Ograničenja, opasnosti i komplikacije transplantacije stanica

Regenerativna plastična medicina temelji se na kliničkoj primjeni toti- i pluripotentnih svojstava embrionalnih i progenitorskih matičnih stanica, koja omogućuju in vitro i in vivo stvaranje specifičnih staničnih linija koje repopuliraju oštećena tkiva i organe bolesne osobe.

Stvarna mogućnost korištenja embrionalnih matičnih stanica i matičnih stanica definitivnih tkiva (tzv. „odrasle“ matične stanice) ljudi u terapijske svrhe više nije upitna. Međutim, stručnjaci iz Nacionalne i medicinske akademije SAD-a (Matične stanice i buduća regenerativna medicina National Academy Press) i Nacionalnog instituta za zdravlje SAD-a (Matične stanice i budući smjerovi istraživanja. Nat. Inst, of Health USA) preporučuju detaljnije proučavanje svojstava matičnih stanica u eksperimentima na adekvatnim biološkim modelima i objektivnu procjenu svih posljedica transplantacije, a tek onda korištenje matičnih stanica u klinici.

Utvrđeno je da su matične stanice dio tkivnih derivata sva tri zametna sloja. Matične stanice nalaze se u mrežnici, rožnici, epidermi kože, koštanoj srži i perifernoj krvi, u krvnim žilama, zubnoj pulpi, bubregu, gastrointestinalnom epitelu, gušterači i jetri. Korištenjem suvremenih metoda dokazano je da su neuralne matične stanice lokalizirane u mozgu i leđnoj moždini odrasle osobe. Ovi senzacionalni podaci privukli su posebnu pozornost znanstvenika i medija, budući da su neuroni u mozgu poslužili kao klasičan primjer statične stanične populacije koja se ne obnavlja. I u ranom i u kasnom razdoblju ontogeneze, neuroni, astrociti i oligodendrociti nastaju u mozgu životinja i ljudi zahvaljujući neuralnim matičnim stanicama (Matične stanice: znanstveni napredak i budući istraživački smjerovi. Nacionalni institut za zdravlje SAD-a).

Međutim, u normalnim uvjetima, plastičnost matičnih stanica definitivnih tkiva se ne manifestira. Da bi se ostvario plastični potencijal matičnih stanica definitivnih tkiva, one se moraju izolirati, a zatim uzgajati u medijima s citokinima (LIF, EGF, FGF). Štoviše, derivati matičnih stanica uspješno se usađuju samo kada se transplantiraju u tijelo životinje s oslabljenim imunološkim sustavom (γ-zračenje, citostatici, busulfan itd.). Do danas nisu dobiveni uvjerljivi dokazi o primjeni plastičnosti matičnih stanica kod životinja koje nisu bile izložene zračenju ili drugim učincima koji uzrokuju duboku imunosupresiju.

U takvim uvjetima, opasni potencijal ESC-a očituje se, prije svega, tijekom njihove transplantacije u ektopična područja - tijekom potkožne injekcije ESC-a u imunodeficijentne miševe, na mjestu injekcije nastaju teratokarcinomi. Osim toga, tijekom razvoja ljudskog embrija, učestalost kromosomskih abnormalnosti je veća nego u embriogenezi kod životinja. U fazi blastociste, samo 20-25% ljudskih embrija sastoji se od stanica s normalnim kariotipom, a velika većina ranih ljudskih embrija dobivenih nakon in vitro oplodnje pokazuje kaotičan kromosomski mozaicizam i vrlo često se susreće s numeričkim i strukturnim aberacijama.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Blagotvorni učinci matičnih stanica

Preliminarni rezultati kliničkih ispitivanja potvrđuju blagotvoran učinak matičnih stanica na pacijenta, ali još uvijek nema informacija o dugoročnim učincima transplantacije stanica. U literaturi su u početku dominirala izvješća o pozitivnim rezultatima transplantacije embrionalnih fragmenata mozga kod Parkinsonove bolesti, ali su se potom počeli pojavljivati podaci koji negiraju učinkovit terapijski učinak embrionalnog ili fetalnog živčanog tkiva transplantiranog u mozak pacijenata.

Sredinom 20. stoljeća prvi put je otkrivena obnova hematopoeze kod smrtonosno ozračenih životinja nakon intravenske transfuzije stanica koštane srži, a 1969. godine američki istraživač D. Thomas izveo je prvu transplantaciju koštane srži kod ljudi. Nedostatak znanja o mehanizmima imunološke nekompatibilnosti stanica koštane srži donora i primatelja u to vrijeme doveo je do visoke smrtnosti zbog čestog neuspjeha transplantacije i razvoja reakcije presatka protiv domaćina. Otkriće glavnog kompleksa histokompatibilnosti, koji uključuje ljudske leukocitne antigene (HbA1c), i poboljšanje metoda njihove tipizacije omogućili su značajno povećanje preživljavanja nakon transplantacije koštane srži, što je dovelo do široke upotrebe ove metode liječenja u onkohematologiji. Desetljeće kasnije provedene su prve transplantacije hematopoetskih matičnih stanica (HSC) dobivenih iz periferne krvi pomoću leukafereze. Godine 1988. pupkovina je prvi put korištena kao izvor HSC-a u Francuskoj za liječenje djeteta s Fanconijevom anemijom, a od kraja 2000. u tisku se pojavljuju izvješća o sposobnosti HSC-a da se diferenciraju u stanice različitih tipova tkiva, što potencijalno proširuje opseg njihove kliničke primjene. Međutim, pokazalo se da transplantacijski materijal, uz HSC, sadrži značajan broj nečistoća nehematopoetskih stanica različite prirode i svojstava. U tom smislu razvijaju se metode pročišćavanja transplantata i kriteriji za procjenu njegove stanične čistoće. Posebno se koristi pozitivna imunoselekcija CD34+ stanica, koja omogućuje izolaciju HSC-a pomoću monoklonskih antitijela.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Komplikacije terapije matičnim stanicama

