Hematopoetske matične stanice

Hematopoetskih matičnih stanica (HSC) kao mezenhimalne progenitor stanica karakterizira multipotency i dovesti do stanične linije, konačnih elemenata koji čine krvnih stanica i nekih specijaliziranih stanica tkiva imunološkog sustava.

Hipoteza o postojanju zajedničkog pretka svih krvnih stanica, kao i pojam „matičnih stanica”, u vlasništvu A. Maximov (1909) Potencijal formiranje stanične mase od GSK ogroman -. Bone matičnih srži stanica proizvesti 10. Dana stanice koje čine krvna zrnca same periferne. Postojanje hematopoetskih matičnih stanica je osnovana 1961 u pokusima na oporavku hematopoiesis u miševa koji su primili smrtonosnu dozu zračenja koji uništava matičnih stanica koštane srži. Pos odnosno transplantacija sinergičkih stanica koštane srži da letalno ozračenih životinje diskretne žarišta hematopoeze su detektirane u slezeni primatelja čiji izvor - jednostruke klonogene ishodišnih stanica.

Zatim je dokazana sposobnost hematopoetskih matičnih stanica na samo-potporu, što daje funkciju hematopoeze tijekom ontogeneze. U procesu embrionalnog razvoja, HSC je karakteriziran visokom migracijskom aktivnošću koja je neophodna za njihovu migraciju na mjesta hematopoetskih organa. Ova svojstva HSC-a zadržana su i kod ontogeneze - zbog njihove konstantne migracije odvija se trajna obnova bazena imunokompetentnih stanica. Sposobnost migracije GSK, penetracija kroz krvno-tkiva, implantacija rasta tkiva i klonogenskog daje osnovu za stanice transplantacije koštane srži u nizu bolesti povezanih s poremećajima hemopoetskog sustava.

Poput svih stanica resursa matičnih, hematopoetskih matičnih stanica su prisutni u vašem niša (koštane srži) u vrlo malim količinama, što dovodi do određenih poteškoća u njihovoj raspodjeli. Immunophenotypic ljudski HSC karakterizirani su CD34 + NK stanica sposobnih za migraciju u krvotok i kolonizirati organi imunološkog sustava ili repopulate stromi koštane srži. Potrebno je jasno razumjeti da GSK nije najviše nezrele stanice koštane srži, te su izvedeni iz prekursora, koji uključuju dormantnye fibroblasta SB34-negativnih stanica. Utvrđeno je da su stanice s fenotipu CD34 su mogli ući u krvotok, gdje se promijene fenotip u CD34 +, ali je povratna migracija u koštanoj srži pod utjecajem mikrookoliša ponovno postati matičnih stanica elementi CD34-negativne. U mirovanju, CD34 stanice ne reagiraju na paranormalne regulacijske signale stroma (čimbenici rasta, citokini). Međutim, u situacijama koje zahtijevaju intenziteta pojačanje hematopoetskih matičnih stanica s fenotipska CD34 odgovoriti na diferencijacija signali s obje hematopoetskih i mezenhimalne ishodišnih stanica. Hematopoeze se provodi izravnim kontaktom s GSK staničnim elementima strome koštane srži predstavila složene mreže makrofagi, endotelne stanice retikularni, osteoblasta, strome fibroblaste i ekstracelularnog matriksa. Koštana srž strome okvir - ne samo matrica ili „kostur” za hematopoetskih tkiva, nosi finu regulaciju hematopoeze zbog parakrinih regulatornih signala faktora rasta, citokina i kemokina, te također pruža adhezivne interakcije potrebnih za formiranje krvnih stanica.

Dakle, temelj kontinuirano ažurirani krvotvornog sustava leži pluripotentne (sa stajališta hematopoeze) hematopoetskih matičnih stanica sposobnih za dugoročnu samo-obnavljanja. Tijekom procesa počinjenja, HSC podliježu primarnoj diferencijaciji i formiraju klonove stanica koje se razlikuju u njihovim citomorfološkim i imunofenotipskim karakteristikama. Uzastopna formacija primitivnih i počinjenih progenitorskih stanica dovršena je stvaranjem morfološki prepoznatljivih stanica predaka različitih hematopoetskih linija. Rezultat naknadne stupnjeve kompleksa višestupanjskom postupku je sazrijevanje hematopoetskih stanica i iskorištenju zrele za periferne krvi dobivenih elemenata - eritrocitima, leukocitima i trombocitima limfocita.

