciju s formiranjem hepatocita, kardiomioblasta i endoteliocita.

Znanstvene rasprave o podjeli matičnih stanica prema njihovoj plastičnosti nastavljaju se, odnosno u procesu je formiranja terminologije i glosara transplantacije stanica, što ima izravno praktično značenje, budući da se većina metoda regenerativne plastične medicine temelji na korištenju plastičnih svojstava i sposobnosti matičnih stanica da se diferenciraju u različite stanične linije.

Broj publikacija iz područja temeljnih i primijenjenih problema regenerativno-plastične medicine brzo raste. Već je ocrtan niz različitih metodoloških pristupa usmjerenih na najoptimalnije korištenje regenerativno-plastičnog potencijala matičnih stanica. Kardiolozi i endokrinolozi, neurolozi i neurokirurzi, transplantolozi i hematolozi identificirali su svoja područja gorućeg interesa. Oftalmolozi, ftiziolozi, pulmolozi, nefrolozi, onkolozi, genetičari, pedijatri, gastroenterolozi, terapeuti i pedijatri, kirurzi i opstetričari-ginekolozi traže rješenje za goruće probleme u plastičnim sposobnostima matičnih stanica - svi predstavnici moderne medicine nadaju se da će dobiti priliku izliječiti bolesti koje su se prije smatrale smrtonosnima.

Je li transplantacija stanica sljedeći "lijek za sve"?

Ovo pitanje s pravom se postavlja kod svih promišljenih liječnika i znanstvenika koji analiziraju trenutno stanje medicinske znanosti. Situaciju komplicira činjenica da su na jednoj strani polja znanstvene konfrontacije „zdravi konzervativci“, a na drugoj – „bolesni fanatici“ transplantacije stanica. Očito je da je istina, kao i uvijek, između njih – u „ničijoj zemlji“. Ne dotičući se pitanja prava, etike, religije i morala, razmotrimo prednosti i nedostatke određenih područja regenerativno-plastične medicine. „Lagani povjetarac“ prvih znanstvenih izvješća o terapijskim mogućnostima embrionalnih matičnih stanica pretvorio se u „olujni vjetar“ godinu dana nakon njihovog otkrića, koji se 2003. godine zavrtio u „informacijski tornado“. Prva serija publikacija bavila se pitanjima uzgoja embrionalnih matičnih stanica, njihove reprodukcije i usmjerene diferencijacije in vitro.

Pokazalo se da je za neograničenu reprodukciju embrionalnih matičnih stanica u kulturi potrebno strogo se pridržavati niza uvjeta. U uvjetovanom mediju moraju biti prisutna tri faktora: interleukin-6 (IL-6), faktor matičnih stanica (SCF) i faktor inhibitora leukaze (LIF). Osim toga, embrionalne matične stanice moraju se uzgajati na supstratu (hranidbenom sloju stanica) embrionalnih fibroblasta i u prisutnosti fetalnog telećeg seruma. Ako su ti uvjeti ispunjeni, ESC u kulturi rastu kao klonovi i tvore embrioidna tijela - agregate suspenzijskih klonova sfernih stanica. Najvažnija značajka ESC klona je da u kulturi embrioidno tijelo prestaje rasti kada se u agregatu nakupi 50-60, maksimalno 100 stanica. Tijekom tog razdoblja nastupa ravnotežno stanje - brzina diobe stanica unutar klona jednaka je brzini apoptoze (programirane stanične smrti) na njegovoj periferiji. Nakon postizanja takve dinamičke ravnoteže, periferne stanice embrioidnog tijela podliježu spontanoj diferencijaciji (obično stvaranjem endodermalnih fragmenata žumanjčane vrećice, angioblasta i endoteliocita) s gubitkom totipotentnosti. Stoga, kako bi se dobila dovoljna količina totipotentne stanične mase, embrioidno tijelo mora se tjedno razdvajati transplantacijom pojedinačnih embrionalnih matičnih stanica u novi hranjivi medij - što je prilično radno intenzivan proces.