Komplikacije kod transplantacije koštane srži najčešće su hematološke i povezane s dugim razdobljem jatrogene pancitopenije. Najčešće se razvijaju infektivne komplikacije, anemija i krvarenja. U tom smislu, izuzetno je važno odabrati optimalni način prikupljanja, obrade i pohrane koštane srži za maksimalno očuvanje matičnih stanica, što će osigurati brzu i stabilnu obnovu hematopoeze. Prilikom karakterizacije transplantata trenutno se uobičajeno procjenjuju sljedeći parametri: broj mononuklearnih i/ili nuklearnih stanica, jedinica koje stvaraju kolonije i sadržaj CD34-pozitivnih stanica. Nažalost, ovi pokazatelji pružaju samo neizravnu procjenu stvarnog hematopoetskog kapaciteta populacije matičnih stanica transplantata. Danas ne postoje apsolutno točni parametri za određivanje dostatnosti transplantata za dugoročnu obnovu hematopoeze kod pacijenata, čak ni kod autologne transplantacije koštane srži. Razvoj općih kriterija izuzetno je težak zbog nedostatka strogih standarda za obradu, krioprezervaciju i testiranje transplantata. Osim toga, potrebno je uzeti u obzir cijeli niz čimbenika koji utječu na parametre uspješne obnove hematopoeze kod svakog pojedinog pacijenta. Kod autologne transplantacije koštane srži najvažniji od njih su broj prethodnih kemoterapijskih ciklusa, karakteristike režima kondicioniranja, razdoblje bolesti u kojem je koštana srž prikupljena i sheme korištenja faktora koji stimuliraju kolonije u posttransplantacijskom razdoblju. Osim toga, ne treba zaboraviti da kemoterapija koja prethodi uzimanju transplantata može imati negativan učinak na matične stanice koštane srži.

Učestalost teških toksičnih komplikacija značajno se povećava tijekom alogene transplantacije koštane srži. U tom smislu, zanimljivi su statistički podaci o alogenoj transplantaciji koštane srži kod talasemije. Izvješća Europske grupe za transplantaciju koštane srži zabilježila su oko 800 transplantacija koštane srži pacijentima s talasemijom major. Alogena transplantacija kod talasemije u velikoj većini slučajeva provodi se od HLA-identične braće i sestara, što je povezano s teškim komplikacijama i visokom smrtnošću tijekom transplantacije materijala matičnih stanica od djelomično kompatibilnih srodnih ili kompatibilnih nesrodnih donora. Kako bi se smanjio rizik od smrtonosnih infektivnih komplikacija, pacijenti se smještaju u izolirane aseptične kutije s laminarnim protokom zraka i primaju nisko- ili abakterijsku prehranu. Za bakterijsku dekontaminaciju crijeva propisuju se neresorptivni oblici antibiotika i antifungalnih lijekova per os. Za profilaksu se amfotericin B primjenjuje intravenski. Prevencija sistemskih infekcija pojačava se amikacinom i ceftazidimom, koji se propisuju dan prije transplantacije, a liječenje se nastavlja do otpusta pacijenta. Svi krvni pripravci se prije transfuzije ozračuju dozom od 30 Gy. Parenteralna prehrana tijekom transplantacije je nužan uvjet i počinje odmah nakon ograničenja unosa hrane prirodnim putem.

Brojne komplikacije povezane su s visokom toksičnošću imunosupresivnih lijekova, koji često uzrokuju mučninu, povraćanje i mukozitis, oštećenje bubrega i intersticijsku pneumoniju. Jedna od najtežih komplikacija kemoterapije je veno-okluzivna bolest jetre, koja dovodi do smrti u ranom posttransplantacijskom razdoblju. Čimbenici rizika za trombozu vena portalnog sustava jetre uključuju dob pacijenata, prisutnost hepatitisa i fibroze jetre, kao i imunosupresivnu terapiju nakon transplantacije koštane srži. Veno-okluzivna bolest posebno je opasna kod talasemije, koju prati hemosideroza jetre, hepatitis i fibroza - česti pratitelji transfuzijske terapije. Tromboza vena portalnog sustava jetre razvija se 1-2 tjedna nakon transplantacije i karakterizira je brzi porast sadržaja bilirubina i aktivnosti transaminaza u krvi, progresija hepatomegalije, ascitesa, encefalopatije i bolova u gornjem dijelu trbuha. Histološki, obdukcijski materijal otkriva oštećenje endotela, subendotelna krvarenja, oštećenje centrilobularnih hepatocita, trombotsku opstrukciju venula i središnjih vena jetre. U bolesnika s talasemijom opisani su slučajevi smrtonosnog srčanog zastoja povezanog s toksičnim učincima citostatika.

Tijekom razdoblja prije transplantacije, ciklofosfamid i busulfan često uzrokuju toksično-hemoragični cistitis s patološkim promjenama uroepitelnih stanica. Primjena ciklosporina A u transplantaciji koštane srži često je popraćena nefro- i neurotoksičnošću, hipertenzivnim sindromom, zadržavanjem tekućine u tijelu i citolizom hepatocita. Seksualna i reproduktivna disfunkcija češće se opaža kod žena. Kod male djece pubertetski razvoj obično nije pogođen nakon transplantacije, ali kod starije djece patologija razvoja spolne sfere može biti vrlo ozbiljna - do sterilnosti. Komplikacije izravno povezane sa samom transplantacijom uključuju odbacivanje alogenih stanica koštane srži, ABO inkompatibilnost, akutne i kronične oblike bolesti presatka protiv domaćina.