[1], [2], [3],

Izvori hematopoetskih matičnih stanica

Hematopoetskih matičnih stanica smatraju najviše proučavani izvor matičnih, koja je u velikoj mjeri zbog njihove upotrebe u klinici za transplantaciju koštane srži. Na prvi pogled, mnogo je poznato o tim stanicama. U određenoj mjeri to je istina, jer su srednje i zrele potomci GSK - najpristupačniji stanični elementi, od kojih je svaki (eritrociti, leukociti, limfociti, monociti / makrofagi i trombociti) temeljito proučavali na svim razinama - od svjetlosti elektronska mikroskopija, od biokemijskih i imunofenotipskih obilježja prije prepoznavanja pomoću PCR analize. Međutim, praćenje provodi morfološkim, ultrastrukturne, biokemijske, immunophenotypic i biofizičkih parametara genomske GSK nije dala odgovore na mnoga problematična pitanja, nužno je za razvoj transplantacije stanica rješenje koje. Još uvijek nije uspostavljen stabilizacijske mehanizme GSK u uspavanom stanju, oni se aktiviraju, ući u fazu u simetričnih ili asimetričnih podjele, i što je najvažnije - opredjeljenje za obrazovanje kao funkcionalno različitih krvnih stanica, eritrocita, leukocita, limfocita i trombocita.

Prisutnost u stanicama koštane srži s fenotipa CD34, koje su preci i mezenhimalnih i hematopoetskih matičnih stanica je postavlja pitanje postojanja najranijeg blizu CD34-negativnih stanica u progenitorskoj staničnom diferencijacijom i krvotvornog strome linije. Produžena metoda kultiviranja dobivena je tzv dugoročne kulture „iniciranje stanice (dugotrajno kulture-pokretanje stanice - LTC-IC). Vijek takvih prekurzorskih stanica za formiranje kolonija aktivnost strome koštane srži, na temelju kombinacije faktora rasta je više od 5 tjedana, dok je vijabilnost predanih jedinica koje tvore kolonije (CFU) u kulturi samo 3 tjedna. Trenutno se vjeruje da LTC-IC - funkcionalni analog GCW kao repopulyatsionnom na visokom potencijalu od oko 20% LTC-IC karakterizira fenotipa CD34 + CD38- i pokazuju visoku sposobnost samo-obnavljanja. Takve stanice se nalaze u ljudskom koštane srži s frekvencijom od 1:50 000. Međutim, to treba priznati limfoidoinitsiiruyuschie-mijeloidne stanice najbliže HSC koji su dobiveni u uvjetima dugoročno (15 tjedana) kulture. Takve stanice su označeni kao LTC među stanicama ljudske koštane srži se nalaze u 10 puta manje od LTC-IC i oblikovan kao mijeloidne stanične linije i limfoidne hemopoetskog stabljike.

Iako hematopoetskih matičnih stanica obilježavanje monoklonskih protutijela, a zatim određivanjem immunophenotypic je glavni način za identificiranje i selektivno sortiranje hematopoetskih matičnih stanica uz kliničku upotrebu posvećena GSK time ograničen. Blokiranje receptora CD34 antitijela ili druge markere za sortiranje antigene imunopozitivno neizbježno mijenja svojstva stanica izoliranih s njim. Više je poželjno imuno-negativno izlučivanje HSC na magnetskim stupovima. Međutim, u ovom slučaju, razvrstavanje obično koristi monoklonska protutijela, fiksna na metalni. Također, što je najvažnije, i način dodjele GSK temelju fenotipske, nego funkcionalnim karakteristikama. Dakle, mnogi istraživači radije koristiti analizu Kolonogcni parametrima GSK, što omogućuje veličinu i sastav kolonija odrediti stupanj zrelosti i smjeru diferencijacije ishodišne stanice. Poznato je da u procesu izvršenja broj stanica i broj vrsta u kolonijama se smanjuje. Hematopoetskih matičnih stanica i njena kćer stanica ranije, pod nazivom „granulocita eritrocita monocita-megakariotsitokolonieobrazuyuschaya jedinica” (SFU-GEMM), stvoriti kulturu multilinearne velike kolonije koje sadrže, odnosno, granulociti, eritrociti, monocite i megakariocita. Se nalazi ispod linije granulocita loza obveza monotsitokolonieobrazuyuschaya jedinice (SFU-GM) stvara kolonija granulocita i makrofaga, te granulocitne jedinica koloniziranja (SFU-G) - samo male kolonija granulocita zrele. Rano eritrocita prethodnik - burstoobrazuyuschaya jedinica crvenih krvnih stanica (SFU-E) - je izvor velike i zrele crvenih krvnih stanica kolonija jedinicu za oblikovanje (SFU-E) - male crvenih krvnih stanica kolonija. U općoj populaciji, s rastom stanica u mediju polukrutih mogu identificirati stanice koje čine šest vrsta mijeloidne kolonija: SFU-GEMM, GM-SFU, SFU-G, M-SFU, VFU-E i E-SFU).

