Dijagnoza mitohondrijskih bolesti

Procjena prirode nasljeđivanja i manifestacije kliničkih znakova mitohondrijskih bolesti

Budući da miotohondrijske bolesti u nekim slučajevima mogu biti uzrokovane oštećenjem nuklearnog genoma, prijenos bolesti odgovarat će Mendelovim zakonima nasljeđivanja. U onim slučajevima kada je razvoj bolesti uzrokovan mutacijama u mitohondrijskoj DNA, nasljeđivanje će odgovarati mitohondrijskom tipu, odnosno prenosit će se majčinom linijom. Konačno, kada se patologija razvije uz istovremeni gubitak gena nuklearnog i mitohondrijskog genoma, nasljeđivanje će biti složeno i određeno različitim čimbenicima. U tom smislu, u genealoškoj analizi prema formalnoj značajki (priroda nasljeđivanja prema rodovniku) moguće je navesti najrazličitije vrste nasljeđivanja: autosomno dominantno, autosomno recesivno, X-vezano, mitohondrijsko.

Razvoj miotohondrijskih bolesti poput poremećaja metabolizma piruvične kiseline ili beta-oksidacije masnih kiselina, Krebsovog ciklusa, povezan je s mutacijama gena nuklearnog genoma. Ove patologije karakterizira autosomno recesivno nasljeđivanje, kada su roditelji nositelji mutacija (heterozigoti), a dijete je nositelj obje nasljedne mutacije primljene od oca i majke (homozigot). Roditelji su obično izvana zdravi, a sličnu bolest ili njezine mikroznakove treba tražiti kod braće i sestara bolesnog djeteta (proband sibs) te kod rođaka s majčine i očeve strane (rođaci).

U slučaju recesivnog, X-vezanog tipa nasljeđivanja (npr. neonatalna glutarna acidurija tip II ili nedostatak E1 podjedinice piruvičnog kompleksa, Menkesova bolest itd.), dječaci su češće pogođeni, a majke su nositeljice mutacija i prenose ih na sinove. Majčino nasljeđivanje razlikuje se od X-vezanog nasljeđivanja po tome što su pogođena oba spola. U tim slučajevima, prilikom analize rodovnika, potrebno je analizirati učestalost bolesti kod muškaraca, budući da se neće manifestirati kod žena. Rodovnik ne pokazuje prijenos bolesti po liniji otac-sin, budući da otac može prenijeti samo Y kromosom na sina.

Kada se bolest razvije zbog oštećenja mitohondrijskog genoma (na primjer, niz bolesti respiratornog lanca, Leberova optička neuropatija, MELAS, MERF, NARP sindromi itd.), prati se majčino nasljeđivanje, budući da dijete nasljeđuje mitohondrije od majke, a ona ih može prenijeti i na dječake i na djevojčice. Dakle, oba spola su podjednako pogođena. U tom smislu, prijenos bolesti duž majčine linije treba pratiti u rodovniku.

Prilikom analize obiteljskog stabla i traženja simptoma mitohondrijskih bolesti kod rođaka, treba imati na umu da težina bolesti (izražajnost znaka) može uvelike varirati, što može biti posljedica različitog broja oštećenih mitohondrija, prirode njihovog oštećenja, različite raspodjele mutacija u stanicama itd. Stoga nije uvijek moguće otkriti očite znakove bolesti. U nekim slučajevima otkrivaju se ili pojedinačni, izbrisani simptomi ili znakovi koji se mogu otkriti tijekom njihovog ciljanog pretraživanja.

Razvoj mitohondrijske patologije može biti povezan s oštećenjem velikih područja mitohondrija, takozvanim mikrodelecijama (na primjer, Kearns-Sayreov sindrom, Pearsonov sindrom, neki oblici dijabetesa melitusa s gluhoćom, progresivna vanjska oftalmoplegija itd.). U tim slučajevima karakteristični simptomi se često ne nalaze kod rođaka, budući da je razvoj bolesti povezan s pojavom novih mutacija koje su se dogodile u zigoti neposredno nakon oplodnje jajne stanice ( de novo mutacija). Bolest je sporadična. Često se uz ove bolesti nasljeđuje autosomno dominantno niz stanja povezanih s višestrukim mutacijama mitohondrijske DNA: na primjer, neki oblici encefalomiopatije, miopatije s oštećenjem oka, unatoč prisutnosti mutacija mtDNA (višestruke delecije), imaju autosomno dominantni tip nasljeđivanja.

Međutim, za razliku od Mendelovog nasljeđivanja, autosomno dominantni tip nasljeđivanja u mitohondrijskoj patologiji karakterizira veliki broj pogođenih osoba u sljedećim generacijama.