U bolesnika s ABO-nekompatibilnom transplantacijom koštane srži, izoaglutinini domaćina protiv ABO donora proizvode se 330-605 dana nakon transplantacije, što može dovesti do produljene hemolize i dramatično povećati potrebu za transfuzijama krvi. Ova komplikacija se sprječava transfuzijom samo crvenih krvnih stanica tipa 0. Nakon transplantacije, neki bolesnici doživljavaju autoimunu neutropeniju, trombocitopeniju ili pancitopeniju, što zahtijeva splenektomiju za korekciju.

U 35-40% primatelja, akutna bolest presatka protiv domaćina razvija se unutar 100 dana nakon alogene HLA-identične transplantacije koštane srži. Stupanj zahvaćenosti kože, jetre i crijeva varira od osipa, proljeva i umjerene hiperbilirubinemije do deskvamacije kože, crijevne opstrukcije i akutnog zatajenja jetre. U bolesnika s talasemijom, incidencija akutne bolesti presatka protiv domaćina I. stupnja nakon transplantacije koštane srži iznosi 75%, a II. i višeg stupnja 11-53%. Kronična bolest presatka protiv domaćina kao sustavni multiorganski sindrom obično se razvija unutar 100-500 dana nakon alogene transplantacije koštane srži u 30-50% bolesnika. Zahvaćeni su koža, usna šupljina, jetra, oči, jednjak i gornji dišni putovi. Razlikuje se ograničeni oblik kronične bolesti presatka protiv domaćina, kada su zahvaćeni koža i/ili jetra, i rašireni oblik, kada su generalizirane kožne lezije kombinirane s kroničnim agresivnim hepatitisom, lezijama očiju, slinovnica ili bilo kojeg drugog organa. Smrt je često uzrokovana infektivnim komplikacijama koje su posljedica teške imunodeficijencije. Kod talasemije, blagi oblik kronične reakcije presatka protiv domaćina javlja se u 12%, umjereni oblik u 3%, a teški oblik u 0,9% primatelja alogene HLA-kompatibilne koštane srži. Teška komplikacija transplantacije koštane srži je odbacivanje presatka, koje se razvija 50-130 dana nakon operacije. Učestalost odbacivanja ovisi o režimu kondicioniranja. Konkretno, kod pacijenata s talasemijom koji su tijekom pripremnog razdoblja primali samo metotreksat, odbacivanje transplantata koštane srži uočeno je u 26% slučajeva, s kombinacijom metotreksata s ciklosporinom A - u 9% slučajeva, a s primjenom samo ciklosporina A - u 8% slučajeva (Gaziev i sur., 1995.).

Infektivne komplikacije nakon transplantacije koštane srži uzrokovane su virusima, bakterijama i gljivicama. Njihov razvoj povezan je s dubokom neutropenijom izazvanom kemoterapijskim lijekovima tijekom razdoblja kondicioniranja, oštećenjem sluznih barijera citostaticima i reakcijom presatka protiv domaćina. Ovisno o vremenu razvoja, razlikuju se tri faze infektivnih komplikacija. U prvoj fazi (razvija se u prvom mjesecu nakon transplantacije) prevladava oštećenje sluznih barijera i neutropenija, često praćene virusnim infekcijama (herpes, Epstein-Barr virus, citomegalovirus, Varicella zoster), kao i infekcijama uzrokovanim gram-pozitivnim i gram-negativnim bakterijama, gljivicama Candida, aspergilima. U ranom posttransplantacijskom razdoblju (drugi i treći mjesec nakon transplantacije) najteža infekcija je citomegalovirus, koji često dovodi do smrti pacijenata u drugoj fazi infektivnih komplikacija. Kod talasemije, citomegalovirusna infekcija nakon transplantacije koštane srži razvija se u 1,7-4,4% primatelja. Treća faza opaža se u kasnom posttransplantacijskom razdoblju (tri mjeseca nakon operacije) i karakterizira je teška kombinirana imunodeficijencija. Infekcije uzrokovane Varicella zoster, streptokokom, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae i hepatotropnim virusima česte su tijekom ovog razdoblja. Kod talasemije je smrtnost pacijenata nakon transplantacije koštane srži povezana s bakterijskom i gljivičnom sepsom, idiopatskom intersticijskom i citomegalovirusnom pneumonijom, akutnim respiratornim distres sindromom, akutnim zatajenjem srca, srčanom tamponadom, cerebralnim krvarenjem, veno-okluzivnom bolešću jetre i akutnom bolešću presatka protiv domaćina.

Trenutno su postignuti određeni uspjesi u razvoju metoda za izolaciju čistih populacija hematopoetskih matičnih stanica iz koštane srži. Tehnika za dobivanje fetalne krvi iz pupkovine je poboljšana, a stvorene su i metode za izolaciju hematopoetskih stanica iz krvi pupkovine. U znanstvenom tisku postoje izvješća da su hematopoetske matične stanice sposobne za razmnožavanje kada se uzgajaju u medijima s citokinima. Pri korištenju posebno dizajniranih bioreaktora za širenje hematopoetskih matičnih stanica, biomasa hematopoetskih matičnih stanica izoliranih iz koštane srži, periferne ili krvi pupkovine značajno se povećava. Mogućnost širenja hematopoetskih matičnih stanica važan je korak prema kliničkom razvoju transplantacije stanica.