Međutim, osim hematopoetskih derivata, svaki izvorni materijal za odvajanje HSC sadrži značajan broj popratnih stanica. S tim u vezi potrebno je prethodno pročišćavanje presađivanja prije svega aktivnih stanica imunosnog sustava donatora. Obično se za ovu immunoselection temelji na ekspresiju antigena iz limfocita, što im omogućuje da se izolirati i ukloniti pomoću monoklonskih antitijela. Osim toga, tehnika transplantacija immunorozetochnaya T-limfocit potrošen koštane srži, koji se temelji na formiranje kompleksa CD4 + limfocita i specifičnih monoklonskih antitijela učinkovito ukloniti koristeći aferezu. Ova tehnika osigurava pročišćeni materijal stanica sa 40-60% hematopoetskih matičnih stanica.

Povećava broj progenitorskih stanica zbog uklanjanja zrelih krvnih stanica iz leukafereza proizvoda postiže protustruji centrifugiranjem, praćeno filtracijom (u prisutnosti kelatoru - Na-citrata) kroz kolonu koja sadrži od najlonskih vlakana obložene ljudskog imunoglobulina. Uzastopna uporaba ove dvije tehnike pruža potpunu čišćenje mladica od pločica za 89% - od eritrocita i za 91% - od leukocita. Zbog značajnog smanjenja gubitaka HSC, razina CD34 + stanica u ukupnoj masi stanica može se povećati na 50%.

Za funkcionalne karakteristike izoliranih hematopoetskih matičnih stanica koristi se njihova sposobnost stvaranja kolonija zrelih krvnih elemenata u kulturi. Analiza nastalih kolonija omogućuje identifikaciju i kvantificiranje tipova progenitornih stanica, stupanj njihovog počinjenja i utvrđivanje smjera njihove diferencijacije. Kolonija klonogenih aktivnost se određuje u polukrutom mediju, metilceluloza, agar, plazma ili fibrinskih gelovi, stanične migracije aktivnost smanjenja, sprečavanje njihovog vezanje na površinu stakla ili plastike. Pod optimalnim uvjetima kulture, klonovi iz jedne stanice razvijaju se u roku od 7-18 dana. Ako u klonu ima manje od 50 stanica, identificira se kao pojedinačni skup, ako broj stanica prelazi 50 - kao koloniju. Uzima se u obzir broj stanica sposobnih za stvaranje kolonije (jedinice koje stvaraju kolonije - CFU ili stanice koje stvaraju kolonije - COC). Treba naglasiti da su parametri i CFU COC ne odgovaraju broju HSC u staničnu suspenziju, iako je opet korelira s naglašava potrebu za identifikaciju funkcionalan (koje oblikuju kolonije) aktivnost HSC in vitro.

Među stanicama koštane srži, hematopoetske matične stanice imaju najveći proliferativni potencijal, zbog čega se najveće kolonije formiraju u kulturi. Prema broju takvih kolonija, predlaže se indirektno odrediti broj matičnih stanica. Nakon formiranja kolonija in vitro do 0,5 mm, a s brojem stanica koje 1000, autori su testirani na stabilnost tih stanica da subletalnog doze 5-fluorouracila i ispitane na njihovu sposobnost za ponovo napučivanje koštane srži letalno ozračenih životinja. Za ove parametre izolirane stanice gotovo ne razlikuje od GSK i primljenih skraćeni simbol HE-CFC stanica - kolonije s visokim proliferativni potencijal.

