Hematopoetske matične stanice iz krvi pupkovine

Pupkovina je dobar izvor hematopoetskih matičnih stanica u smislu proliferativnog potencijala i sposobnosti repopulacije hematopoetskih stanica. Više puta je pokazano da do rođenja krv iz pupkovine sadrži dovoljno velik broj slabo vezanih hematopoetskih progenitorskih stanica. Neki autori smatraju da je prednost transplantacije hematopoetskih matičnih stanica iz krvi iz pupkovine nedostatak potrebe za traženjem donora kompatibilnog s HLA antigenima. Po njihovom mišljenju, nezrelost imunološkog sustava novorođenčeta uzrokuje smanjenu funkcionalnu aktivnost imunokompetentnih stanica i, shodno tome, nižu učestalost teške bolesti presatka protiv domaćina nego kod transplantacije koštane srži. Istodobno, stopa preživljavanja transplantiranih stanica iz krvi iz pupkovine nije niža od one stanica koštane srži, čak ni u slučaju korištenja manjeg broja HSC-a primijenjenih na 1 kg tjelesne težine pacijenta. Međutim, po našem mišljenju, pitanja optimalnog broja transplantiranih stanica iz pupkovine potrebnih za učinkovito prihvaćanje u tijelu primatelja, njihove imunološke kompatibilnosti i niz drugih aspekata problema transplantacije hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine zahtijevaju ozbiljniju analizu.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Dobivanje hematopoetskih matičnih stanica iz krvi pupkovine

Postupak dobivanja hematopoetskih matičnih stanica iz krvi pupkovine zahtijeva njezino prikupljanje odmah nakon rođenja djeteta i njezino odvajanje od posteljice kada je posteljica in utero ili ex utero, kao i tijekom carskog reza, ali i ex utero. Pokazalo se da ako se vrijeme od trenutka rođenja do odvajanja novorođenčeta od posteljice smanji na 30 sekundi, volumen dobivene krvi iz pupkovine povećava se u prosjeku za 25-40 ml. Ako se ovaj postupak provede kasnije, gubi se ista količina krvi. Utvrđeno je da rano odvajanje djeteta od posteljice ne povlači nikakve negativne posljedice za novorođenče.

Ruski istraživački institut za hematologiju i transfuziologiju razvio je učinkovite i jeftine tehnologije za dobivanje krvi iz pupkovine i tijekom normalnog poroda ((70,2+25,8) ml) i carskog reza ((73,4+25,1) ml). Predložena je metoda za odvajanje krvi iz pupkovine s dovoljno visokim prinosom nuklearnih i mononuklearnih stanica - (83,1+9,6) odnosno (83,4+14,1)%. Poboljšana je metoda krioprezervacije krvi iz pupkovine koja osigurava visoku očuvanost mononuklearnih stanica i CFU-GM - (96,8+5,7) odnosno (89,6+22,6)%. Utvrđena je učinkovitost drenažne metode za prikupljanje krvi iz pupkovine pomoću spremnika Kompoplast-300 (Rusija). Autori su prikupili krv iz pupkovine odmah nakon rođenja djeteta i njegovog odvajanja od posteljice, u uvjetima postavljanja posteljice in utero ili ex utero. Prije punkcije pupčane vene, pupčana vrpca je jednom tretirana 5%-tnom tinkturom joda, a zatim dva puta 70%-tnim etilnim alkoholom. Krv je spontano tekla kroz spojne cjevčice u posudu. Postupak prikupljanja nije trajao dulje od 10 minuta. Prosječni volumen 66 uzoraka krvi iz pupkovine prikupljenih drenažom bio je (72+28) ml, a broj leukocita u prosječnom ukupnom volumenu uzorka bio je (1,1+0,6) x 107. Prilikom analize krvi iz pupkovine na sterilnost (bakterijska kontaminacija, HIV-1, virusi hepatitisa B i C, sifilis i citomegalovirusna infekcija), IgG antitijela na virus hepatitisa C otkrivena su samo u jednom uzorku. U drugoj studiji, posteljica je odmah nakon rođenja postavljena fetalnom površinom prema dolje na poseban okvir, pupčana vrpca je tretirana 5%-tnom otopinom joda i 75%-tnim etilnim alkoholom. Pupčana vena je drenirana iglom iz transfuzijskog sustava (G16). Krv je spontano tekla u posudu. Prosječni volumen krvi prikupljene na ovaj način bio je (55+25) ml. U radu G. Koglera i sur. (1996.), krv iz pupkovine prikupljena je zatvorenom metodom te su dobiveni veliki volumeni krvi - u prosjeku (79+26) ml. Autori napominju da je među 574 uzorka krvi iz pupkovine oko 7% sadržavalo manje od 40 ml krvi, što im ne dopušta da se koriste za transplantaciju. K. Isoyama i sur. (1996.), prikupljajući krv iz pupkovine aktivnom eksfuzijom pomoću šprica, dobili su u prosjeku 69,1 ml krvi (volumen krvi iz pupkovine varirao je od 15 do 135 ml). Konačno, A. Abdel-Mageed PI i sur. (1997.) uspjeli su kateterizacijom pupkovine dobiti u prosjeku 94 ml krvi iz pupkovine (od 56 do 143 ml).

Kako bi se smanjio rizik jatrogene infekcije i kontaminacije majčinim sekretima, razvijen je zatvoreni sustav za prikupljanje krvi temeljen na široko korištenom transfuzijskom sustavu tvrtke Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (SAD), koji sadrži 62,5 ml CPDA (citrat-fosfat-dekstroza s adeninom) kao antikoagulansa. Tehnologija dobivanja materijala od primarne je važnosti za pripremu visokokvalitetnog uzorka u smislu volumena, sadržaja i čistoće stanične suspenzije. Od postojećih metoda za prikupljanje krvi iz pupkovine, koje se konvencionalno klasificiraju u zatvorene, poluotvorene i otvorene sustave, prednost treba dati prvoj, budući da zatvoreni sustav značajno smanjuje rizik od mikrobne kontaminacije materijala, kao i kontaminacije stanične suspenzije majčinim stanicama.

A. Nagler i sur. (1998.) proveli su komparativnu analizu učinkovitosti sva tri sustava za prikupljanje krvi iz pupkovine. U prvoj varijanti postupak je proveden u zatvorenom sustavu eksfolacijom krvi izravno u spremnik. U drugoj varijanti, krv iz pupkovine dobivena je aktivnim izvlačenjem krvi špricom MP1 nakon čega je slijedilo ispiranje placentalnih vena i istovremena drenaža krvi u spremnik (otvorena metoda). U trećoj varijanti, krv je prikupljena u poluotvorenom sustavu aktivnim izvlačenjem špricama i ispiranjem kroz pupkovinu uz istovremenu eksfuziju u spremnik. U prvoj varijanti, autori su dobili krv iz pupkovine u volumenu od (76,4+32,1) ml s udjelom leukocita od (10,5+3,6) x 10 ⁶ u 1 ml krvi. U drugoj varijanti, odgovarajući pokazatelji bili su (174,4+42,8) ml i (8,8+3,4) x 10 ⁶ /ml; u trećem - (173,7+41,3) ml i (9,3+3,8) x 10 ⁶ /ml. Najčešća infekcija uzoraka krvi iz pupkovine uočena je pri korištenju otvorenog sustava. Utvrđena je izravna korelacija između mase posteljice i volumena izvađene krvi - s povećanjem mase posteljice povećava se i količina prikupljene krvi.