Međutim, prije in vitro razmnožavanja hematopoetskih matičnih stanica, potrebno je izolirati homogenu populaciju hematopoetskih matičnih stanica. To se obično postiže korištenjem markera koji omogućuju selektivno označavanje hematopoetskih matičnih stanica monoklonskim antitijelima kovalentno vezanim za fluorescentnu ili magnetsku oznaku i njihovu izolaciju pomoću odgovarajućeg sortera stanica. Istovremeno, pitanje fenotipskih karakteristika hematopoetskih matičnih stanica nije konačno riješeno. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003.) smatraju stanice s CD34, AC133 i Thyl antigenima na svojoj površini i bez CD38, HLA-DR ili drugih markera diferencijacije (stanice s fenotipom CD34+Liir) kandidatima za hematopoetske matične stanice. Lineage (Lin) markeri uključuju glikoforin A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001.). Stanice s fenotipom CD34+CD45RalüW CD71low, kao i fenotipom CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low, smatraju se obećavajućim za transplantaciju.

Pitanje broja hematopoetskih matičnih stanica dovoljnog za učinkovitu transplantaciju ostaje problematično. Trenutno su izvori hematopoetskih matičnih stanica koštana srž, periferna i pupkovinasta krv te embrionalna jetra. Širenje hematopoetskih matičnih stanica postiže se njihovim uzgojem u prisutnosti endotelnih stanica i hematopoetskih faktora rasta. U različitim protokolima, mijeloproteini, SCF, eritropoetin, faktori rasta slični inzulinu, kortikosteroidi i estrogeni koriste se za induciranje proliferacije HSC-a. Kada se koriste kombinacije citokina in vitro, moguće je postići značajno povećanje HSC fonda s vrhuncem njihove proizvodnje na kraju drugog tjedna uzgoja.

Tradicionalno se transplantacija hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine uglavnom koristi za hemoblastoze. Međutim, minimalna doza hematopoetskih stanica potrebna za uspješnu transplantaciju stanica iz pupkovine iznosi 3,7 x 10 ⁷ nuklearnih stanica na 1 kg tjelesne težine primatelja. Korištenje manjeg broja hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine značajno povećava rizik od neuspjeha presatka i recidiva bolesti. Stoga se transplantacija hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine uglavnom koristi za liječenje hemoblastoza u djece.

Nažalost, još uvijek ne postoje standardi za nabavu niti standardizirani protokoli za kliničku upotrebu hematopoetskih stanica iz pupkovine. Sukladno tome, matične stanice iz pupkovine same po sebi nisu legalno priznati izvor hematopoetskih stanica za transplantaciju. Osim toga, ne postoje etičke ili pravne norme koje reguliraju aktivnosti i organizaciju banaka krvi iz pupkovine, kakve postoje u inozemstvu. U međuvremenu, radi sigurne transplantacije, svi uzorci krvi iz pupkovine moraju se pažljivo pratiti. Prije uzimanja krvi od trudnice, mora se dobiti njezin pristanak. Svaka trudnica mora se pregledati na nositeljstvo HBsAg, prisutnost antitijela na viruse hepatitisa C, HIV-a i sifilisa. Svaki uzorak krvi iz pupkovine mora se standardno testirati na broj nuklearnih stanica, CD34+ i sposobnost stvaranja kolonija. Osim toga, provodi se tipizacija HbA, određivanje krvne grupe ABO sustavom i pripadnosti Rh faktorom. Potrebni postupci testiranja su bakteriološka kultura za sterilnost, serološko testiranje na HIV-1 i HIV-2 infekcije, HBsAg, virusni hepatitis C, infekciju citomegalovirusom, HTLY-1 i HTLY-II, sifilis i toksoplazmozu. Osim toga, provodi se lančana reakcija polimeraze za otkrivanje citomegalovirusnih i HIV infekcija. Čini se preporučljivim nadopuniti protokole testiranja analizom GSC krvi iz pupkovine kako bi se otkrile genetske bolesti poput α-talasemije, anemije srpastih stanica, nedostatka adenozin deaminaze, Brutonove agamaglobulinemije, Hurlerove i Ponterove bolesti.

Sljedeća faza pripreme za transplantaciju je pitanje očuvanja hematopoetskih matičnih stanica. Najopasniji postupci za održivost stanica tijekom njihove pripreme su zamrzavanje i odmrzavanje. Prilikom zamrzavanja hematopoetskih stanica, značajan dio njih može biti uništen zbog stvaranja kristala. Za smanjenje postotka stanične smrti koriste se posebne tvari - krioprotektori. Najčešće se DMSO koristi kao krioprotektor u konačnoj koncentraciji od 10%. Međutim, DMSO u takvoj koncentraciji karakterizira izravan citotoksični učinak, koji se manifestira čak i u uvjetima minimalne izloženosti. Smanjenje citotoksičnog učinka postiže se strogim održavanjem nulte temperature načina izloženosti, kao i poštivanjem propisa za obradu materijala tijekom i nakon odmrzavanja (brzina svih manipulacija, korištenje višestrukih postupaka pranja). Ne smiju se koristiti koncentracije DMSO-a manje od 5%, jer to uzrokuje masovnu smrt hematopoetskih stanica tijekom razdoblja zamrzavanja.

Prisutnost nečistoća eritrocita u suspenzijskoj smjesi hematopoetskih matičnih stanica stvara rizik od razvoja reakcije nekompatibilnosti za eritrocitne antigene. Istodobno, kada se eritrociti uklone, gubitak hematopoetskih stanica značajno se povećava. U tom smislu predložena je metoda nefrakcionirane izolacije hematopoetskih matičnih stanica. U ovom slučaju, koristi se 10%-tna otopina DMSO-a i hlađenje konstantnom brzinom (GS/min) na -80°C za zaštitu stanica s jezgrom od štetnih učinaka niskih temperatura, nakon čega se suspenzija stanica zamrzava u tekućem dušiku. Smatra se da ova metoda krioprezervacije rezultira djelomičnom lizom eritrocita, pa uzorci krvi ne zahtijevaju frakcioniranje. Prije transplantacije, suspenzija stanica se odmrzava, ispire od slobodnog hemoglobina i DMSO-a u otopini humanog albumina ili u krvnom serumu. Očuvanje hematopoetskih prekursora korištenjem ove metode doista je veće nego nakon frakcioniranja krvi iz pupkovine, ali rizik od komplikacija transfuzije zbog transfuzije ABO-nekompatibilnih eritrocita ostaje.

