Dijagnoza herpesa

Dijagnoza herpesa temelji se na klasičnoj izolaciji virusa na osjetljivim staničnim kulturama, imunofluorescentnim i serološkim metodama, kolposkopskom pregledu te korištenju modernih molekularno-bioloških metoda (PCR, dot hibridizacija), što omogućuje dijagnosticiranje cijele skupine herpes virusa, uključujući tipove HHV-6 i HHV-7.

Laboratorijske dijagnostičke metode za herpes infekciju

Glavne metode usmjerene na izolaciju HSV-a ili detekciju virusnih čestica i/ili njihovih komponenti	Pomoćne metode usmjerene na otkrivanje antitijela na HSV u biološkim tekućinama ljudskog tijela
Izolacija HSV-a u osjetljivim staničnim i životinjskim kulturama Izravna i imunološka elektronska mikroskopija Izravne i neizravne varijante IPA-e IFA Molekularno biološke metode Reakcija aglutinacije lateksa	Reakcija neutralizacije RSC Određivanje antitijela na nestrukturne proteine HSV-1,2

Pokazalo se da je u 76% pacijenata genitalni herpes (GH) uzrokovan HSV-2, a u 24% HSV-1 tipom. Štoviše, GH kao monoinfekcija javio se samo u 22% pacijenata, dok su u 78% slučajeva otkrivene mikrobne asocijacije. U 46% pojedinaca otkrivena je parazitocenoza uzrokovana dvama patogenima, uključujući klamidiju koja je otkrivena u 40% slučajeva. Gardnerella, Trichomonas i gonokoki rjeđe su otkriveni u razmazima.

U 27% pacijenata parazitocenoza je bila predstavljena s tri patogena, u 5,2% s četiri patogena. Štoviše, najčešće je uočena kombinacija klamidije s gardnerelom i gljivicama Candida. Ovi podaci potkrepljuju potrebu za temeljitim bakteriološkim pregledom pacijenata s GH kako bi se identificirale kombinacije patogenih uzročnika, kao i dubinsko proučavanje patogeneze miješanih infekcija urogenitalnog trakta, što će omogućiti diferenciranu kompleksnu terapiju herpes infekcije.

Materijali proučavani za izolaciju HSV-a ovisno o lokalizaciji herpetičnih lezija

Lokalizacija lezija	Sadržaj vezikula	Struganje stanica				Likvor	Bronhijalni aspirat	Biopsija	Krv
		1	2	3	4
Koža	+								+
Oči			+						+
Genitalije				+					+
Anus	+				+				+
Usta	+	+							+
CNS	+					+		+	+
Pluća		+					+		+
Jetra								+	+
Kongenitalni herpes	+	+	+				+		+

Metode laboratorijske dijagnostike citomegalovirusne infekcije

Metode	Vrijeme potrebno za dobivanje rezultata	Bilješke
VIROLOŠKI
Elektronska mikroskopija	3 sata	Nije baš pristupačno
Izolacija virusa u staničnoj kulturi (VCI)	4-20 dana	Standardno, Sporo
Imunofluorescentno bojenje rane AG pomoću monoklonskih antitijela	6 sati	Manje specifično
CITOLOŠKI	2-3 sata	Manje specifično
SEROLOŠKI
RSC	2 dana	Standard
RGA	1 dan	Radno intenzivno
GREBEN	6 sati	Jednostavno, specifično
NRIF	6 sati	Teško
RIMP	6 sati	Teško
ELISA (IgM, DO)	6 sati	Brzo, jednostavno
Imunoblot	6 sati	Skup
MOLEKULARNO BIOLOŠKI
MG	5-7 dana	Skupo, radno intenzivno
PCR	3 sata	Skup