Nakon uzimanja krvi iz pupkovine slijedi faza odvajanja - izolacija mononuklearnih stanica i pročišćavanje stanične suspenzije iz eritrocita. U eksperimentalnim uvjetima, nuklearne stanice se izoliraju sedimentacijom metilcelulozom tijekom lize eritrocita amonijevim kloridom. Međutim, metilceluloza se ne bi trebala koristiti u kliničke svrhe, budući da gubici hematopoetskih matičnih stanica na njoj dosežu 50-90%. Liza eritrocita se također gotovo nikada ne provodi u klinici zbog velikih volumena radne otopine, iako je postotak izolacije nuklearnih stanica s fenotipom CD34+, kao i progenitornih stanica s funkcijama CFU-GM i CFU-GEMM na ovaj način znatno veći. Izvještava se o pojavi novog sredstva za izolaciju mononuklearnih stanica u gradijentu gustoće, otopine buyant density (BDS72). Ova tvar ima sljedeće fiziološke parametre: pH - 7,4, osmolalnost - 280 mOsm/kg, gustoća - 1,0720 g/ml. Prema autorima, može se koristiti za izolaciju do 100% CD34-pozitivnih stanica i uklanjanje 98% eritrocita. Međutim, BDS72 se još ne koristi u klinici.

U odobrenim metodama izolacije nukleiranih stanica iz krvi pupkovine obično se koristi 10%-tna otopina hidroksietil škroba ili 3%-tna otopina želatine. Učinkovitost sedimentacije eritrocita i izolacije nukleiranih stanica u oba slučaja je približno jednaka. Međutim, kada se želatina koristi kao sredstvo za sedimentaciju, moguće je dobiti nešto veću količinu CFU-GM nego kada se koristi hidroksietil škrob. Pretpostavlja se da su razlike u učinkovitosti izolacije CFU-GM posljedica različitih brzina sedimentacije pojedinih frakcija nukleiranih stanica ili sposobnosti molekula hidroksietil škroba da se apsorbiraju na površini receptora hematopoetskih stanica i time blokiraju njihovu osjetljivost na faktore koji stimuliraju kolonije koji se koriste u kultiviranju CFU-GM in vitro. Ipak, oba sedimentatora mogu biti prikladna za izolaciju nukleiranih stanica pri stvaranju velikih banaka krvi iz pupkovine.

Metode odvajanja i krioprezervacije krvi iz pupkovine u osnovi se ne razlikuju od onih koje se koriste u radu s hematopoetskim matičnim stanicama periferne krvi i koštane srži odraslih donora. No, pri pripremi velikog broja uzoraka krvi iz pupkovine za njezine banke, metode odvajanja moraju, prije svega, biti jeftine. Stoga se, nažalost, trenutno za kliničke potrebe koriste već provjerene rutinske metode izolacije i krioprezervacije stanica krvi iz pupkovine, a učinkovitije, ali skuplje metode ostaju udjel eksperimentatora.

Općenito su odobreni kriteriji za procjenu broja hematopoetskih stanica i zahtjevi za ispitivanje uzoraka krvi iz pupkovine radi identifikacije zaraznih uzročnika. Kako bi se osigurala sigurnost transplantacije hematopoetskih stanica iz krvi iz pupkovine, svi uzorci krvi moraju se prvenstveno pregledati na hematogeno prenesene infekcije i genetske bolesti. Brojni autori preporučuju dodatne posebne metode za ispitivanje krvi iz pupkovine radi dijagnosticiranja genetskih bolesti poput a-talasemije, anemije srpastih stanica, nedostatka adenozin deaminaze, Brutonove agamaglobulinemije, Hurlerove i Ponterove bolesti.

Prema preporukama L. Tichelija i koautora (1998.), svaki uzorak krvi iz pupkovine mora se testirati na nuklearne stanice, CD34-pozitivne stanice i CFU-GM, mora se provesti HLA tipizacija te odrediti krvna grupa prema ABO i njezin Rh faktor. Osim toga, mora se provesti bakteriološka kultura, serološko testiranje na HIV i citomegalovirusnu infekciju, HBsAg, virusni hepatitis C, HTLY-I i HTLV-II (leukemija ljudskih T-stanica), sifilis i toksoplazmozu. Lančana reakcija polimeraze za citomegalovirus i HIV infekciju je obavezna.

Postupak uzimanja krvi iz pupkovine mora se provoditi u strogom skladu s načelima medicinske bioetike. Prije uzimanja krvi potrebno je dobiti pristanak trudnice za njegovo provođenje. Prethodni razgovor s trudnicom radi dobivanja informiranog pristanka za sve manipulacije, od ekstrakcije krvi do ispunjavanja dokumentacije, provode samo medicinski djelatnici. Ni u kojem slučaju nije dopušteno da bilo koji od ovih postupaka provodi osoblje s biološkim, kemijskim, farmaceutskim ili drugim nemedicinskim obrazovanjem, zbog kršenja utvrđenih normi bioetike i ljudskih prava. U slučaju pozitivnih testova na HBsAg nositeljstvo, prisutnost antitijela na uzročnike hepatitisa C, HIV infekcije i sifilisa, krv iz pupkovine se ne uzima, a uzorci već prikupljene krvi se odbacuju i uništavaju. Treba napomenuti da je nositeljstvo latentnih infekcija kod novorođenčadi mnogo rjeđe nego kod odraslih, stoga je vjerojatnost hematogenog prijenosa i razvoja infektivnih komplikacija tijekom infuzija hematopoetskih stanica iz krvi iz pupkovine znatno niža nego u slučaju korištenja koštane srži odraslog donora za transplantaciju.

Važan aspekt kliničke upotrebe krvi iz pupkovine je evaluacija transplantacije, koja se temelji na određivanju količine hematopoetskih matičnih stanica u uzorku krvi iz pupkovine i doza stanica potrebnih za transplantaciju. Trenutno još nisu razvijeni standardi za optimalnu količinu stanica iz krvi iz pupkovine potrebnih za transplantaciju. Ne postoji općeprihvaćeno stajalište čak ni o rutinskim parametrima kao što su broj CD34-pozitivnih stanica i CFU-GM. Neki autori procjenjuju potencijal hematopoetskih stanica analizom dugotrajnih kultura s određivanjem sadržaja jedinica koje stvaraju kolonije zajedničkih granulocitima, eritrocitima, monocitima i megakariocitima - CFU-GEMM.

Međutim, u kliničkom okruženju, standardna procjena transplantacije krvi iz pupkovine obično uključuje samo određivanje broja nuklearnih ili mononuklearnih stanica.

Pohrana hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine

Također postoje neki problemi u tehnologiji pohrane hematopoetskih stanica krvi iz pupkovine. Prilikom krioprezervacije hematopoetskih matičnih stanica, kako bi se postigao optimalni način zamrzavanja, potrebno je što više smanjiti volumen krvi iz pupkovine, a također i unaprijed ukloniti eritrocite kako bi se izbjegla hemoliza i rizik od razvoja reakcije nekompatibilnosti za eritrocitne antigene (ABO, Rh). Za te svrhe prikladne su različite metode izolacije stanica s jezgrom. Početkom 90-ih godina prošlog stoljeća najčešće korištena metoda bila je izolacija stanica s jezgrom u gradijentu gustoće na bazi Ficolla gustoće 1,077 g/ml ili Percolla gustoće 1,080 g/ml. Odvajanje krvi iz pupkovine u gradijentu gustoće omogućuje izolaciju pretežno mononuklearnih stanica, ali dovodi do značajnih gubitaka hematopoetskih progenitorskih stanica - do 30-50%.