I dalje se traži mogućnost kvalitetnijeg izbora hematopoetskih matičnih stanica. Međutim, hematopoetskih matičnih stanica su morfološki slične limfocita i relativno ujednačene skup stanica s gotovo okruglim jezgrama, kromatina i čestica slabobazofilnoy male količine citoplazmi. Točan broj je također teško odrediti. Pretpostavlja se da GSK u koštanoj srži neke osobe javlja sa frekvencijom od 1 po 106 stanica koje sadrže nukleus.

Identifikacija hematopoetskih matičnih stanica

Poboljšati identifikaciju hematopoetskih matičnih stanica se vrši uzastopno ili istovremeno (u višekanalnom sorbitana tere) istraživanja membrannosvyazannyh spektar antigena, u kojoj GSK fenotip CD34 + CD38 treba kombinaciji s nedostatkom diferencijacije oznakama linearno, posebno antigena imunokompetentnih stanica, kao što su CD4, i površinskih imunoglobulina glycophorin.

Praktično sve sheme fenotipizacije hematopoetskih matičnih stanica uključuju određivanje CD34 antigena. To glikoprotein molekulske mase od oko 110 kDa, koji nose više mjesta glikozilacije izražen na plazma stanične membrane nakon aktiviranja gena lokaliziran na kromosomu 1. Funkcija molekule CD34 povezana je s L-selektinom posredovanom interakcijom ranih hematopoetskih prekursorskih stanica sa stromalnom bazom koštane srži. Međutim, treba imati na umu da je prisutnost CD34 antigena na površini stanice dopušta samo izvršiti preliminarnu procjenu sadržaja GSK u staničnu suspenziju, kao što je izraženo i druge hematopoetske ishodišne stanice i stromalne stanice koštane moždine i endotelne stanice.

Tijekom diferencijacije hematopoetskih progenitorskih stanica, CD34 ekspresija trajno se smanjuje. Erythrocyte, granulocitne i monocitne zaražene progenitorske stanice slabo eksprimiraju CD34 antigen, ili uopće nisu prisutne na njihovoj površini (fenotip CD34). Na površinskoj membrani diferenciranih stanica koštane srži i zrelih krvnih stanica, CD34 antigen nije detektiran.

Treba naglasiti da su u dinamiku diferencijaciju hematopoetskih ishodišnih stanica ne samo da smanjuje razinu ekspresije CD34, a paralelno postupno povećana ekspresija CD38 antigena - integralni membranski glikoprotein molekulske težine od 46 kDa koji NAD-glikogidrolaznoy i ciklaze ADP-ribozil, sugerirajući njegov uključenost u transportu i sintezi ADP-riboze. Stoga postoji mogućnost dvostruke kontrole stupnja počinjenja hematopoetskih progenitorskih stanica. Populacija stanica s fenotipom CD34 + CD38 +, od 90 do 99% stanica koštane srži CD34-pozitivnih sadrži prekurzorskih stanica s ograničenom proliferativni potencijal i diferencijacije, a sa CD34 + CD38 fenotip stanicama može tvrditi ulogu GSK.

Doista, populacija stanica koštane srži, što je opisano u formuli CD34 + CD38- sadrži relativno velik broj primitivnih matičnih stanica sposobne diferencirati se u mijeloidne i limfoidne linije. U kontekstu dugoročnog uzgoja s fenotipa CD34 + CD38- stanice uspijevaju dobiti sve zrele krvne stanice: neutrofili, eozinofili, bazofili, monociti, megakariocita, eritrocite i limfocite.