Uspostava bankarskog sustava za pohranu HLA-testiranih i tipiziranih uzoraka HSC-a mogla bi riješiti gore navedene probleme. Međutim, to zahtijeva razvoj etičkih i pravnih normi, o kojima se trenutno samo raspravlja. Prije stvaranja bankarske mreže potrebno je donijeti niz propisa i dokumenata o standardizaciji postupaka prikupljanja, frakcioniranja, testiranja i tipizacije, kao i krioprezervacije HSC-a. Obvezni uvjet za učinkovito djelovanje banaka HSC-a je organizacija računalne baze za interakciju s registrima Svjetskog udruženja donora srži (WMDA) i Nacionalnog programa donora srži Sjedinjenih Američkih Država (NMDP).

Osim toga, potrebno je optimizirati i standardizirati metode in vitro ekspanzije HSC-a, prvenstveno hematopoetskih stanica iz pupkovine. Ekspanzija HSC-a iz pupkovine potrebna je za povećanje broja potencijalnih primatelja kompatibilnih s HLA sustavom. Zbog malih volumena pupkovine, broj HSC-a sadržanih u njoj obično nije u stanju osigurati repopulaciju koštane srži u odraslih pacijenata. Istovremeno, za izvođenje nesrodnih transplantacija potrebno je imati pristup dovoljnom broju tipiziranih uzoraka HSC-a (od 10 000 do 1 500 000 po primatelju).

Transplantacija hematopoetskih matičnih stanica ne uklanja komplikacije koje prate transplantaciju koštane srži. Analiza pokazuje da se kod transplantacije matičnih stanica iz pupkovine teški oblici akutne reakcije presatka protiv domaćina razvijaju kod 23% primatelja, a kronični oblici kod 25% primatelja. Kod onkohematoloških pacijenata, recidivi akutne leukemije tijekom prve godine nakon transplantacije matičnih stanica iz pupkovine opažaju se u 26% slučajeva.

Posljednjih godina intenzivno se razvijaju metode transplantacije perifernih hematopoetskih matičnih stanica. Sadržaj HSC-a u perifernoj krvi toliko je malen (1 HSC na 100 000 krvnih stanica) da njihova izolacija bez posebne pripreme nema smisla. Stoga se donoru prvo daje kura lijekovima koji stimuliraju oslobađanje hematopoetskih stanica koštane srži u krv. U tu svrhu koriste se lijekovi koji nisu bezopasni, poput ciklofosfamida i faktora stimulacije kolonija granulocita. Ali čak i nakon postupka mobilizacije HSC-a u perifernu krv, sadržaj CD34+ stanica u njemu ne prelazi 1,6%.

Za mobilizaciju hematopoetskih matičnih stanica u klinici se najčešće koristi S-SEC, koji karakterizira relativno dobra tolerancija, s izuzetkom gotovo prirodne pojave boli u kostima. Treba napomenuti da korištenje modernih separatora krvi omogućuje učinkovitu izolaciju hematopoetskih matičnih stanica. Međutim, u normalnim uvjetima hematopoeze potrebno je provesti najmanje 6 postupaka kako bi se dobio dovoljan broj hematopoetskih matičnih stanica usporedivih po kapacitetu repopulacije sa suspenzijom koštane srži. Svaki takav postupak zahtijeva obradu 10-12 litara krvi na separatoru, što može uzrokovati trombocitopeniju i leukopeniju. Postupak separacije uključuje uvođenje antikoagulansa (natrijevog citrata) donoru, što, međutim, ne isključuje kontaktnu aktivaciju trombocita tijekom ekstrakorporalnog centrifugiranja. Ovi čimbenici stvaraju uvjete za razvoj infektivnih i hemoragijskih komplikacija. Drugi nedostatak metode je značajna varijabilnost mobilizacijskog odgovora, što zahtijeva praćenje sadržaja HSC-a u perifernoj krvi donora, što je potrebno za određivanje njihove maksimalne razine.

Autogena transplantacija hematopoetskih matičnih stanica, za razliku od alogene transplantacije, potpuno eliminira razvoj reakcije odbacivanja. Međutim, značajan nedostatak autotransplantacije hematopoetskih matičnih stanica, koji ograničava raspon indikacija za njezinu provedbu, jest velika vjerojatnost ponovne infuzije leukemijskih klonskih stanica s transplantatom. Osim toga, odsutnost imunološki posredovanog učinka "graft protiv tumora" značajno povećava učestalost recidiva malignih bolesti krvi. Stoga je jedina radikalna metoda uklanjanja neoplastične klonske hematopoeze i vraćanja normalne poliklonske hematopoeze kod mijelodisplastičnih sindroma intenzivna polikemoterapija s transplantacijom alogene hematopoeze.