Metode dijagnostike virusa herpes zoster

Dijagnostičke metode	Laboratorijske tehnike
NEIZRAVNO
Izbor	Kultura tkiva, pileći embriji, laboratorijske životinje, kokultura s permisivnim stanicama ili pomoćnim virusima
Identifikacija izolata	Reakcija neutralizacije, RSC, IF, PIEF, reakcija precipitacije izolata, aglutinacija, IF
IZRAVNO
Citologija	Razmazi: imunofluorescencija u boji
Histologija	Patomorfologija stanice
Struktura	Embrionalna mikroskopija, imunoelektronska mikroskopija
Određivanje antigena	IF, PIEF, RIM, IFA
Određivanje lokalne proizvodnje antitijela	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Molekularno biološki pristupi	Molekularna hibridizacija, PCR

Laboratorijska dijagnostika infekcije uzrokovane virusom herpes zoster

Dijagnostički problemi	Metode	Očekivani rezultati
Akutna primarna infekcija	1	Detekcija za 2 sata
	2	Razina antitijela polako raste
	3	Pojavljuju se 3 dana nakon infekcije
Akutna reaktivirana infekcija	1	Detekcija UUU nakon 2 sata
	2	Razina antitijela polako raste
	4	Pojavljuju se 4 dana nakon pojave osipa

1. određivanje vezikula VEGF-a u tekućini;
2. serologija: CSC, ELISA, usmjerena na detekciju
3. serologija: ELISA usmjerena na detekciju IgM;
4. serologija: ELISA usmjerena na detekciju IgA, IgM.

Metode za određivanje imunološkog odgovora na infekciju virusom herpes zostera

Pristup	Metoda
Detekcija povećanja titra antitijela u drugom serumu	RSK, RTGA, RPGA, IF reakcija neutralizacije, RIM, ELISA
Detekcija specifičnih antitijela Ig G i Ig A klase u prvom uzorku seruma	ELISA, IF, RIM, lateks aglutinacija

Interpretacija rezultata serološkog pregleda seruma pacijenata na herpesvirusne infekcije (ELISA)

Naziv infekcije/markera	Prosječne granične vrijednosti za infekcije
	Rezultati analize	Tumačenje
Citomegalija Anti-CMV IgG (1-20 U/ml) Anti-CMV IgM (100-300%)	Pozitivno 1-6 Pozitivno 6-10 Pozitivno >10 Negativno Pozitivno 100-300 Negativno <90 Sumnjivo 90-100	Remisija Pogoršanje bolesti Akutna faza bolesti Nema infekcije (bolesti) Akutna faza bolesti Ponovite analizu za 2-3 tjedna
Herpes simplex 1,2 serotipa Anti-HSV 1/2 ukupno (100-900%)	Pozitivno 100-400 Pozitivno 400-800 Pozitivno >800 Negativno <100	Remisija Pogoršanje bolesti Akutna faza bolesti Nema infekcije (bolesti)

Tablica prikazuje glavne metode laboratorijske dijagnostike herpesvirusnih infekcija, kao i preporučene biološke materijale koji se ispituju pri izolaciji HSV-a, uzimajući u obzir lokalizaciju herpetičnih lezija.

Pouzdana izolacija virusa herpes simplexa i CMV-a infekcijom osjetljivih staničnih kultura. Tako je tijekom virološkog pregleda 26 pacijenata tijekom razdoblja relapsa, HSV izoliran na osjetljivoj Vero staničnoj kulturi u 23 slučaja (88,4%). Zaražene kulture pokazale su sliku citopatnog djelovanja tipičnog za HSV - stvaranje višejezgrenih divovskih stanica ili nakupljanje zaobljenih i uvećanih stanica u obliku nakupina. U 52,1% slučajeva, žarišta citopatnog djelovanja virusa mogla su se otkriti već 16-24 sata nakon infekcije. Do 48-72 sata inkubacije zaraženih kultura, postotak materijala koji uzrokuju specifično uništavanje stanica povećao se na 87%. A samo u 13% slučajeva pozitivni rezultati otkriveni su 96 sati nakon infekcije ili više ili tijekom ponovljenog pasažiranja.