Relativno nedavno otkrili da CD34-pozitivne stanice izražavaju još dva marker - AC133 i CD90 (Thy-1), koji se također koristi za identifikaciju hematopoetskih matičnih stanica. Thy-1 antigena koekspresiji s receptorom CD117 (c-kit) na CD34 + stanicama koštane srži, moždini i periferne krvi. To fosfatidilinozitolsvyazyvayuschy površinski glikoprotein molekulske težine 25-35 kDa koji sudjeluje u procesima stanične adhezije. Neki autori vjeruju da je Thy-1 antigen marker najnaseljenijih CD34-pozitivnih stanica. Repliciranje stanica s fenotipa CD34 + Thy-1 + dovesti do dugoročnih kultiviranih linije u obliku stanica kćeri. Pretpostavlja se da blokovima Thy-1 antigena regulatorni signali koji uzrokuju podjele stanica stanica. Unatoč činjenici da su CD34 + Tu1 + stanica su sposobni samo-obnavljanja i stvaranja dugoročnih kulturan linije, njihov fenotip ne može odnositi isključivo na HSC, kao Thy-1 + sadržaja u ukupnoj masi stanica elemenata CD34-pozitivnih je oko 50%, što je daleko iznad vrijednosti broj hematopoetskih stanica.

Više obećavajuće za identifikaciju hematopoetskih matičnih stanica je AC133, marker antigena hematopoetskih progenitorskih stanica, čija je ekspresija prvi put otkrivena na embrionalnim jetrenim stanicama. AC133 je transmembranski glikoprotein koji se pojavljuje na površini stanične membrane u najranijim stadijima sazrijevanja GSK - moguće je čak i ranije od antigena CD34. U istraživanjima A. Petrenka i V. Grishchenko (2003), otkriveno je da AC133 izražava do 30% CD34 pozitivnih stanica embrionalne jetre.

Dakle, idealno fenotipske profil krvotvornih matičnih stanica koje danas koncepata, zbroj stanica crtama, u krugovima koji mora biti prisutan CD34 antigena konfiguraciju, AC133 i Thy-1, ali tu nema mjesta za molekularnu projekcije CD38, HLA-DR i markeri linearni diferencijacija GPA , CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

GSK fenotipske varijacije portret može biti kombinacija CD34 + CD45RalowCD71low jer svojstva stanica opisanih ovim formula se ne razlikuju od funkcionalnih parametara stanica s fenotipom CD34 + CD38. Osim toga, ljudska HSC se može identificirati fenotipske znakovi CD34 + Thy + l-CD38Iow / „c-kit / low - samo 30 od tih stanica potpuno vraćanje hematopoiezisa u letalno ozračenih miševa.

Iz analize općih fenotipskih karakteristika stanica koštane srži zapravo počeo 40 godina intenzivnog istraživanja GSK istovremeno sposoban za oba self-obnovu i diferencijacije od drugih staničnih elemenata, čime bi opravdao korištenje transplantacije koštane srži u liječenju raznih patoloških stanja hemopoetskog sustava. Nedavno otkrivene nove vrste matičnih stanica još nisu u širokoj uporabi u kliničkoj praksi. Međutim, matične stanice iz pupkovine (kabel) krvi i jetri fetusa može značajno proširiti transplantacije stanica ne samo u hematologije, ali iu drugim područjima medicine, kao i različite od HSC koštane srži kao kvantitativne uspješnosti i kvalitete obilježja.

Volumen masne hematopoetske stanične matične stanice potreban za transplantaciju obično se dobiva iz koštane srži, periferne i moždane krvi, te također iz embrionalne jetre. Osim toga, hematopoetske ishodišne stanice se mogu dobiti in vitro razmnožavanja ESC i njihovo naknadno diferencijacije hematopoetskih u ciljane stanice sastavnice. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) s pravom ističu signifikantnu različitost imunološka svojstva i sposobnost za vraćanje hematopoezu GSK različitog podrijetla, zbog nejednakog odnosa sadržane u njihovim izvorima pluripotentne rano i kasnije počinjene preteča. Osim toga, hematopoetske matične stanice izvedene iz različitih izvora stabljika imaju sasvim različite asocijacije nehemopoetskih stanica kvantitativno i kvalitativno.

Tradicionalni izvor hematopoetskih matičnih stanica je koštana srž. Suspenzija stanica koštane srži se dobiva iz abdominalne kosti ili sternuma ispiranjem pod lokalnom anestezijom. Ovako dobivena suspenzija je heterogena i sadrži mješavinu HSC, stromalnih elemenata stanice, počinjenih progenitorskih stanica mijeloičnih i limfoidnih linija, kao i zrelih krvnih elemenata. Broj stanica s fenotipovima CD34 + i CD34 + CD38 među mononuklearnim stanicama koštane srži iznosi 0,5 do 3,6 i 0 do 0,5%. Periferna krv nakon G-CSF-inducirane mobilizacije HSC sadrži 0,4-1,6% CD34 + i 0-0,4% CD34 + CD38.