Ali čak i u ovom slučaju, liječenje većine hemoblastoza usmjereno je samo na povećanje vremena preživljavanja pacijenata i poboljšanje njihove kvalitete života. Prema nekoliko velikih studija, dugoročno preživljavanje bez recidiva nakon alotransplantacije HSC-a postiže se kod 40% onkohematoloških pacijenata. Pri korištenju matičnih stanica HLA-kompatibilnog brata ili sestre, najbolji rezultati uočeni su kod mladih pacijenata s kratkom anamnezom bolesti, brojem blastnih stanica do 10% i povoljnom citogenetikom. Nažalost, smrtnost povezana s postupkom alotransplantacije HSC-a kod pacijenata s mijelodisplastičnim bolestima ostaje visoka (u većini izvješća - oko 40%). Rezultati 10-godišnjeg rada Nacionalnog programa donorstva koštane srži u SAD-u (510 pacijenata, medijan dobi - 38 godina) pokazuju da je preživljavanje bez recidiva tijekom dvije godine 29% uz relativno nisku vjerojatnost recidiva (14%). Međutim, smrtnost povezana s postupkom alotransplantacije HSC-a od nesrodnog donora izuzetno je visoka i doseže 54% tijekom dvogodišnjeg razdoblja. Slični rezultati dobiveni su u europskoj studiji (118 pacijenata, medijan dobi - 24 godine, dvogodišnje preživljavanje bez recidiva - 28%, recidiv - 35%, smrtnost - 58%).

Tijekom intenzivnih kemoterapijskih tretmana s naknadnom obnovom hematopoeze alogenim hematopoetskim stanicama često se javljaju imunohematološke i transfuzijske komplikacije. One su uglavnom posljedica činjenice da se ljudske krvne grupe nasljeđuju neovisno o MHC molekulama. Stoga, čak i ako su darivatelj i primatelj kompatibilni za glavne HLA antigene, njihovi eritrociti mogu imati različite fenotipove. Razlikuje se „velika“ nekompatibilnost, kada primatelj ima prethodna antitijela na eritrocitne antigene darivatelja, i „mala“ nekompatibilnost, kada darivatelj ima antitijela na eritrocitne antigene primatelja. Mogući su slučajevi kombinacije „velike“ i „male“ nekompatibilnosti.

Rezultati komparativne analize kliničke učinkovitosti alotransplantacije hematopoetskih matičnih stanica koštane srži i pupkovine kod hemoblastoza ukazuju na to da je kod djece nakon alotransplantacije hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine značajno smanjen rizik od razvoja reakcije presatka protiv domaćina, ali se opaža dulje razdoblje oporavka broja neutrofila i trombocita s većom učestalošću smrtnosti 100 dana nakon transplantacije.

Proučavanje uzroka rane smrtnosti omogućilo je razjašnjenje kontraindikacija za alogenu transplantaciju HSC-a, među kojima su najvažnije:

• prisutnost pozitivnih testova na citomegalovirusnu infekciju kod primatelja ili darivatelja (bez preventivnog liječenja);
• akutna radijacijska bolest;
• prisutnost ili čak sumnja na prisutnost mikotičke infekcije kod pacijenta (bez provođenja sistemske rane profilakse fungicidnim lijekovima);
• hemoblastoze, kod kojih su pacijenti dugotrajno liječeni citostaticima (zbog velike vjerojatnosti iznenadnog srčanog zastoja i zatajenja više organa);
• transplantacija od HLA-neidentičnih donora (bez profilakse akutne reakcije presatka protiv domaćina ciklosporinom A);
• kronični virusni hepatitis C (zbog visokog rizika od razvoja veno-okluzivne bolesti jetre).

Dakle, transplantacija HSC-a može uzrokovati ozbiljne komplikacije, koje često dovode do smrti. U ranom (do 100 dana nakon transplantacije) razdoblju to uključuje infektivne komplikacije, akutnu bolest presatka protiv domaćina, odbacivanje presatka (neuspjeh donorskih HSC-a), veno-okluzivnu bolest jetre, kao i oštećenje tkiva uzrokovano toksičnošću režima kondicioniranja, koji je karakteriziran visokom stopom remodeliranja (koža, vaskularni endotel, crijevni epitel). Komplikacije kasnog razdoblja nakon transplantacije uključuju kroničnu bolest presatka protiv domaćina, recidive osnovne bolesti, zaostajanje u rastu kod djece, disfunkciju reproduktivnog sustava i štitnjače te oštećenje oka.

Nedavno se, u vezi s publikacijama o plastičnosti stanica koštane srži, pojavila ideja o korištenju HSC-a za liječenje srčanog udara i drugih bolesti. Iako neki pokusi na životinjama podupiru tu mogućnost, zaključke o plastičnosti stanica koštane srži potrebno je potvrditi. Ovu okolnost trebali bi uzeti u obzir oni istraživači koji vjeruju da se transplantirane ljudske stanice koštane srži lako transformiraju u stanice skeletnih mišića, miokarda ili središnjeg živčanog sustava. Hipoteza da su HSC-i prirodni stanični izvor regeneracije tih organa zahtijeva ozbiljne dokaze.

Posebno su objavljeni prvi rezultati otvorene randomizirane studije V. Belenkova (2003.). Njezin je cilj bio proučiti učinak C-SvK (tj. mobilizacije autolognih HSC u krv) na klinički, hemodinamski i neurohumoralni status pacijenata s umjerenim do teškim kroničnim zatajenjem srca, kao i procijeniti njegovu sigurnost u odnosu na standardnu terapiju (inhibitori enzima koji pretvara angiotenzin, beta-blokatori, diuretici, srčani glikozidi). U prvoj objavi rezultata studije, autori programa napominju da je jedini argument u korist O-SvK rezultati liječenja jednog pacijenta, koji je pokazao neosporno poboljšanje svih kliničkih i hemodinamskih parametara u odnosu na terapiju ovim lijekom. Međutim, teorija o mobilizaciji HSC u krvotok s naknadnom regeneracijom miokarda u zoni nakon infarkta nije potvrđena - čak ni kod pacijenta s pozitivnom kliničkom dinamikom, stresna ehokardiografija s dobutaminom nije otkrila pojavu zona održivog miokarda u području ožiljka.