Metode laboratorijske dijagnostike generalizirane herpes infekcije

Glavne metode usmjerene na otkrivanje (izolaciju) herpes virusa, njihovih čestica i njihovih komponenti

Pomoćne metode usmjerene na otkrivanje antitijela na herpes viruse u biološkim tekućinama, otkrivanje enzimskih promjena u krvnom serumu

Izolacija herpes virusa na osjetljivim staničnim i životinjskim kulturama Izravna i imunološka elektronska mikroskopija Izravne i neizravne varijante imunoperoksidazne metode Izravne i neizravne varijante metode fluorescentnih antitijela Varijante enzimskog imunološkog testa na čvrstoj fazi Varijante metode molekularne (DNA-DNA) hibridizacije Lančana reakcija polimeraze Reakcija lateks aglutinacije

Test neutralizacije Test fiksacije komplementa Test lateks aglutinacije Neizravna verzija metode fluorescentnih antitijela Neizravna verzija metode imunoperoksidaze Varijante enzimskog imunološkog testa na čvrstoj fazi Metoda imunološkog blottinga Metoda radijalne fiksacije komplementa Određivanje razina alanina i aspartat aminotransferaze

Serološke metode se koriste za dijagnosticiranje infektivne mononukleoze (infekcije uzrokovane EBV-om). Paul-Bunnellova reakcija s ovčjim eritrocitima, dijagnostički titar od 1:28 ili veći u jednom testu krvnog seruma ili 4 puta veće antitijela pri ispitivanju parnih seruma. Koristi se Hoff-Bauerova reakcija s 4%-tnom suspenzijom formaliniziranih konjskih eritrocita. Rezultat se uzima u obzir nakon 2 minute; kod infektivne mononukleoze reakcija je vrlo specifična.

Trenutno se razvija metoda enzimskog imunološkog testa (EIA) za dijagnosticiranje infektivne mononukleoze. U ovom slučaju, IgG i IgM antitijela u serumu pacijenta određuju se inkubacijom s limfoblastima zaraženim EBV-om, nakon čega slijedi tretman fluorescentnim antitijelima. U akutnom razdoblju bolesti, antitijela na virusni kapsidni antigen određuju se u titru 1:160 i više.

Pri korištenju brojnih uvezenih komercijalnih testnih sustava, ELISA testom se mogu otkriti: antitijela na omotačka antitijela EBV-a, antitijela na rani antigen EBV-a, ukupna antitijela na rani antigen EBV-a, određena u akutnoj fazi bolesti i u jezgri i u citoplazmi stanice, te ograničena antitijela na rani EBV, određena u akutnoj fazi bolesti i u jezgri i u citoplazmi stanice, ograničena antitijela na rani antigen EBV-a, određena na vrhuncu bolesti samo u citoplazmi stanice, te antitijela na nuklearni antigen EBV-a. Korištenje ovih testnih sustava omogućuje diferencijalnu dijagnostiku niza bolesti povezanih s EBV-om.

Nakon pozitivnog ELISA testa koji otkriva antitijela na EBV, provodi se potvrdna imunobloting reakcija kojom se utvrđuje prisutnost antitijela na pojedinačne EBV markerske proteine (p-proteine): p23, p54, p72 (prisutnost ovog proteina ukazuje na mogućnost reprodukcije EBV-a), p 138. Gore navedene laboratorijske metode koriste se i za praćenje učinkovitosti liječenja.

Osjetljivost viroloških metoda je 85-100%, specifičnost je 100%, vrijeme istraživanja je 2-5 dana. U praktičnom radu često se koristi metoda direktne imunofluorescencije (DIF) s poliklonskim ili monoklonskim antitijelima protiv HSV-1 i HSV-2. DIF metoda se prilično lako reproducibilno izvodi u redovnom kliničkom laboratoriju, nije skupa, osjetljivost je iznad 80%, specifičnost je 90-95%. Imunofluorescentnom mikroskopijom otkrivena je prisutnost citoplazmatskih inkluzija, morfološke značajke, postotak zaraženih stanica u razmazima-strugotinama iz uretre, cervikalnog kanala, cerviksa, rektuma.

