Molekularno-genetske metode za dijagnosticiranje nasljednih bolesti

Metode DNA tehnologije koriste se za određivanje lokalizacije mutiranog gena u određenom kromosomu, odgovornog za nastanak određenih oblika nasljedne patologije. Budući da je gen dio DNA, a genska mutacija oštećenje primarne strukture DNA (mutacija se shvaća kao sve promjene u slijedu DNA, bez obzira na njihovu lokalizaciju i utjecaj na održivost pojedinca), tada je, ispitivanjem preparata metafaznih kromosoma pacijenta s nasljednom bolešću, moguće utvrditi lokalizaciju patološkog gena. Molekularno genetske metode stvaraju mogućnosti za dijagnosticiranje bolesti na razini promijenjene strukture DNA, omogućuju nam određivanje lokalizacije nasljednih poremećaja. Molekularno genetske metode mogu identificirati mutacije povezane sa zamjenom čak i jedne baze.

Najvažnija faza identifikacije gena je njegova izolacija. DNA se može izolirati iz bilo koje vrste tkiva i stanica koje sadrže jezgre. Faze izolacije DNA uključuju: brzu lizu stanica, uklanjanje fragmenata staničnih organela i membrana centrifugiranjem, enzimsko uništavanje proteina i njihovu ekstrakciju iz otopine pomoću fenola i kloroforma, koncentriranje molekula DNA taloženjem u etanolu.

U genetskim laboratorijima, DNA se najčešće izolira iz leukocita u krvi, za što se od pacijenta uzima 5-20 ml venske krvi u sterilnu epruvetu s otopinom antikoagulansa (heparin). Zatim se leukociti odvajaju i obrađuju prema gore navedenim koracima.

Sljedeća faza pripreme materijala za istraživanje je „rezanje“ DNK na fragmente u područjima sa strogo specifičnim baznim slijedom, što se provodi pomoću bakterijskih enzima - restrikcijskih endonukleaza (restrikcijskih enzima). Restrikcijski enzimi prepoznaju specifične slijedove od 4-6, rjeđe 8-12 nukleotida u dvolančanoj molekuli DNK i dijele je na fragmente na mjestima tih slijedova, nazvanih restrikcijska mjesta. Broj rezultirajućih restrikcijskih fragmenata DNK određen je učestalošću pojavljivanja restrikcijskih mjesta, a veličina fragmenata određena je prirodom raspodjele tih mjesta duž duljine izvorne molekule DNK. Što se češće nalaze restrikcijska mjesta, to su fragmenti DNK nakon restrikcije kraći. Trenutno je poznato više od 500 različitih vrsta restrikcijskih enzima bakterijskog podrijetla, a svaki od ovih enzima prepoznaje svoj specifični nukleotidni slijed. U budućnosti se restrikcijska mjesta mogu koristiti kao genetski markeri DNK. Fragmenti DNK nastali kao rezultat restrikcije mogu se poredati po duljini elektroforezom u agaroznom ili poliakrilamidnom gelu, te se tako može odrediti njihova molekularna težina. Tipično, DNA u gelu se identificira specifičnim bojenjem (obično etidij bromid) i promatranjem gela u propuštenom ultraljubičastom svjetlu. Mjesta lokalizacije DNA obojena su crveno. Međutim, kod ljudi, kada se DNA obrađuje s nekoliko restrikcijskih enzima, nastaje toliko fragmenata različitih duljina da se ne mogu odvojiti elektroforezom, tj. nije moguće vizualno identificirati pojedinačne fragmente DNA na elektroforezi (dobiva se ujednačeno bojenje duž cijele duljine gela). Stoga se za identifikaciju željenih fragmenata DNA u takvom gelu koristi metoda hibridizacije s obilježenim DNA probama.

Bilo koji jednolančani segment DNA ili RNA sposoban je za vezanje (hibridizaciju) s komplementarnim lancem, pri čemu se gvanin uvijek veže za citozin, a adenin za timin. Tako nastaje dvolančana molekula. Ako se jednolančana kopija kloniranog gena označi radioaktivnom oznakom, dobiva se sonda. Sonda je sposobna pronaći komplementarni segment DNA, koji se zatim lako identificira pomoću autoradiografije. Radioaktivna sonda dodana u pripravak rastegnutih kromosoma omogućuje lokalizaciju gena na specifičnom kromosomu: pomoću DNA sonde mogu se identificirati specifična područja tijekom Southern blottinga. Hibridizacija se događa ako testirani dio DNA sadrži normalni gen. U slučaju kada je prisutan abnormalni nukleotidni slijed, tj. odgovarajuće kromosomske strukture sadrže mutantni gen, hibridizacija se neće dogoditi, što omogućuje određivanje lokalizacije patološkog gena.

Za dobivanje DNA sondi koristi se metoda kloniranja gena. Bit metode je da se fragment DNA koji odgovara genu ili dijelu gena umetne u česticu za kloniranje, obično bakterijski plazmid (prstenasta ekstrakromosomska DNA prisutna u bakterijskim stanicama i nosi gene otpornosti na antibiotike), a zatim se bakterije s plazmidom s umetnutim ljudskim genom umnožavaju. Zahvaljujući procesima sinteze u plazmidu mogu se dobiti milijarde kopija ljudskog gena ili njegovog dijela.

Dobivene kopije DNK, označene radioaktivnom oznakom ili fluorokromima, zatim se koriste kao sonde za traženje komplementarnih sekvenci među proučavanim skupom molekula DNK.

Trenutno postoji mnogo različitih vrsta metoda koje koriste DNA sonde za dijagnosticiranje genskih mutacija.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]