Učinkovitost sedimentacije hidroksietil škroba u procesu izolacije hematopoetskih stanica iz pupkovine procjenjuje se različito. Neki autori ističu nisku kvalitetu separacije ovom metodom, dok drugi istraživači, naprotiv, među svim mogućim metodama daju prednost izolaciji HSC-a iz pupkovine pomoću 6%-tne otopine hidroksietil škroba. Istovremeno, ističe se visoka učinkovitost sedimentacije hematopoetskih stanica, koja prema nekim podacima doseže od 84% do 90%.

Zagovornici drugačijeg gledišta smatraju da su gotovo sve metode frakcioniranja povezane s velikim gubicima stanica s jezgrom te predlažu provođenje separacije centrifugiranjem, dijeleći krv iz pupkovine u 3 frakcije: eritrocite, leukocitni prsten i plazmu. Izolacijom stanica na ovaj način, autori su otkrili da je sadržaj mononuklearnih stanica, ranih hematopoetskih progenitorskih stanica i stanica s imunofenotipom CD34+ u konačnici iznosio 90, 88 odnosno 100% početne razine. Slične vrijednosti za povećanje stanica iz krvi pupkovine pročišćenih ovom metodom dobili su i drugi istraživači: nakon sedimentacije izolirano je 92% stanica s jezgrom, 98% mononuklearnih stanica, 96% CD34-pozitivnih stanica i 106% jedinica koje tvore kolonije.

Krajem 1990-ih, želatina se široko koristila kao sedimentacijsko sredstvo. U kliničkoj praksi, želatina se koristi za izolaciju hematopoetskih matičnih stanica iz krvi pupkovine od 1994. godine. Pri korištenju 3%-tne otopine želatine, učinkovitost izolacije stanica s jezgrom doseže 88-94%. Velika upotreba želatine u stvaranju banke krvi pupkovine potvrdila je njezine prednosti u odnosu na druga sedimentacijska sredstva. Komparativna analiza učinkovitosti svih gore navedenih metoda za izolaciju stanica s jezgrom pod uvjetima njihove uzastopne upotrebe na svakom od testiranih uzoraka krvi pupkovine dokazala je da je 3%-tna otopina želatine optimalno sedimentacijsko sredstvo u smislu prinosa mononuklearnih stanica s fenotipom CD34+/CD45+, kao i u smislu broja CFU-GM i CFU-GEMM. Metode koje koriste Ficoll gradijent gustoće, kao i upotreba hidroksietil škroba i metilceluloze, bile su znatno manje učinkovite, s gubicima hematopoetskih stanica koji su dosezali 60%.

Širenje volumena transplantacije matičnih stanica iz pupkovine povezano je ne samo s razvojem metoda za njihovo prikupljanje, već i za njihovo skladištenje. Postoje mnogi problemi izravno povezani s pripremom krvi iz pupkovine za dugotrajno skladištenje i odabirom optimalne tehnologije za krioprezervaciju njezinih uzoraka. Među njima su pitanja izvedivosti provođenja postupaka odvajanja, korištenja različitih medija za krioprezervaciju i primjene metoda za pripremu odmrznutih stanica za transplantaciju. Prijevoz uzoraka izvorne krvi iz pupkovine često se provodi iz regija udaljenih od hematoloških centara. U tom smislu, javlja se problem prihvatljivih razdoblja skladištenja krvi iz pupkovine od trenutka njezina prikupljanja do početka krioprezervacije, što je od posebne važnosti pri stvaranju banaka krvi iz pupkovine.

Studija funkcionalne aktivnosti hematopoetskih stanica u krvi pupkovine nakon dugotrajnog skladištenja (do 12 godina) u tekućem dušiku pokazala je da oko 95% hematopoetskih stanica ne gubi svoj visoki proliferativni kapacitet tijekom tog razdoblja. U radu S. Yurasova i suradnika (1997.) dokazano je da skladištenje krvi pupkovine na sobnoj temperaturi (22°C) ili na 4°C tijekom 24 i 48 sati ne smanjuje značajno održivost hematopoetskih stanica, koja iznosi 92 odnosno 88% početne razine. Međutim, ako se razdoblje skladištenja produži na tri dana, broj održivih stanica s jezgrom u krvi pupkovine značajno se smanjuje. Istodobno, druge studije pokazale su da pri skladištenju 2-3 dana na 22 ili 4°C, prije svega pati održivost zrelih granulocita, a ne hematopoetskih stanica.

Na održivost hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine mogu negativno utjecati komponente sustava za prikupljanje krvi iz pupkovine. Analiza učinka različitih antikoagulansa čiji je mehanizam djelovanja posljedica vezanja kalcijevih iona (ACD, EDTA, XAPD-1) na hematopoetske progenitorske stanice u uvjetima skladištenja krvi iz pupkovine tijekom 24 do 72 sata otkrila je njihov negativan učinak na održivost stanica s jezgrom. U tom smislu, autori preporučuju korištenje PBS-a (otopine fosfatnog pufera) s dodatkom nativnog heparina bez konzervansa u koncentraciji od 20 U/ml, što, po njihovom mišljenju, omogućuje produljenje razdoblja skladištenja nefrakcionirane krvi iz pupkovine na 72 sata i čuva funkcionalnu aktivnost jedinica koje stvaraju kolonije. Međutim, studija sigurnosti CFU-GM i CFU-G pokazala je da vrijeme skladištenja krvi iz pupkovine prije krioprezervacije ne smije biti dulje od devet sati. Očito je da bi se u ovom slučaju trebalo primjenjivati načelo da se u prisutnosti proturječnih podataka treba koristiti minimalno preporučeno razdoblje skladištenja krvi iz pupkovine i što prije započeti programirano zamrzavanje izoliranih stanica.

Prilikom zamrzavanja hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine, obično se kao krioprotektant koristi 10%-tna otopina DMSO-a. Međutim, osim izraženog krioprotektivnog učinka, dimetilsulfoksid u takvoj koncentraciji ima i izravan citotoksični učinak, čak i uz minimalnu izloženost hematopoetskim stanicama iz pupkovine. Kako bi se smanjio citotoksični učinak DMSO-a, koristi se nulta temperatura izlaganja, povećava se brzina svih manipulacija i provodi se višestruko ispiranje nakon odmrzavanja uzoraka krvi iz pupkovine.

Od 1995. godine Institut za hematologiju i transfuziologiju Akademije medicinskih znanosti Ukrajine razvija znanstveni smjer usmjeren na sveobuhvatno proučavanje krvi iz pupkovine kao alternativnog izvora hematopoetskih matičnih stanica. Posebno su razvijene nove tehnologije za krioprezervaciju hematopoetskih stanica nefrakcionirane i frakcionirane krvi iz pupkovine na niskim temperaturama. Kao krioprotektant koristi se niskomolekularni medicinski polivinilpirolidon. Metoda krioprezervacije nefrakcionirane krvi iz pupkovine temelji se na originalnoj tehnologiji za predpripremu stanica za zamrzavanje i metodi za posebnu obradu stanične suspenzije neposredno prije transplantacije.