PIF metoda pruža uvid u morfološka svojstva stanica i promjene u lokalizaciji HSV antigena. Osim izravnih znakova oštećenja stanica herpes virusima (detekcija specifične luminiscencije), postoje i neizravni znakovi herpes infekcije prema PIF podacima:

• agregacija nuklearne tvari, odvajanje karioleme;
• prisutnost takozvanih „rupastih“ jezgri, kada od stanične jezgre ostaje samo jedna kariolema;
• prisutnost intranuklearnih inkluzija - Cowdryjeva tjelešca.

Prilikom izvođenja PIF-a, liječnik dobiva ne samo kvalitativnu već i kvantitativnu procjenu stanja zaraženih stanica, koju smo koristili za procjenu učinkovitosti antivirusne terapije aciklovirom (AC). Tako je 80 pacijenata s jednostavnim genitalnim herpesom (GH) pregledano PIF metodom u dinamici. Pokazalo se da ako je prije liječenja aciklovirom 88% pacijenata imalo visok postotak zaraženih stanica (50-75% i više) u razmazima, onda su nakon jednog ciklusa aciklovira zdrave stanice otkrivene u razmazima 44% pacijenata, u 31% slučajeva zabilježene su pojedinačne zaražene stanice, a kod 25% pacijenata bilo je do 10% zaraženih stanica.

Sadržaj zaraženih stanica u razmazima (PIF reakcija) pacijenata s genitalnim herpesom liječenih aciklovirom

Razdoblja bolesti	Postotni sadržaj u razmazima
	Zaražene stanice					Normalne stanice
	Više od 75%	50-75%	40-50%	10%	Pojedinačne ćelije u vidnom polju
Recidiv (prije liječenja)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Remisija (nakon liječenja)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Korištenjem PIF-a i metode točkaste hibridizacije dugi niz godina uočeno je da se rezultati studije podudaraju u gotovo 100% slučajeva. Treba napomenuti da se radi povećanja pouzdanosti dijagnoze herpesa, posebno u slučajevima subkliničkih i slabo manifestnih oblika herpesa, preporučuje korištenje 2-3 metode laboratorijske dijagnostike u radu, posebno pri pregledu trudnica, žena s nepovoljnom opstetričkom anamnezom i osoba s neodređenom ginekološkom dijagnozom.

Dakle, u PCR dijagnostici virusnih i bakterijskih infekcija urogenitalnog trakta potrebno je procijeniti dobivene pozitivne rezultate uzimajući u obzir anamnezu, prisutnost (ili odsutnost) specifičnih kliničkih simptoma bolesti. Ako se klamidija otkrije pomoću PCR-a, tada u tom slučaju postoji velika vjerojatnost infekcije i pitanja terapije mogu se riješiti u skladu s tim. U slučaju otkrivanja mikoplazmi (ureaplazmi), koje su oportunistički mikroorganizmi, potrebne su dodatne kulturne studije za potvrdu dijagnoze, tj. sjetba materijala pacijenta na osjetljive stanične kulture. Tek ako se u kulturnoj analizi dobiju pozitivni rezultati, možemo govoriti o laboratorijskoj potvrdi dijagnoze mikoplazmoze. Ista metoda će omogućiti, ako je potrebno, određivanje osjetljivosti izoliranih mikoplazmi na često korištene oblike doziranja (antibiotici, fluorokinoloni itd.).

Moguća je istovremena infekcija s nekoliko virusa iz porodice Herpesviridae. Često smo otkrili infekciju jednog pacijenta virusima HSV-1, HSV-2 i CMV. Pacijenti s kliničkim i laboratorijskim manifestacijama sekundarnog IDS-a (onkohematološki, onkološki, HIV-inficirani pacijenti) bili su značajno češće inficirani s nekoliko herpes virusa. Dakle, pokazalo se da kliničke i imunološke poremećaje koji napreduju u HIV infekciji prati povećanje broja herpes virusa otkrivenih metodom molekularne hibridizacije. U ovom slučaju, prognostički najznačajnijim može se smatrati složeno istovremena detekcija DNA tipa HSV-1, CMV i HHV-6.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]