Treba napomenuti da trenutno očito nema dovoljno podataka za preporuku zamjenske stanične terapije za široku primjenu u svakodnevnoj kliničkoj praksi. Potrebne su dobro osmišljene i visokokvalitetne kliničke studije kako bi se utvrdila učinkovitost različitih opcija regenerativne stanične terapije, razvile indikacije i kontraindikacije za nju, kao i smjernice za kombiniranu upotrebu regenerativno-plastične terapije i tradicionalnog kirurškog ili konzervativnog liječenja. Još uvijek nema odgovora na pitanje koja određena populacija stanica koštane srži (matične hematopoetske ili stromalne) može dati neurone i kardiomiocite, a također nije jasno koji uvjeti tome doprinose in vivo.

Rad u tim područjima provodi se u mnogim zemljama. U sažetku simpozija o akutnom zatajenju jetre Nacionalnog instituta za zdravlje SAD-a, među obećavajućim metodama liječenja, uz transplantaciju jetre, navodi se transplantacija kseno- ili alogenih hepatocita i ekstrakorporalno povezivanje bioreaktora sa stanicama jetre. Postoje izravni dokazi da samo strani funkcionalno aktivni hepatociti mogu pružiti učinkovitu potporu jetri primatelja. Za kliničku upotrebu izoliranih hepatocita potrebno je stvoriti banku stanica koja će značajno smanjiti vrijeme između izolacije stanica i njihove upotrebe. Najprihvatljivija metoda za stvaranje banke izoliranih hepatocita je krioprezervacija stanica jetre u tekućem dušiku. Pri korištenju takvih stanica u klinici kod pacijenata s akutnim i kroničnim zatajenjem jetre otkriven je prilično visok terapijski učinak.

Unatoč optimističnim i ohrabrujućim rezultatima transplantacije stanica jetre u eksperimentima i kliničkoj praksi, još uvijek postoje mnogi problemi koji su daleko od rješenja. To uključuje ograničen broj organa pogodnih za dobivanje izoliranih hepatocita, nedovoljno učinkovite metode za njihovu izolaciju, nedostatak standardiziranih metoda za očuvanje stanica jetre, nejasne ideje o mehanizmima rasta i regulacije proliferacije transplantiranih stanica, nedostatak adekvatnih metoda za procjenu usađivanja ili odbacivanja alogenih hepatocita. To također uključuje prisutnost transplantacijskog imuniteta pri korištenju alogenih i ksenogenih stanica, iako manje nego kod ortotopske transplantacije jetre, ali zahtijeva upotrebu imunosupresiva, enkapsulaciju izoliranih hepatocita ili njihov poseban tretman enzimima. Transplantacija hepatocita često dovodi do imunološkog sukoba između primatelja i donora u obliku reakcije odbacivanja, što zahtijeva upotrebu citostatika. Jedno od rješenja ovog problema može biti upotreba polimernih mikroporoznih nosača za izolaciju stanica jetre, što će poboljšati njihovo preživljavanje, budući da membrana kapsule učinkovito štiti hepatocite unatoč imunizaciji domaćina.

Međutim, kod akutnog zatajenja jetre takva transplantacija hepatocita je neučinkovita zbog relativno dugog vremena potrebnog da se stanice jetre usade u novo okruženje i dosegnu stadij optimalnog funkcioniranja. Potencijalno ograničenje je lučenje žuči tijekom ektopične transplantacije izoliranih hepatocita, a pri korištenju bioreaktora značajna fiziološka barijera je neusklađenost vrsta između ljudskih proteina i proteina koje proizvode ksenogeni hepatociti.

U literaturi postoje izvješća da lokalna transplantacija stromalnih matičnih stanica koštane srži olakšava učinkovitu korekciju koštanih defekata, a obnova koštanog tkiva u ovom slučaju odvija se intenzivnije nego kod spontane reparativne regeneracije. Nekoliko predkliničkih studija na eksperimentalnim modelima uvjerljivo pokazuje mogućnost korištenja transplantacija stromalnih stanica koštane srži u ortopediji, iako je potreban daljnji rad kako bi se optimizirale ove metode, čak i u najjednostavnijim slučajevima. Posebno, optimalni uvjeti za širenje osteogenih stromalnih stanica ex vivo još nisu pronađeni, a struktura i sastav njihovog idealnog nosača (matrice) ostaju nerazvijeni. Minimalni broj stanica potreban za volumetrijsku regeneraciju kosti nije određen.

Dokazano je da mezenhimalne matične stanice pokazuju transgermalnu plastičnost, tj. sposobnost diferencijacije u tipove stanica fenotipski nepovezane sa stanicama izvorne linije. U optimalnim uvjetima uzgoja, poliklonske linije stromalnih matičnih stanica koštane srži mogu izdržati više od 50 dioba in vitro, što omogućuje dobivanje milijardi stromalnih stanica iz 1 ml aspirata koštane srži. Međutim, populacija mezenhimalnih matičnih stanica je heterogena, što se očituje i varijabilnosti u veličinama kolonija, različitim brzinama njihovog formiranja i morfološkoj raznolikosti tipova stanica, od vretenastih stanica nalik fibroblastima do velikih ravnih stanica. Fenotipska heterogenost uočava se nakon samo 3 tjedna uzgoja stromalnih matičnih stanica: neke kolonije formiraju nodule koštanog tkiva, druge formiraju nakupine adipocita, a treće, rjeđe, formiraju otoke hrskavičnog tkiva.