Jedan od najvažnijih čimbenika koji utječu na razinu funkcionalne aktivnosti krioprezerviranih hematopoetskih matičnih stanica je brzina hlađenja stanične suspenzije, posebno tijekom faze kristalizacije. Softverski pristup rješavanju problema brzine i vremena zamrzavanja pruža velike mogućnosti za stvaranje jednostavnih i vrlo učinkovitih metoda krioprezervacije, bez ispiranja stanične suspenzije od krioprotektora prije transplantacije.

Najopasnije faze za održivost stanica tijekom njihove pripreme su faze izravnog zamrzavanja i odmrzavanja. Prilikom zamrzavanja hematopoetskih stanica, značajan dio njih može biti uništen u trenutku prijelaza međustanične sredine iz tekuće u čvrstu fazu - kristalizacije. Kako bi se smanjio postotak stanične smrti, koriste se krioprotektori čiji su mehanizmi djelovanja i krioprotektivna učinkovitost dovoljno obrađeni u znanstvenoj literaturi.

Obećavajući smjer za optimizaciju metoda krioprezervacije stanica koštane srži i krvi pupkovine je kombinacija niskih koncentracija nekoliko krioprotektora s različitim mehanizmima djelovanja u jednoj otopini, na primjer, DMSO-a koji djeluje na unutarstaničnoj razini i hidroksietil škroba ili albumina, koji imaju izvanstanični zaštitni učinak.

Za krioprezervaciju stanica krvi pupkovine tradicionalno se koristi 20%-tna otopina DMSO-a koja se polako ulijeva u suspenziju stanica uz stalno mehaničko miješanje u ledenoj kupelji dok se ne postigne jednak (1:1) omjer volumena krioprotektanta i suspenzije stanica. Konačna koncentracija dimetil sulfoksida je 10%. Suspenzija stanica se zatim hladi u programiranoj kriogenoj jedinici brzinom od GS/min do -40°C, nakon čega se brzina hlađenja povećava na 10°C/min. Nakon postizanja -100°C, posuda sa suspenzijom stanica stavlja se u tekući dušik (-196°C). Ovom tehnikom krioprezervacije očuvanje funkcionalno aktivnih mononuklearnih stanica nakon odmrzavanja doseže 85% izvorne razine.

Modifikacije metoda krioprezervacije usmjerene su na smanjenje koncentracije DMSO-a dodavanjem hidroksietil škroba (konačne koncentracije dimetil sulfoksida i hidroksietil škroba su 5 odnosno 6%). Visoka učinkovitost takve kombinacije krioprotektora uočava se pri zamrzavanju suspenzije mijeloidnih stanica, i to uz ne manju citoprotekciju nego pri korištenju samo 10%-tne otopine dimetil sulfoksida. Broj održivih stanica s jezgrom dosegao je 96,7% početne razine, a njihova funkcionalna aktivnost, procijenjena brojem CFU-GM, iznosila je 81,8%.

Pri korištenju otopine dimetil sulfoksida u koncentracijama od 5 do 10% u kombinaciji s 4% hidroksietil škroba (konačna koncentracija), utvrđeno je da sigurnost CD34-pozitivnih stanica u takvim rasponima dimetil sulfoksida ostaje praktički nepromijenjena. Istodobno, kada se koncentracija dimetil sulfoksida smanji s 5 na 2,5%, opaža se masovna smrt stanica pupkovine - broj održivih staničnih jedinica smanjuje se s 85,4 na 12,2%. Drugi autori također su došli do zaključka da su 5 i 10% otopine dimetil sulfoksida (u autorovoj verziji - u kombinaciji s autolognim serumom) te koje pružaju citoprotekciju s maksimalnom učinkovitošću tijekom krioprezervacije HSC-a pupkovine. Osim toga, visoka očuvanost uzastopno smrznutih i odmrznutih stanica primjećuje se u slučaju kombinacije 5 ili 10% dimetil sulfoksida s 4% otopinom hidroksietil škroba, posebno pri kontroliranoj brzini hlađenja od GS/min. U drugoj studiji korištena je krioprotektivna otopina koja se sastojala od tri sastojka - DMSO-a, pročišćenog humanog albumina i RPMI medija u omjeru 1:4:5, koja je dodana u suspenziju stanica u jednakom volumskom omjeru (konačna koncentracija dimetil sulfoksida bila je 5%). Nakon odmrzavanja u vodenoj kupelji na temperaturi od +4 GS, očuvanost CFU-GM premašila je 94%.

Neki autori predlažu korištenje nefrakcionirane krvi iz pupkovine za krioprezervaciju, budući da se tijekom procesa uklanjanja crvenih krvnih stanica gube značajne količine hematopoetskih stanica. U ovoj varijanti koristi se 10%-tna otopina dimetil sulfoksida za zaštitu mononuklearnih stanica od štetnih učinaka kriokristalizacije. Zamrzavanje se provodi konstantnom brzinom hlađenja od GS/min do -80°C, nakon čega se suspenzija stanica krvi iz pupkovine spušta u tekući dušik. Ova metoda zamrzavanja rezultira djelomičnom lizom crvenih krvnih stanica, pa uzorci krvi ne zahtijevaju frakcioniranje. Nakon odmrzavanja, suspenzija stanica se ispire od slobodnog hemoglobina i dimetil sulfoksida u otopini humanog albumina ili u autolognom krvnom serumu pacijenta te se koristi za transplantaciju.

Očuvanje hematopoetskih progenitorskih stanica nakon odmrzavanja nefrakcionirane krvi iz pupkovine doista je veće nego kod frakcionirane krvi iz pupkovine, međutim, zbog kriostatnosti nekih eritrocita, mogu se pojaviti ozbiljni problemi nakon transfuzije zbog transfuzije ABO-nekompatibilnih eritrocita. Osim toga, volumen pohranjene nefrakcionirane krvi značajno se povećava. S kliničkog gledišta, krioprezervacija hematopoetskih stanica iz krvi iz pupkovine prethodno izoliranih i pročišćenih od drugih staničnih frakcija i dalje je poželjnija.

Posebno je razvijena metoda krioprezervacije frakcioniranih stanica pupčane krvi koja omogućuje uklanjanje eritrocita u fazi pripreme za zamrzavanje, u kojoj se 6%-tna otopina hidroksietil škroba koristi kao dio otopine za zamjenu plazme "Stabiloz". Nakon odmrzavanja, suspenzija stanica dobivena na ovaj način spremna je za kliničku upotrebu bez dodatnih manipulacija.

Dakle, trenutno postoji mnogo prilično učinkovitih metoda krioprezervacije krvi iz pupkovine. Njihova temeljna razlika je u tome što se uzorci krvi zamrzavaju nefrakcionirani ili se podvrgavaju odvajanju na stanične frakcije u fazi pripreme, a pripremaju se nuklearne stanice bez primjese eritrocita.