Veći postotak stanica sa CD34 + CD38 i CD34 + imunofenotipa krvi pupčane vrpce i 0-0.6 - OD-2,6%, a njihov maksimalni broj detektira kod hematopoetskih stanica jetre fetusa - 2,3 i 0,2-12,5 -35,8%.

Međutim, kakvoća presatka materijala ne ovisi samo o količini koji se u njoj CD34 + stanica, a također i na njihove funkcionalne aktivnosti, što se može procijeniti prema stupnju formiranja kolonija in vivo (repopulaciju koštane srži u letalno ozračenih životinja) i in vitro - rasta kolonija na polukruti medija , Pronađeno je da su koloniziranja i proliferativnu aktivnost hematopoetskih progenitorskih stanica u fenotip CD34 + CD38 HLA-DR, izoliranog iz fetalne jetre, fetalnog koštane srži i krvi pupčane vrpce, i uvelike premašuje proliferativnog kapaciteta hematopoetskih stanica koštane srži i periferne krvi odraslih koje tvore kolonije. Kvantitativnu i kvalitativnu analizu GSK različitog podrijetla utvrđene su značajne razlike njihovog relativnog sadržaja u staničnu suspenziju, te funkcionalnosti. Maksimalni broj CD34 + stanica (24.6%), opažene u presađenim materijala dobivenih iz koštane srži fetusa. Koštana srž odraslog čovjeka sadrži 2,1% CD34-pozitivnih staničnih elemenata. Među mononuklearnih stanica periferne krvi humanog odraslog samo 0,5% imaju fenotip CD34 +, a kabel krvi njihova količina dosegne 2%. Tako koloniziranja sposobnost CD34 + stanice fetalne koštane srži za 2,7 puta prelazi kapacitet klonalne rast hematopoetskih koštanoj srži odraslih humanih stanica i kabel krvnih stanica oblik značajno veće kolonije od hematopoetskih elemenata izoliranih iz periferne krvi odraslih: 65,5 do 40 i , 8 kolonija / 105 stanica, respektivno.

Razlike u proliferativne aktivnosti i sposobnosti hematopoetskih matičnih stanica koje formiraju kolonije su povezane ne samo s različitim stupnjevima zrelosti, ali i njihove prirodne okoline. Poznato je da je intenzitet proliferacije i diferencijacije matičnih stanica brzinu određuje integralnog regulatornog utjecaja više komponenata sustava faktora rasta i citokina koje luče i matičnih stanica i staničnih elemenata matrice-stroma okoline. Korištenje pročišćenih staničnih populacija i bez seruma, s obzirom na staničnu kulturu koja daje karakterizirane faktora rasta koji imaju stimulirajuće i inhibitorni učinak na matičnim stanicama različitih razina, prekurzorskih stanica i stanica predanih u određenom linearnom smjeru. Rezultati ovih istraživanja pokazuju da HSC izvedeni iz izvora s različitim razinama ontogenetskom razvoja, razlikuju se i fenotipski i funkcionalno. Za GSK, boraveći u ranijim fazama posebnom pažnjom, karakterizira visok potencijal samostalnog razmnožavanja i visoke proliferativna aktivnost. Ove stanice su duljine telomera i proći loza opredjeljenje s formiranje hematopoetskih staničnih linija. Reakcija imunološkog sustava na HSC embrionalno porijeklo je odgođena, budući da takve stanice blago eksprimiraju HLA molekule. Postoji jasna gradacija relativnog sadržaja HSC i njihovu sposobnost da se obnovile i broj linija čine vrste predanosti: CD34 + stanica u jetri fetusa> CD34 + stanica krvi iz pupkovine> CD34 + stanica u koštanoj srži. Važno je da takve razlike nisu jedinstveni na unutarnje i neo postanatalnomu rano razdoblje ljudskog razvoja, ali i kroz posebnom pažnjom - proliferativni i koloniziranja aktivnost HSC izvedeni iz koštane srži ili periferne krvi odrasle osobe, obrnuto proporcionalno dobi od donatora.