Otkriće embrionalnih matičnih stanica nije odgovorilo na pitanje što točno i kako pokreće programe embriogeneze šifrirane u DNA zigote. Ostaje nejasno kako se program genoma odvija tijekom ljudskog života. Istodobno, proučavanje embrionalnih matičnih stanica omogućilo je razvoj koncepta mehanizama za održavanje toti-, pluri- i multipotentnosti matičnih stanica tijekom njihove diobe. Glavna odlika matične stanice je njezina sposobnost samoreprodukcije. To znači da se matična stanica, za razliku od diferencirane stanice, dijeli asimetrično: jedna od stanica kćeri daje specijaliziranu staničnu liniju, a druga zadržava toti-, pluri- ili multipotentnost genoma. Ostalo je nejasno zašto i kako se taj proces događa u najranijim fazama embriogeneze, kada je unutarnja stanična masa blastociste koja se dijeli u potpunosti totipotentna, a genom ESC-a je u uspavanom (spavajućem, inhibiranom) stanju. Ako tijekom diobe obične stanice procesu dupliciranja nužno prethodi aktivacija i ekspresija cijelog kompleksa gena, onda se tijekom diobe ESC-a to ne događa. Odgovor na pitanje „zašto“ dobiven je nakon otkrića već postojeće mRNA (pre-mRNA) u ESC-ima, od kojih se neke formiraju u folikularnim stanicama i pohranjuju u citoplazmi jajne stanice i zigote. Drugo otkriće odgovorilo je na pitanje „kako“: u ESC-ima pronađeni su posebni enzimi nazvani „editaze“. Editaze obavljaju tri važne funkcije. Prvo, omogućuju alternativno epigenetičko (bez sudjelovanja genoma) čitanje i dupliciranje pre-mRNA. Drugo, provode proces aktivacije pre-mRNA (spajanje - izrezivanje introna, odnosno neaktivnih dijelova RNA koji inhibiraju proces sinteze proteina na mRNA), nakon čega u stanici počinje sastavljanje proteinskih molekula. Treće, editaze potiču stvaranje sekundarnih mRNA, koje su represori mehanizama ekspresije gena, što održava gusto pakiranje kromatina i neaktivno stanje gena. Proteinski produkti sintetizirani na takvim sekundarnim mRNA i nazvani proteini utišivači ili čuvari genoma prisutni su u ljudskim jajnim stanicama.

Tako se danas predstavlja mehanizam formiranja besmrtnih staničnih linija embrionalnih matičnih stanica. Jednostavno rečeno, signal za pokretanje programa embriogeneze, čije se početne faze sastoje od formiranja totipotentne stanične mase, dolazi iz citoplazme jajne stanice. Ako se u ovoj fazi unutarnja stanična masa blastociste, tj. ESC, izolira od daljnjih regulatornih signala, proces samoreprodukcije stanica odvija se u zatvorenom ciklusu bez sudjelovanja gena stanične jezgre (epigenetski). Ako se takvoj stanici osigura hranjivi materijal i izolira od vanjskih signala koji potiču diferencijaciju stanične mase, ona će se dijeliti i reproducirati svoju vrstu unedogled.

Prvi rezultati eksperimentalnih pokušaja korištenja totipotentnih stanica za transplantaciju bili su prilično impresivni: uvođenje embrionalnih matičnih stanica u tkiva miševa s imunološkim sustavom oslabljenim imunosupresivima dovelo je do razvoja tumora u 100% slučajeva. Među stanicama neoplazme, čiji su izvor bile ESC, postojali su diferencirani derivati totipotentnog egzogenog staničnog materijala, posebno neuroni, ali rast teratokarcinoma smanjio je vrijednost dobivenih rezultata na nulu. Istodobno, u radovima L. Stevensa, ESC unesene u trbušnu šupljinu formirale su velike agregate u kojima su fragmentirano formirani embrionalni mišići, srce, kosa, koža, kosti, mišići i živčano tkivo. (Kirurzi koji su otvarali dermoidne ciste trebali bi biti upoznati s ovom slikom). Zanimljivo je da se suspendirane mišje embrioblastne stanice ponašaju na potpuno isti način: njihovo uvođenje u tkiva odraslih imunokompromitiranih životinja uvijek uzrokuje stvaranje teratokarcinoma. Ali ako se iz takvog tumora izolira čista linija ESC-a i unese u trbušnu šupljinu, tada se ponovno formiraju specijalizirani somatski derivati sva tri zametna sloja bez znakova karcinogeneze.

Dakle, sljedeći problem koji je trebalo riješiti bio je pročišćavanje staničnog materijala od nečistoća nediferenciranih stanica. Međutim, čak i uz vrlo visoku učinkovitost ciljane stanične diferencijacije, do 20% stanica u kulturi zadržava svoj totipotentni potencijal, koji se in vivo, nažalost, ostvaruje u rastu tumora. Još jedna "praćka" prirode - na ljestvici medicinskog rizika, jamstvo oporavka pacijenta uravnotežuje se s jamstvom njegove smrti.