Transplantacija hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine

Krajem 1980-ih i početkom 1990-ih utvrđeno je da krv iz pupkovine, koja fetusu pruža životnu podršku tijekom trudnoće, ima visok sadržaj hematopoetskih matičnih stanica. Relativna jednostavnost dobivanja stanica iz krvi iz pupkovine i odsutnost očitih etičkih problema pridonijeli su korištenju matičnih stanica iz krvi iz pupkovine u praktičnoj medicini. Prva uspješna transplantacija krvi iz pupkovine djetetu s Fanconijevom anemijom poslužila je kao polazna točka za proširenje volumena transplantacija matičnih stanica iz krvi iz pupkovine i stvaranje sustava za njezino pohranjivanje. U svjetskom sustavu banaka krvi iz pupkovine najveći je New York Placental Blood Center, koji se nalazi u bilanci američkog Nacionalnog instituta za zdravlje. Broj pohranjenih uzoraka krvi iz pupkovine u ovoj banci približava se broju 20 000. Broj primatelja (uglavnom djece) koji su uspješno transplantirani također raste. Prema podacima američkog Ministarstva zdravstva, razdoblje bez recidiva nakon transplantacije primatelja transplantirane krvi iz pupkovine već prelazi 10 godina.

To nije iznenađujuće, budući da su brojne studije hematopoetskog potencijala krvi iz pupkovine pokazale da po količini i kvaliteti najranijih matičnih stanica ne samo da nije inferiorna koštanoj srži odrasle osobe, već je u nekim aspektima i nadmašuje. Veći proliferativni potencijal matičnih stanica krvi iz pupkovine posljedica je ontogenetskih značajki stanične signalizacije, prisutnosti receptora za specifične faktore rasta na HSC-u, sposobnosti stanica krvi iz pupkovine za autokrinu proizvodnju faktora rasta te velike veličine i duljine telomera.

Dakle, genomske i fenotipske karakteristike hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine predodređuju visokokvalitetno prihvaćanje transplantata s visokim potencijalom za obnovu hematopoeze donora u tijelu primatelja.

Prednosti hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine

Među stvarnim prednostima korištenja hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine za transplantaciju u odnosu na druge izvore hematopoetskih stanica, vrijedi istaknuti praktički nulti rizik za zdravlje darivatelja (ako ne uzimamo posteljicu kao takvu) i odsutnost potrebe za općom anestezijom. Korištenje krvi iz pupkovine proširuje mogućnosti transplantacije stanica zbog djelomično HLA-kompatibilnih transplantata (nekompatibilnost od jednog do tri antigena). Razvijena je metoda za dugotrajno pohranjivanje hematopoetskih stanica iz krvi iz pupkovine u smrznutom stanju, što povećava vjerojatnost dobivanja rijetkih HLA tipova i smanjuje vrijeme traženja HLA-kompatibilnog transplantata za alogenu transplantaciju. Istodobno, značajno se smanjuje rizik od razvoja određenih latentnih infekcija koje se prenose transmisivno. Osim toga, nastaje jeftin oblik biološkog životnog osiguranja zbog mogućnosti korištenja stanica iz krvi iz pupkovine za autolognu transplantaciju.

Međutim, zbog malih volumena krvi koji se mogu prikupiti iz posteljice (u prosjeku ne više od 100 ml), problem dobivanja maksimalne moguće količine krvi iz pupkovine dolazi do izražaja uz strogo poštivanje uvjeta minimalnog rizika bakterijske kontaminacije dobivenih uzoraka krvi iz pupkovine.

Primitivne hematopoetske stanice iz pupkovine obično se identificiraju prisutnošću CD34 glikofosfoproteina na njihovoj površini, kao i na temelju njihovih funkcionalnih svojstava proučavanjem klonogenosti ili stvaranja kolonija in vitro. Komparativna analiza pokazala je da je u krvi iz pupkovine i koštanoj srži maksimalni sadržaj CD34-pozitivnih stanica u mononuklearnoj frakciji 1,6 odnosno 5,0%, maksimalna razina jedinica koje stvaraju kolonije u subpopulaciji CD34+ stanica je 80 odnosno 25%, ukupna učinkovitost kloniranja CD34+ stanica je 88 odnosno 58%, maksimalni sadržaj stanica koje stvaraju kolonije s visokim proliferacijskim potencijalom (HPP-CFC u populaciji CD34+) je 50 odnosno 6,5%. Treba dodati da su učinkovitost kloniranja CD34+CD38 stanica i sposobnost reagiranja na stimulaciju citokinama također veće u hematopoetskim matičnim stanicama iz krvi iz pupkovine.

Kombinacija fenotipskih antigena Thy-1, CD34 i CD45RA potvrđuje visoki proliferativni potencijal hematopoetskih stanica iz pupkovine, a ekspresija ova tri antigena na površini stanica iz pupkovine ukazuje na njihovu pripadnost matičnim stanicama. Osim toga, utvrđeno je da krv iz pupkovine sadrži stanice s fenotipom CD34+ koje nemaju markere linearne diferencijacije. Razina staničnih subpopulacija s fenotipskim profilom CD34+/Lin u krvi iz pupkovine iznosi oko 1% ukupnog broja CD34-pozitivnih stanica. Hematopoetske progenitorske stanice iz krvi iz pupkovine daju i limfoidnu staničnu liniju i pluripotentni mijeloidni niz linearne stanične diferencijacije, što također ukazuje na njihovu pripadnost matičnim stanicama.

Kao što je već spomenuto, značajne razlike između koštane srži i krvi iz pupkovine su u količini hematopoetskih stanica korištenih za transplantaciju dobivenih tijekom jednog postupka prikupljanja. Ako je tijekom transplantacije koštane srži gubitak stanične mase tijekom odvajanja, krioprezervacije, odmrzavanja i testiranja prihvatljiv unutar 40-50%, tada su za krv iz pupkovine takvi gubici stanica vrlo značajni, jer ako se koristi nedovoljna količina HSC-a, transplantacija se može pokazati neučinkovitom. Prema G. Kogleru i sur. (1998.), za transplantaciju stanica s tjelesnom težinom primatelja od 10 kg, svi uzorci krvi iz pupkovine mogu biti potencijalni transplantati (ukupan broj prikupljenih uzoraka krvi iz pupkovine je 2098), s tjelesnom težinom od 35 kg - 67%, a samo 25% uzoraka može osigurati učinkovitu transplantaciju kod pacijenata s tjelesnom težinom od 50-70 kg. Ova klinička situacija ukazuje na potrebu optimizacije i poboljšanja učinkovitosti postojećih metoda prikupljanja, reprodukcije i pohrane stanica krvi iz pupkovine. Stoga se u literaturi trenutno široko raspravlja o pitanjima standardizacije metoda prikupljanja, testiranja, odvajanja i krioprezervacije krvi iz pupkovine za stvaranje banaka krvi, njezinoj upotrebi u klinici, a također se propisuju uvjeti i rokovi pohrane hematopoetskih matičnih stanica iz krvi iz pupkovine.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Upotreba hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine u medicini

^{Obično je iz krvi pupkovine moguće izolirati do 10⁶} hematopoetskih matičnih stanica, rijetko više. U tom smislu, pitanje je li takva količina hematopoetskih stanica iz krvi pupkovine dovoljna za obnovu hematopoeze kod odraslog primatelja ostaje otvoreno do danas. Mišljenja o tom pitanju su podijeljena. Neki istraživači smatraju da je takva količina sasvim dovoljna za transplantaciju djeci, ali premala za transplantaciju odrasloj osobi, za koju je optimalna količina unošenje (7-10) x 10⁶ ^CD34 -pozitivnih stanica na 1 kg tjelesne težine - u prosjeku 7 x 10⁶ ^po transplantaciji. Iz ovih izračuna proizlazi da jedan uzorak krvi pupkovine sadrži 700 puta manje hematopoetskih matičnih stanica nego što je potrebno za jednu transplantaciju odraslom pacijentu. Međutim, takva kvantitativna procjena vrši se po analogiji s brojem transfuziranih stanica koštane srži i uopće ne uzima u obzir ontogenetske značajke hematopoeze.

