Molekularne genetske metode za dijagnozu nasljednih bolesti

Metode DNA tehnologije koriste se za određivanje lokalizacije u određenom kromosomu mutantnog gena koji je odgovoran za podrijetlo određenih oblika nasljedne patologije. Budući da je gen je segment DNK i genske mutacije - štetu na primarne strukture DNA (mutacija je razumjeti sve promjene u DNA sekvence, bez obzira na njihov položaj i utjecaj na pojedinca održivosti), a zatim sondiranje preparati metafaza pacijenata kromosoma nasljedna bolest, moguće utvrditi lokalizacija patološkog gena. Metode molekularne genetike stvaraju mogućnosti za dijagnosticiranje bolesti na razini promijenjene strukture DNA, omogućuju otkrivanje lokalizacije nasljednih poremećaja. Molekularne genetske metode mogu otkriti mutacije povezane s zamjenom čak i jedne baze.

Najvažnija faza identifikacije gena jest njegova izolacija. DNA se može izolirati iz bilo kojeg tipa tkiva i stanica koje sadrže jezgre. Koraci izolacije DNA uključuju brzo lizu stanica centrifugiranjem uz uklanjanje fragmenata staničnih organela i membrane, enzimske uništavanje proteina i njihove ekstrakcije iz otopine sa fenolom i kloroformom, koncentracija DNA taloženjem u etanolu.

U genetskim laboratorijima DNA se najčešće izolira iz krvnih leukocita, za koje se pacijentu uzima 5-20 ml venske krvi u sterilnoj epruveti s antikoagulansnom otopinom (heparin). Zatim se leukociti razdvoje i obrade u skladu s gore opisanim koracima.

Sljedeća faza materijala priprema za studije - DNK „cut” u fragmenata na mjestima sa strogo određenu baznu sekvence se izvodi pomoću bakterijskim enzimima restrikcije endonukleaze - (restrikcijski enzimi). Restrikcijski enzimi prepoznaju specifične sekvence 4-6, najmanje 8-12 nukleotida u dvostruke uzvojnice DNA molekula i njegove odvojene u fragmentima ovih sekvenci lokalizirati nalazišta restrikcijska mjesta. Broj proizvedenih restrikcijskih DNA fragmenata određen je učestalosti restrikcijskih mjesta, a veličina fragmenata određena je raspodjelom ovih mjesta duž duljine originalne DNA molekule. Što su češće mjesta za restrikcije smještena, kraći fragmenti DNA nakon ograničenja. Trenutno je poznato više od 500 različitih vrsta restrikcijskih enzima bakterijskog porijekla, a svaki od tih enzima prepoznaje njegovu specifičnu sekvencu nukleotida. U budućnosti, restrikcijska mjesta mogu se koristiti kao genetički markeri za DNA. DNA fragmenti nastali kao posljedica ograničenja mogu se naručiti duž duljine pomoću elektroforeze u agaroznom ili poliakrilamidnom gelu, pa se njihova molekularna težina može odrediti. Obično se specifično bojenje (češće etidij bromid) koristi za otkrivanje DNA u gelu i gel se promatra u prenesenom svjetlu ultraljubičastog područja spektra. Lokacije DNA lokalizacije imaju crvenu boju. Međutim, osoba u obradi nekoliko DNA ograničavanja endonukleaze formirana je toliko fragmente različitih duljina koje oni ne mogu odvojiti pomoću elektroforeze, to nije moguće vizualno utvrditi pojedinačne DNA fragmenata na electrophoregram (proizvedenog ujednačenu boju cijelom dužinom gela). Stoga se koristi hibridizacijska metoda sa obilježenim DNK sondama za identificiranje željenih fragmenata DNA u takvom obliku gela.

Bilo koji jednostruki segment DNA ili RNA sposoban je vezati (hibridizirati) na svoj komplementarni lanac, a gvanin je uvijek povezan s citozinom, adeninom i timimom. Ovo je stvaranje dvolančane molekule. Ako je jednolančana kopija kloniranog gena obilježena radioaktivnom oznakom, dobit će se sonda. Sonda je u mogućnosti pronaći komplementarni segment DNA, koji se zatim lako identificira radioautografijom. Radioaktivna sonda koja je dodana lijeku rastegnutih kromosoma dopušta da se gena lokalizira na određenom kromosomu: određeni uzorci DNA mogu se identificirati s DNA probom u Southern blottingu. Hibridizacija se javlja ako testni dio DNA sadrži normalan gen. U slučaju da postoji abnormalna sekvenca nukleotida, tj. Odgovarajuće kromosomske strukture sadrže mutantni gen, hibridizacija se neće pojaviti, što omogućuje određivanje lokalizacije patološkog gena.

Za dobivanje DNK probe koristi se metoda kloniranja gena. Suština metode se sastoji u tome DNA fragment koji odgovara svakom genu ili regiju gena umetnutog u čestice kloniranja, obično bakterijske plazmid (kružni ekstrakromosomski DNA prisutnom u bakterijskim stanicama, a koji nosi gene za rezistenciju na antibiotike), a zatim bakterije koji imaju plazmid s ugrađenim ljudskim genom, množe se. Zbog procesa sinteze mogu se dobiti plazmid milijarde kopija ljudskog gena ili njegov dio.

Nadalje, DNA kopije obilježene radioaktivnom oznakom ili fluorokromima koriste se kao probe za traženje komplementarnih sekvenci među skupinom istraživanih DNA molekula.

Trenutno postoje mnoge vrste metoda koje koriste DNA probe za dijagnozu mutacija gena.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],