Odnos između tumorskih stanica i embrionalnih pluripotentnih progenitorskih stanica (EPPC), koje su naprednije u razvoju od ESC, prilično je dvosmislen. Rezultati naših istraživanja pokazali su da uvođenje EPPC-a u različite transplantabilne tumore u štakora može dovesti do dezintegracije tumorskog tkiva (G), brzog povećanja tumorske mase (D), njegovog smanjenja (E-3) ili ne utječe na veličinu spontane centralne fokalne nekroze neoplastičnog tkiva (I, K). Očito je da je rezultat interakcije EPPC-a i tumorskih stanica određen ukupnim skupom citokina i faktora rasta koje one proizvode in vivo.

Vrijedno je napomenuti da se embrionalne matične stanice, reagirajući karcinogenezom na kontakt s odraslim tkivima, savršeno asimiliraju sa staničnom masom embrija, integrirajući se u sve organe embrija. Takve himere, koje se sastoje od vlastitih stanica embrija i donorskih ESC-a, nazivaju se alofenskim životinjama, iako zapravo nisu fenotipske himere. Hematopoetski sustav, koža, živčano tkivo, jetra i tanko crijevo podliježu maksimalnoj staničnoj kimerizaciji kada se ESC-i unesu u rani embrij. Opisani su slučajevi kimerizacije genitalija. Jedina zona nepovrediva za ESC-e su primarne zametne stanice.

To jest, embrij zadržava genetske informacije svojih roditelja, što štiti čistoću i nastavak i roda i vrste.

U uvjetima blokade stanične diobe ranog embrija pomoću citoklazina, uvođenje embrionalnih matičnih stanica u blastocistu dovodi do razvoja embrija čije su primarne zametne stanice, kao i sve ostale, nastale od donorskih embrionalnih matičnih stanica. Ali u ovom slučaju, sam embrij je potpuno donorski, genetski stran tijelu surogat majke. Mehanizmi takve prirodne blokade potencijala za miješanje vlastitih i stranih nasljednih informacija još nisu razjašnjeni. Može se pretpostaviti da se u ovom slučaju ostvaruje program apoptoze, čije nam odrednice još nisu poznate.

Treba napomenuti da embriogeneza životinja različitih vrsta nikada nije koordinirana: prilikom provedbe donorskog programa organogeneze u tijelu embrija primatelja ksenogenih embrionalnih matičnih stanica, embrij umire u maternici i resorbira se. Stoga postojanje himera "štakor-miš", "svinja-krava", "čovjek-štakor" treba shvatiti kao stanični, ali ne i morfološki mozaicizam. Drugim riječima, kada se ESC jedne vrste sisavaca unesu u blastocistu druge vrste, uvijek se razvijaju potomci majčine vrste u kojima se, među vlastitim stanicama gotovo svih organa, nalaze inkluzije, a ponekad i nakupine strukturnih i funkcionalnih jedinica koje se sastoje od genetski stranog materijala derivata ESC-a. Pojam "humanizirana svinja" ne može se shvatiti kao oznaka neke vrste čudovišta obdarenog inteligencijom ili vanjskim karakteristikama čovjeka. Ovo je samo životinja čiji dio tjelesnih stanica potječe od ljudskih ESC-a unesenih u blastocistu svinje.

Perspektive korištenja matičnih stanica

Odavno je poznato da se bolesti povezane s genopatologijom stanica hematopoetskog i limfoidnog roda često eliminiraju nakon alogene transplantacije koštane srži. Zamjena vlastitog hematopoetskog tkiva genetski normalnim stanicama od srodnog donora dovodi do djelomičnog, a ponekad i potpunog oporavka pacijenta. Među genetskim bolestima koje se liječe alogenom transplantacijom koštane srži, vrijedi istaknuti sindrom kombinirane imunodeficijencije, X-vezanu agamaglobulinemiju, kroničnu granulomatozu, Wiskott-Aldrichov sindrom, Gaucherovu i Hurlerovu bolest, adrenoleukodistrofiju, metakromatsku leukodistrofiju, anemiju srpastih stanica, talasemiju, Fanconijevu anemiju i AIDS. Glavni problem u primjeni alogene transplantacije koštane srži u liječenju ovih bolesti povezan je s odabirom HbA-kompatibilnog srodnog donora, za čiju uspješnu potragu potrebno je u prosjeku 100 000 uzoraka tipiziranog hematopoetskog tkiva donora.