Posebno se zanemaruje činjenica većeg proliferativnog potencijala hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine u usporedbi s hematopoetskim progenitorskim stanicama koštane srži. Rezultati in vitro studija potencijala stvaranja kolonija sugeriraju da je jedna doza krvi iz pupkovine sposobna osigurati rekonstrukciju hematopoeze odraslog primatelja. S druge strane, ne treba zaboraviti da se broj matičnih stanica iz krvi iz pupkovine smanjuje čak i tijekom embrionalnog razvoja: sadržaj CD34-pozitivnih stanica u krvi iz pupkovine linearno se smanjuje 5 puta u razdoblju od 20 tjedana (krv za studiju dobivena je tijekom prijevremenog prekida trudnoće) do 40 tjedana trudnoće (razdoblje fiziološkog poroda), što je popraćeno paralelnom, trajno rastućom ekspresijom linearnih markera citodiferencijacije.

Zbog nedostatka standardiziranog pristupa kvantitativnom određivanju progenitorskih stanica u uzorcima krvi iz pupkovine, rasprave o optimalnoj dozi hematopoetskih matičnih stanica iz krvi iz pupkovine i dalje se vode. Neki istraživači smatraju da se broj nuklearnih stanica i mononuklearnih stanica preračunat na tjelesnu težinu primatelja, tj. njihova doza, može koristiti kao kriterij za odabir uzoraka krvi iz pupkovine. Neki autori smatraju da je minimalni kvantitativni prag CD34+ stanica čak i za autotransplantaciju HSC-a 2 x 10 ⁶ /kg. Istodobno, povećanje doze hematopoetskih stanica na 5 x 10 ⁶ stanica/kg (samo 2,5 puta) već osigurava povoljniji tijek ranog posttransplantacijskog razdoblja, smanjuje učestalost infektivnih komplikacija i skraćuje trajanje preventivne antibiotske terapije.

Prema E. Gluckmanu i suradnicima (1998.), u onkohematologiji uvjet za uspješnu transplantaciju stanica iz pupkovine je unošenje najmanje 3,7 x 10 ⁷ nuklearnih stanica na 1 kg tjelesne težine primatelja. Kada se doza hematopoetskih matičnih stanica smanji na 1 x 10 ⁷ ili manje nuklearnih stanica na 1 kg tjelesne težine pacijenta, rizik od neuspjeha transplantacije i recidiva raka krvi naglo se povećava. Treba prepoznati da minimalni broj progenitorskih stanica potrebnih za brzu obnovu hematopoeze nakon alotransplantacije HSC-a još uvijek nije poznat. Teoretski se to može postići korištenjem jedne stanice, ali u kliničkoj praksi transplantacije koštane srži brzo i stabilno prihvaćanje zajamčeno je transfuzijom najmanje (1-3) x 10 ⁸ nuklearnih stanica na 1 kg tjelesne težine pacijenta.

Nedavna detaljna studija za određivanje optimalnog broja HSC-a u onkohematologiji uključivala je promatranje pacijenata u tri skupine, raspoređene ovisno o sadržaju CD34-pozitivnih stanica u transplantiranom materijalu. Pacijentima prve skupine davano je (3-5) x 10 ⁶ stanica/kg. Doza HSC-a u pacijenata druge skupine bila je (5-10) x 10 ⁶ stanica/kg, a pacijentima treće skupine transplantirano je više od 10 x 10 ⁶ CD34+ stanica/kg. Najbolji rezultati uočeni su u skupini primatelja koji su primili transplantat s brojem CD34-pozitivnih stanica jednakim (3-5) x 10 ⁶ /kg. S povećanjem doze transplantiranih stanica iznad 5 x 10 ⁶ /kg, nisu otkrivene statistički značajne prednosti. U ovom slučaju, vrlo visok sadržaj HSC-a u transplantatu (> 10 x 10 ⁶ /kg) povezan je s ponovnom infuzijom značajnog broja rezidualnih tumorskih stanica, što dovodi do recidiva bolesti. Izravna veza između broja transplantiranih alogenih progenitorskih stanica i razvoja reakcije presatka protiv domaćina nije utvrđena.

Akumulirano svjetsko iskustvo transplantacije krvi iz pupkovine potvrđuje njihov visoki potencijal repopulacije. Stopa prihvata transplantata krvi iz pupkovine korelira s brojem uvedenih stanica s jezgrom. Najbolji rezultati uočeni su kod transplantacije od 3 x 10 ⁷ /kg, dok je za koštanu srž ta doza 2 x 10 ⁸ /kg. Prema podacima koordinacijskih centara, krajem 2000. godine u svijetu je obavljeno 1200 transplantacija stanica krvi iz pupkovine, uglavnom od srodnih donora (83%). Očito je da krv iz pupkovine treba razmotriti kao alternativu koštanoj srži za transplantaciju pacijentima s hemoblastozama.

Istovremeno, neonatalna priroda izvora hematopoetskog tkiva iz pupkovine ulijeva optimizam zbog prisutnosti funkcionalnih značajki njezine HSC. Istovremeno, samo kliničko iskustvo može odgovoriti na pitanje dostatnosti jednog uzorka krvi iz pupkovine za obnovu hematopoeze kod odraslog primatelja s hematopoetskom aplazijom. Transplantacija stanica krvi iz pupkovine koristi se u programima liječenja mnogih tumorskih i netumorskih bolesti: leukemije i mijelodisplastičnih sindroma, ne-Hodgkinovog limfoma i neuroblastoma, aplastične anemije, kongenitalnih Fanconijevih i Diamond-Blackfanovih anemija, nedostatka adhezije leukocita, Barrovog sindroma, Guntherove bolesti, Hurlerovog sindroma, talasemije.

Imunološki aspekti transplantacije hematopoetskih stanica iz pupkovine zaslužuju posebnu pozornost i zasebnu studiju. Pokazalo se da su u slučaju transplantacije matičnih stanica iz pupkovine od donora s nepotpunom HLA kompatibilnošću rezultati transplantacije prilično zadovoljavajući, što, prema autorima, ukazuje na nižu imunoreaktivnost stanica iz pupkovine nego koštane srži.

Detaljna studija staničnog sastava krvi iz pupkovine otkrila je značajke fenotipskog spektra efektorskih stanica imunološkog sustava i njihove funkcionalne aktivnosti, što je omogućilo da se krv iz pupkovine smatra izvorom HSC-a s relativno niskim rizikom od razvoja reakcije 'graft versus host'. Među znakovima funkcionalne nezrelosti imunokompetentnih stanica krvi iz pupkovine potrebno je istaknuti neravnotežu u proizvodnji citokina i smanjenje osjetljivosti na citokinsku regulaciju imunološkog odgovora. Rezultirajuća inhibicija aktivnosti citotoksičnih limfocita smatra se faktorom koji doprinosi stvaranju imunološke tolerancije na transplantirano hematopoetsko tkivo. U populaciji limfocita krvi iz pupkovine, za razliku od periferne krvi i koštane srži odraslih donora, prevladavaju neaktivni, nezreli limfociti i supresorske stanice. To ukazuje na smanjenu spremnost T-limfocita krvi iz pupkovine za imunološki odgovor. Važna značajka monocitne populacije stanica krvi iz pupkovine je nizak sadržaj funkcionalno potpunih i aktivnih stanica koje prezentiraju antigen.