Transplantacija embrionalnog živčanog tkiva u početku se koristila za liječenje degenerativnih bolesti središnjeg živčanog sustava. Posljednjih godina, umjesto embrionalnog moždanog tkiva transplantirani su stanični elementi neurosfera dobiveni iz živčanih matičnih stanica (Poltavtseva, 2001.). Neurosfere sadrže predane prekursore neurona i neuroglije, što daje nadu za obnovu izgubljenih moždanih funkcija nakon njihove transplantacije. Nakon transplantacije raspršenih stanica neurosfere u striatumsku regiju mozga štakora, uočena je njihova proliferacija i diferencijacija u dopaminergičke neurone, što je eliminiralo motoričku asimetriju kod štakora s eksperimentalnim hemiparkinsonizmom. Međutim, u nekim slučajevima, tumori su se razvili iz stanica neurosfere, što je dovelo do smrti životinja (Bjorklund, 2002.).

U klinici su pažljiva istraživanja dviju skupina pacijenata, u kojima ni pacijenti ni liječnici koji su ih promatrali nisu znali (dvostruko slijepa studija), da je jednoj skupini pacijenata transplantirano embrionalno tkivo s neuronima koji proizvode dopamin, a druga skupina pacijenata podvrgnuta je lažnoj operaciji, dala neočekivane rezultate. Pacijenti kojima je transplantirano embrionalno živčano tkivo nisu se osjećali ništa bolje od pacijenata u kontrolnoj skupini. Osim toga, 5 od 33 pacijenta razvilo je perzistentnu diskineziju 2 godine nakon transplantacije embrionalnog živčanog tkiva, što nije bilo prisutno kod pacijenata u kontrolnoj skupini (Matične stanice: znanstveni napredak i budući istraživački smjerovi. Nacionalni institut za zdravlje. SAD). Jedan od neriješenih problema kliničkog istraživanja živčanih matičnih stanica mozga ostaje analiza stvarnih izgleda i ograničenja transplantacije njihovih derivata za korekciju poremećaja središnjeg živčanog sustava. Moguće je da neuronogeneza u hipokampusu izazvana produljenom napadajnom aktivnošću, što dovodi do njegove strukturne i funkcionalne reorganizacije, može biti faktor u progresivnom razvoju epilepsije. Ovaj zaključak zaslužuje posebnu pozornost, budući da ukazuje na moguće negativne posljedice stvaranja novih neurona u zrelom mozgu i stvaranja aberantnih sinaptičkih veza pomoću njih.

Ne treba zaboraviti da uzgoj u medijima s citokinima (mitogenima) približava karakteristike matičnih stanica onima tumorskih stanica, budući da se u njima događaju slične promjene u regulaciji staničnih ciklusa, što određuje sposobnost neograničene diobe. Nepromišljeno je transplantirati rane derivate embrionalnih matičnih stanica u osobu, jer je u tom slučaju prijetnja razvoju malignih neoplazmi vrlo visoka. Mnogo je sigurnije koristiti njihovo angažiranije potomstvo, odnosno prekursorske stanice diferenciranih linija. Međutim, trenutno još nije razvijena pouzdana tehnika za dobivanje stabilnih linija ljudskih stanica koje se diferenciraju u željenom smjeru.

Korištenje tehnologija molekularne biologije za korekciju nasljedne patologije i ljudskih bolesti modificiranjem matičnih stanica od velikog je interesa za praktičnu medicinu. Značajke genoma matičnih stanica omogućuju razvoj jedinstvenih shema transplantacije za korekciju genetskih bolesti. Međutim, u ovom području postoji niz ograničenja koja je potrebno prevladati prije praktične primjene genetskog inženjeringa matičnih stanica. Prije svega, potrebno je optimizirati proces ex vivo modifikacije genoma matičnih stanica. Poznato je da dugotrajna (3-4 tjedna) proliferacija matičnih stanica smanjuje njihovu transfekciju, pa je potrebno nekoliko ciklusa transfekcije kako bi se postigla visoka razina njihove genetske modifikacije. Međutim, glavni problem povezan je s trajanjem terapijske ekspresije gena. Do sada, ni u jednoj studiji, razdoblje učinkovite ekspresije nakon transplantacije modificiranih stanica nije premašilo četiri mjeseca. U 100% slučajeva, tijekom vremena, ekspresija transficiranih gena se smanjuje zbog inaktivacije promotora i/ili smrti stanica s modificiranim genomom.

Važno pitanje je trošak korištenja staničnih tehnologija u medicini. Na primjer, procijenjena godišnja potreba za financiranje samo medicinskih troškova jedinice za transplantaciju koštane srži dizajnirane za izvođenje 50 transplantacija godišnje iznosi oko 900.000 USD.

Razvoj staničnih tehnologija u kliničkoj medicini složen je i višestupanjski proces koji uključuje konstruktivnu suradnju između multidisciplinarnih znanstvenih i kliničkih centara i međunarodne zajednice. Istovremeno, pitanja znanstvene organizacije istraživanja u području stanične terapije zahtijevaju posebnu pozornost. Najvažnija od njih su razvoj protokola kliničkih istraživanja, kontrola nad pouzdanošću kliničkih podataka, formiranje nacionalnog registra studija, integracija u međunarodne programe multicentričnih kliničkih studija i implementacija rezultata u kliničku praksu.

Zaključno s uvodom u probleme transplantacije stanica, želio bih izraziti nadu da će ujedinjenje napora vodećih ukrajinskih stručnjaka iz različitih područja znanosti osigurati značajan napredak u eksperimentalnim i kliničkim istraživanjima te će u nadolazećim godinama omogućiti pronalaženje učinkovitih načina pružanja pomoći teško bolesnim osobama kojima je potrebna transplantacija organa, tkiva i stanica.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]