Genska terapija omogućuje ispravljanje genetskog defekta izravno u hematopoetskim matičnim stanicama pacijenta. Teoretski, genska terapija pruža iste prednosti u liječenju genetskih bolesti hematopoetskog sustava kao i alogena transplantacija koštane srži, ali bez svih mogućih imunoloških komplikacija. Međutim, to zahtijeva tehniku koja omogućuje učinkovit prijenos punopravnog gena u hematopoetske matične stanice i održavanje potrebne razine njegove ekspresije, koja kod određenih vrsta nasljedne patologije možda nije vrlo visoka. U ovom slučaju, čak i blago nadoknađivanje proteinskog produkta deficijentnog gena daje pozitivan klinički učinak. Konkretno, kod hemofilije B, 10-20% normalne razine faktora IX sasvim je dovoljno za obnovu unutarnjeg mehanizma zgrušavanja krvi. Genetska modifikacija autolognog staničnog materijala pokazala se uspješnom u eksperimentalnom hemiparkinsonizmu (jednostrano uništavanje dopaminergičnih neurona). Transfekcija embrionalnih fibroblasta štakora retrovirusnim vektorom koji sadrži gen tirozin hidroksilaze osigurala je sintezu dopamina u središnjem živčanom sustavu: intracerebralna primjena transficiranih fibroblasta oštro je smanjila intenzitet kliničkih manifestacija eksperimentalnog modela Parkinsonove bolesti kod eksperimentalnih životinja.

Perspektiva korištenja matičnih stanica za gensku terapiju ljudskih bolesti postavila je mnoge nove izazove za kliničare i eksperimentatore. Problematični aspekti genske terapije povezani su s razvojem sigurnog i učinkovitog sustava za transport gena u ciljnu stanicu. Trenutno je učinkovitost transfera gena u velike stanice sisavaca vrlo niska (1%). Metodički se ovaj problem rješava na različite načine. In vitro transfer gena uključuje transfekciju genetskog materijala u pacijentove stanice u kulturi, s njihovim naknadnim povratkom u pacijentovo tijelo. Ovaj pristup treba prepoznati kao optimalan pri korištenju gena unesenih u matične stanice koštane srži, budući da su metode prijenosa hematopoetskih stanica iz tijela u kulturu i natrag dobro utvrđene. Retrovirusi se najčešće koriste za prijenos gena u hematopoetske stanice in vitro. Međutim, većina hematopoetskih matičnih stanica nalazi se u stanju mirovanja, što komplicira transport genetskih informacija pomoću retrovirusa i zahtijeva traženje novih načina učinkovitog transporta gena u uspavane matične stanice. Trenutno se koriste metode prijenosa gena poput transfekcije, izravne mikroinjekcije DNA u stanice, lipofekcije, elektroporacije, „genskog pištolja“, mehaničkog spajanja pomoću staklenih kuglica, transfekcije hepatocita s receptorski ovisnim spajanjem DNA na azijaloglikoprotein te aerosolnog unošenja transgena u stanice alveolarnog epitela pluća. Učinkovitost prijenosa DNA ovim metodama iznosi 10,0-0,01%. Drugim riječima, ovisno o načinu unošenja genetske informacije, uspjeh se može očekivati kod 10 pacijenata od 100 ili kod 1 pacijenta od 10 000 pacijenata. Očito je da učinkovita i istovremeno sigurna metoda prijenosa terapijskih gena tek treba biti razvijena.

Fundamentalno drugačije rješenje problema odbacivanja alogenog staničnog materijala u transplantaciji stanica jest korištenje visokih doza embrionalnih pluripotentnih progenitorskih stanica kako bi se postigao učinak ponovne instalacije sustava kontrole antigenske homeostaze odraslog organizma (Kukharchuk-Radchenko-Sirmanov efekt), čija se bit nalazi u indukciji imunološke tolerancije stvaranjem nove baze imunokompetentnih stanica uz istovremeno reprogramiranje sustava kontrole antigenske homeostaze. Nakon uvođenja visokih doza EPPC-a, potonji se fiksiraju u tkivima timusa i koštane srži. U timusu se EPPC, pod utjecajem specifičnog mikrookruženja, diferenciraju u dendritične, interdigitne stanice i epitelno-stromalne elemente. Tijekom diferencijacije EPPC-a u timusu primatelja, uz vlastite molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) primatelja, eksprimiraju se i molekule MHC-a koje su genetski određene u stanicama donora, odnosno uspostavlja se dvostruki standard molekula MHC-a, prema kojem se ostvaruje pozitivna i negativna selekcija T-limfocita.

Dakle, obnova efektorske veze imunološkog sustava primatelja događa se putem poznatih mehanizama pozitivne i negativne selekcije T-limfocita, ali putem dvostrukog standarda MHC molekula - EPPC-a primatelja i donora.