S jedne strane, niska zrelost efektorskih stanica imunološkog sustava u krvi pupkovine proširuje indikacije za njegovu upotrebu u klinici, budući da te značajke omogućuju smanjenje intenziteta imunološkog sukoba između stanica darivatelja i primatelja. No, s druge strane, poznato je postojanje korelacije između stupnja razvoja reakcije "graft versus host" i antitumorskog učinka transplantacije, odnosno razvoja efekta "graft versus leukemija". U tom smislu provedeno je istraživanje o antitumorskoj citotoksičnosti stanica krvi pupkovine. Dobiveni rezultati ukazuju na to da su, unatoč doista oslabljenom odgovoru imunokompetentnih stanica krvi pupkovine na stimulaciju antigenom, limfociti koji se primarno aktiviraju prirodni ubojice i stanice slične ubojicama koje aktivno sudjeluju u mehanizmima provedbe antitumorske citotoksičnosti. Osim toga, u krvi pupkovine pronađene su subpopulacije limfocita s fenotipovima CD16+CD56+ i CD16"TCRa/p+. Pretpostavlja se da te stanice u svom aktiviranom obliku provode reakciju "graft versus leukemija".

U Institutu za onkologiju Akademije medicinskih znanosti Ukrajine, krioprezervirane hematopoetske stanice iz krvi pupkovine davane su oboljelima od raka s perzistentnom hematopoetskom hipoplazijom uzrokovanom kemoterapijom i radioterapijom. Kod takvih pacijenata, transplantacija hematopoetskih matičnih stanica iz krvi pupkovine prilično je učinkovito obnovila depresivnu hematopoezu, što dokazuje trajni porast sadržaja zrelih formiranih elemenata u perifernoj krvi, kao i porast pokazatelja koji karakteriziraju stanje staničnog i humoralnog imuniteta. Stabilnost učinka repopulacije nakon transplantacije hematopoetskih stanica iz krvi pupkovine omogućuje nastavak zračenja i kemoterapije bez prekida tijeka liječenja. Postoje informacije o većoj učinkovitosti alotransplantacije matičnih stanica iz krvi pupkovine onkohematološkim pacijentima: godišnji rizik od recidiva tumorske bolesti uz njihovu upotrebu bio je 25% u odnosu na 40% kod pacijenata s transplantiranom alogenom koštanom srži.

Mehanizam djelovanja krioprezerviranih matičnih stanica iz pupkovine treba smatrati rezultatom humoralne stimulacije hematopoeze primatelja uzrokovane jedinstvenom sposobnošću neonatalnih stanica za autokrinu proizvodnju hematopoetskih faktora rasta, kao i posljedicom privremenog usađivanja stanica donora (što dokazuje pouzdan porast sadržaja fetalnog hemoglobina u perifernoj krvi primatelja 7.-15. dana nakon transfuzije u usporedbi s početnim podacima). Odsutnost posttransfuzijskih reakcija kod primatelja krvi iz pupkovine rezultat je relativne tolerancije njezinih imunokompetentnih stanica, kao i kriterij pouzdanosti za biološku adekvatnost krioprezerviranog materijala.

Progenske stanice ubojice T-limfocita iz pupkovine sposobne su za aktivaciju pod utjecajem egzogene stimulacije citokinima, što se koristi za razvoj novih ex vivo i in vivo metoda za induciranje antitumorske citotoksičnosti limfoidnih elemenata transplantata za naknadnu imunoterapiju. Osim toga, „nezrelost“ genoma imunokompetentnih stanica iz pupkovine omogućuje im da se koriste za pojačavanje antitumorske aktivnosti korištenjem metoda molekularnog modeliranja.

Danas je pupkovina pronašla široku primjenu prvenstveno u dječjoj hematologiji. Kod djece s akutnom leukemijom, alotransplantacija hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine, u usporedbi s alotransplantacijom koštane srži, značajno smanjuje učestalost reakcije presatka protiv primatelja. Međutim, to je popraćeno duljim razdobljem neutro- i trombocitopenije te, nažalost, višom stopom smrtnosti nakon transplantacije. Dulje razdoblje oporavka razine granulocita i trombocita u perifernoj krvi može biti posljedica nedovoljne diferencijacije pojedinih subpopulacija CD34-pozitivnih stanica iz pupkovine, što dokazuje niska razina apsorpcije radioaktivnog rodamina i niska ekspresija CD38 antigena na njihovoj površini.

Istodobno, transplantacija hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine odraslim pacijentima, provedena zbog odsutnosti i kompatibilnog nesrodnog donora koštane srži i mogućnosti mobilizacije autolognih HSC-a, pokazala je visoko jednogodišnje preživljavanje bez recidiva u skupini pacijenata mlađih od 30 godina (73%). Proširenje dobnog raspona primatelja (18-46 godina) dovelo je do smanjenja preživljavanja na 53%.

Kvantitativna analiza stanica s fenotipom CD34+ u koštanoj srži i krvi iz pupkovine otkrila je njihov veći (3,5 puta) sadržaj u koštanoj srži, ali je u krvi iz pupkovine uočena značajna prevlast stanica s fenotipskim profilom CD34+HLA-DR. Poznato je da krvne stanice s imunološkim markerima CD34+HLA-DR proliferiraju aktivnije od stanica s imunofenotipom CD34+HLA-DR+, što je potvrđeno u eksperimentalnim studijama rasta dugotrajne kulture hematopoetskih stanica in vitro. Primitivni stanični prekursori s fenotipom CD34+CD38 nalaze se i u krvi iz pupkovine i u koštanoj srži, ali stanice iz krvi iz pupkovine s markerima CD34+CD38 imaju veću klonogenu aktivnost od hematopoetskih stanica istog fenotipa izoliranih iz koštane srži odraslih donora. Osim toga, stanice pupkovine s imunofenotipom CD34+CD38 brže proliferiraju kao odgovor na stimulaciju citokinima (IL-3, IL-6, G-CSF) i proizvode 7 puta više kolonija u dugotrajnim kulturama nego stanice koštane srži.

Banke matičnih stanica iz pupkovine

Za pravilan razvoj novog područja praktične medicine - transplantacije matičnih stanica iz pupkovine, kao i za provedbu transplantacije hematopoetskih matičnih stanica koštane srži, potrebno je imati opsežnu mrežu banaka krvi, koje su već stvorene u SAD-u i Europi. Domaće mreže banaka krvi iz pupkovine ujedinjuje Udruga Netcord Bank. Izvodljivost stvaranja međunarodne udruge banaka krvi iz pupkovine određena je činjenicom da je za izvođenje nesrodnih transplantacija potreban veliki broj tipiziranih uzoraka krvi iz pupkovine, što omogućuje odabir HLA-identičnog donora. Samo uspostava sustava banaka s pohranom uzoraka krvi različitih HLA tipova može stvarno riješiti problem pronalaska potrebnog donora. Organizacija takvog sustava banaka krvi iz pupkovine zahtijeva prethodni razvoj etičkih i pravnih normi, o kojima se trenutno raspravlja na međunarodnoj razini.

Za stvaranje banaka krvi iz pupkovine u Ukrajini potrebno je izraditi cijeli niz propisa i dokumenata.

Prije svega, to su pitanja standardizacije metoda prikupljanja, frakcioniranja i zamrzavanja krvi iz pupkovine. Potrebno je regulirati pravila prikupljanja krvi iz pupkovine u rodilištima u skladu sa zahtjevima medicinske etike, odrediti minimalni volumen krvi iz pupkovine koji osigurava uspješnu transplantaciju. Potrebno je usporediti i standardizirati različite kriterije za procjenu kvalitete i količine hematopoetskih progenitorskih stanica, kao i metode HLA tipizacije i dijagnostičke metode za genetske i zarazne bolesti koje se mogu prenijeti tijekom infuzije stanica krvi iz pupkovine, kako bi se utvrdili zajednički kriteriji za odabir zdravih darivatelja. Također vrijedi raspraviti o pitanjima stvaranja odvojenih skladišta za serum, stanice i DNK dobivene iz krvi iz pupkovine.

Apsolutno je potrebno organizirati računalnu mrežu podataka o pupkovini kako bi se povezala s registrima darivatelja koštane srži. Za daljnji razvoj transplantacije stanica potrebno je razviti posebne protokole za usporedbu rezultata transplantacije pupkovine i koštane srži od HLA-identičnih srodnika i nesrodnih darivatelja. Standardizacija dokumentacije, uključujući informirani pristanak roditelja, kao i obavještavanje majke ili rodbine o genetskim i/ili zaraznim bolestima otkrivenim kod djeteta, može pomoći u rješavanju etičkih i pravnih problema kliničke upotrebe stanica pupkovine.

Odlučujući uvjet za razvoj transplantacije stanica u Ukrajini bit će usvajanje Nacionalnog programa doniranja matičnih stanica i razvoj međunarodne suradnje s drugim zemljama putem Svjetskog udruženja donora srži (WMDA), Američkog nacionalnog programa doniranja srži (NMDP) i drugih registara.

Sažimajući još uvijek kratku povijest razvoja transplantacije hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine, napominjemo da su prve pretpostavke o mogućnosti korištenja krvi iz pupkovine u klinici, izražene još početkom 70-ih, potvrđene 80-ih godina rezultatima eksperimentalnih studija na životinjama, a 1988. godine provedena je prva transplantacija hematopoetskih stanica iz krvi iz pupkovine na čovjeka, nakon čega se počela stvarati globalna mreža banaka krvi iz pupkovine. Za 10 godina broj pacijenata s transplantiranim hematopoetskim stanicama iz krvi iz pupkovine približio se 800. Među njima su bili pacijenti s raznim bolestima tumorske (leukemija, limfom, solidni tumori) i netumorske (kongenitalne imunodeficijencije, anemija, bolesti povezane s metaboličkim poremećajima) prirode.

Sadržaj ranih i predanih staničnih prekursora u krvi iz pupkovine veći je nego u perifernoj krvi odrasle osobe. Što se tiče broja jedinica koje stvaraju kolonije granulocita-makrofaga i njihovog proliferativnog potencijala, krv iz pupkovine značajno premašuje perifernu krv odraslih čak i nakon uvođenja faktora rasta. U dugotrajnim staničnim kulturama in vitro zabilježena je veća proliferativna aktivnost i vijabilnost stanica krvi iz pupkovine nego stanica koštane srži. Kritični trenuci u transplantaciji matičnih stanica iz krvi iz pupkovine su broj i hematopoetski potencijal stanica s jezgrom, prisutnost infekcije citomegalovirusom, HLA kompatibilnost darivatelja i primatelja, tjelesna težina i dob pacijenta.

Međutim, transplantaciju matičnih stanica iz pupkovine treba razmotriti kao alternativu transplantaciji koštane srži za liječenje teških bolesti krvi, prvenstveno kod djece. Klinički problemi transplantacije stanica iz pupkovine postupno se rješavaju - već postoje prilično učinkovite metode za prikupljanje, odvajanje i krioprezervaciju stanica iz pupkovine, osiguravaju se uvjeti za formiranje banaka iz pupkovine, a poboljšavaju se i metode testiranja stanica s jezgrom. 3%-tna otopina želatine i 6%-tna otopina hidroksietil škroba trebaju se smatrati optimalnima za odvajanje tijekom nabave hematopoetskih matičnih stanica iz pupkovine u velikim razmjerima prilikom stvaranja banaka.

P. Perekhrestenko i koautori (2001.) s pravom primjećuju da transplantacija matičnih stanica iz pupkovine treba zauzeti svoje zasluženo mjesto u kompleksu terapijskih mjera za prevladavanje hematopoetskih depresija različite geneze, budući da matične stanice iz pupkovine imaju niz značajnih prednosti, među kojima su najvažnije relativna jednostavnost njihovog dobivanja, odsutnost rizika za darivatelja, niska kontaminacija neonatalnih stanica virusima i relativno niska cijena transplantacije. Neki autori ističu da je transplantacija stanica iz pupkovine rjeđe popraćena komplikacijama povezanim s reakcijom presatka protiv domaćina nego transplantacija stanica koštane srži, što je, prema njihovom mišljenju, posljedica slabe ekspresije HLA-DR antigena na stanicama iz pupkovine i njihove nezrelosti. Međutim, glavna populacija nuklearnih stanica u pupkovini su T limfociti (CD3-pozitivne stanice), čiji je sadržaj oko 50%, što je 20% manje nego u perifernoj krvi odrasle osobe, ali fenotipske razlike u subpopulacijama T stanica iz tih izvora su beznačajne.

Među čimbenicima koji izravno utječu na stopu preživljavanja kod transplantacije matičnih stanica iz pupkovine, vrijedi istaknuti dob pacijenata (najbolji rezultati uočeni su kod primatelja u dobi od jedne do pet godina), ranu dijagnozu bolesti i oblik leukemije (učinkovitost je značajno veća kod akutne leukemije). Od velike važnosti su doza nuklearnih stanica iz pupkovine, kao i njihova HLA kompatibilnost s primateljem. Nije slučajno da analiza kliničke učinkovitosti transplantacije HSC-a iz pupkovine u onkohematologiji pokazuje najbolje rezultate liječenja pri korištenju srodnih transplantata: jednogodišnje preživljavanje bez recidiva u ovom slučaju doseže 63%, dok kod nesrodne transplantacije - samo 29%.

Dakle, prisutnost velikog broja matičnih stanica u krvi pupkovine i visoki kapacitet repopulacije neonatalnih hematopoetskih matičnih stanica omogućuju njihovu upotrebu za alogenu transplantaciju kod onkohematoloških pacijenata. Međutim, treba napomenuti da je obnova hematopoeze nakon transplantacije hematopoetskih stanica iz krvi pupkovine „rastegnuta u vremenu“: obnova sadržaja neutrofila u perifernoj krvi obično se opaža do kraja 6. tjedna, a trombocitopenija obično nestaje nakon 6 mjeseci. Osim toga, nezrelost hematopoetskih stanica iz krvi pupkovine ne isključuje imunološke sukobe: teška akutna i kronična bolest presatka protiv domaćina opaža se u 23 odnosno 25% primatelja. Recidivi akutne leukemije do kraja prve godine nakon transplantacije stanica iz krvi pupkovine zabilježeni su u 26% slučajeva.

[ 10 ], [ 11 ]