Reprogramiranje imunološkog sustava pomoću EPPC-a ne samo da omogućuje transplantaciju stanica bez naknadne dugotrajne upotrebe imunosupresiva, već i otvara potpuno nove perspektive u liječenju autoimunih bolesti te pruža uporište za razvoj novih ideja o procesu starenja čovjeka. Kako bismo razumjeli mehanizme starenja, predložili smo teoriju iscrpljivanja matičnih prostora tijela. Prema glavnoj odredbi ove teorije, starenje je trajno smanjenje veličine matičnih prostora tijela, što se shvaća kao skup regionalnih ("odraslih") matičnih stanica (mezenhimalnih, neuronskih, hematopoetskih matičnih stanica, progenitorskih stanica kože, probavnog trakta, endokrinog epitela, pigmentnih stanica cilijarnih nabora itd.), koje nadoknađuju stanične gubitke odgovarajućeg tkiva u procesu preoblikovanja tijela. Preoblikovanje tijela je obnavljanje staničnog sastava svih tkiva i organa zahvaljujući stanicama matičnih prostora, koje se nastavlja tijekom cijelog života višestaničnog organizma. Broj stanica u matičnim prostorima određen je genetski, što određuje ograničenu veličinu (proliferativni potencijal) svakog matičnog prostora. Zauzvrat, veličina matičnih prostora određuje brzinu starenja pojedinih organa, tkiva i tjelesnih sustava. Nakon iscrpljivanja staničnih rezervi matičnih prostora, intenzitet i brzina starenja višećelijskog organizma određeni su mehanizmima starenja somatskih diferenciranih stanica unutar Hayflickove granice.

Stoga, u fazi postnatalne ontogeneze, širenje matičnih prostora ne samo da može značajno povećati životni vijek, već i poboljšati kvalitetu života obnavljanjem potencijala preoblikovanja tijela. Proširenje matičnih prostora može se postići unošenjem velikih doza alogenih embrionalnih pluripotentnih progenitorskih stanica, pod uvjetom da se istovremeno reprogramira imunološki sustav primatelja, što značajno povećava životni vijek starih miševa u eksperimentu.

Teorija iscrpljivanja matičnog prostora može promijeniti postojeće ideje ne samo o mehanizmima starenja, već i o bolesti, kao i o posljedicama njezina liječenja lijekovima. Konkretno, bolest se može razviti kao posljedica patologije stanica matičnog prostora (onkopatologija). Iscrpljivanje rezerve mezenhimalnih matičnih stanica remeti procese preoblikovanja vezivnog tkiva, što dovodi do pojave vanjskih znakova starenja (bore, mlohavost kože, celulit). Iscrpljivanje rezerve matičnih endotelnih stanica uzrokuje razvoj arterijske hipertenzije i ateroskleroze. Početno mala veličina timusnog matičnog prostora određuje njegovu ranu trajnu involuciju povezanu sa starenjem. Prijevremeno starenje posljedica je početnog patološkog smanjenja veličine svih matičnih prostora tijela. Stimulacija rezervi matičnih stanica lijekovima i nelijekovima poboljšava kvalitetu života smanjenjem njegovog trajanja, budući da smanjuje veličinu matičnih prostora. Niska učinkovitost modernih geroprotektora posljedica je njihovog zaštitnog učinka na starenje diferenciranih somaskih stanica, a ne na matične prostore tijela.

Zaključno, želimo još jednom napomenuti da je regenerativno-plastična medicina novi smjer u liječenju ljudskih bolesti temeljen na korištenju regenerativno-plastičnog potencijala matičnih stanica. U ovom slučaju, plastičnost se shvaća kao sposobnost egzogenih ili endogenih matičnih stanica da se implantiraju i daju nove specijalizirane stanične klice u oštećenim područjima tkiva oboljelog organizma. Predmet regenerativno-plastične medicine su smrtonosne ljudske bolesti koje su trenutno neizlječive, nasljedna patologija, bolesti kod kojih metode tradicionalne medicine postižu samo simptomatski učinak, kao i anatomski defekti tijela, čija je obnova cilj rekonstruktivno-plastične regenerativne kirurgije. Po našem mišljenju, prerano je prve pokušaje ponovnog stvaranja cjelovitih i funkcionalno potpunih organa iz matičnih stanica smatrati zasebnim područjem praktične medicine. Predmet regenerativno-plastične medicine su matične stanice koje, ovisno o izvoru njihovog primanja, imaju različit regenerativno-plastični potencijal. Metodologija regenerativne plastične medicine temelji se na transplantaciji matičnih stanica ili njihovih derivata.