Konačno, neke mitohondrijske bolesti, često povezane s iscrpljivanjem mtDNA mitohondrija ili njihovom odsutnošću u stanicama, mogu se nasljeđivati autosomno recesivnim putem. To uključuje kongenitalne oblike miopatije, kardiomiopatije, neurodistres sindroma, laktične acidoze, oštećenja jetre itd.

Proučavanje prirode nasljednog prijenosa bolesti važno je za medicinsku i genetsku prognozu te zahtijeva dubinsku analizu kliničkih znakova uz poznavanje mehanizama nastanka mitohondrijske patologije i vrsta njezinog nasljeđivanja.

Manifestacija kliničkih manifestacija uvelike varira od prvih dana života do odrasle dobi. Prilikom analize ovog pokazatelja potrebno je uzeti u obzir nozološke oblike, budući da svaki od njih ima određenu dob debija.

Metabolički poremećaji uočeni kod mitohondrijskih bolesti su progresivni u velikoj većini slučajeva. Početni simptomi su često blagi, zatim napreduju i mogu dovesti do značajnih invalidizirajućih poremećaja. Rijetki oblici patologije, poput benigne infantilne miopatije i nekih oblika Leberove optičke neuropatije, mogu biti benigni i podložni regresiji.

Tijekom laboratorijskih ispitivanja, pozornost se posvećuje karakterističnim znakovima mitohondrijskih bolesti:

• prisutnost acidoze;
• povišene razine laktata i piruvata u krvi, porast indeksa laktat/piruvat za više od 15, posebno povećanje s opterećenjem glukozom ili tjelesnom aktivnošću;
• hiperketonemija;
• hipoglikemija;
• hiperamonemija;
• povećane koncentracije acetoacetata i 3-hidroksibutirata;
• povećan omjer 3-hidroksimaslačne kiseline i acetooctene kiseline u krvi;
• povećane razine aminokiselina u krvi i urinu (alanin, glutamin, glutaminska kiselina, valin, leucin, izoleucin);
• povišene razine masnih kiselina u krvi;
• hiperekskrecija organskih kiselina u urinu;
• smanjena razina karnitina u krvi;
• povećanje sadržaja mioglobina u biološkim tekućinama;
• smanjena aktivnost mitohondrijskih enzima u miocitima i fibroblastima.

Dijagnostička vrijednost ovih pokazatelja je veća kod opterećenja hranom nego na prazan želudac. U praksi se dobro pokazao dijagnostički test: određivanje laktata u krvi na pozadini opterećenja glukozom, što omogućuje jasnije otkrivanje neuspjeha respiratornog lanca na dodatno opterećenje glukozom.

Za laboratorijsku dijagnostiku mitohondrijske disfunkcije i njezinih specifičnih nozoloških oblika, konvencionalne, rutinske biokemijske metode istraživanja nisu dovoljne; potrebno je provesti posebne testove. Posebno je pogodnije analizirati aktivnost enzima u biopsijama skeletnih mišića nego u drugim tkivima. Moguće je odrediti aktivnost enzima respiratornog lanca, posebno citrat sintetaze, sukcinat dehidrogenaze i citokrom C oksidaze.

Podaci iz morfoloških i molekularno-genetskih studija

Morfološke studije su od posebne važnosti u dijagnostici mitohondrijske patologije. Zbog njihove velike informativne vrijednosti često je potrebna biopsija mišićnog tkiva i histokemijski pregled dobivenih biopsija. Važne informacije mogu se dobiti istovremenim pregledom materijala svjetlosnom i elektronskom mikroskopijom.

Jedan od važnih markera mitohondrijskih bolesti je fenomen "raščupanih" crvenih vlakana [RRF fenomen (ragged red fibres)], utvrđen 1963. godine. Povezan je s nastankom genetski promijenjenih abnormalnih mitohondrija duž ruba mišićnog vlakna zbog proliferacije i fokalne akumulacije. Ovaj fenomen se detektira svjetlosnom mikroskopijom pomoću posebnog Gomorijevog bojenja, ali posljednjih godina u tu svrhu koriste se različiti mitohondrijski markeri i različite imunološke metode.

Ostali morfološki znakovi mitohondrijske patologije uključuju:

• naglo povećanje veličine mitohondrija;
• nakupljanje glikogena, lipida i kalcijevih konglomerata u subsarkolemmi;
• smanjena aktivnost mitohondrijskih enzima;
• poremećena raspodjela granula aktivnosti enzima sukcinat dehidrogenaze (SDH), NADH oksidoreduktaze, citokrom C oksidaze itd.

Kod pacijenata s mitohondrijskim bolestima, svjetlosna mikroskopija mišićnog tkiva može otkriti nespecifične morfološke znakove: lokalnu nekrozu mišićnih vlakana, nakupljanje sarkoplazmatskih masa, prisutnost lize subsarkolemalnih područja sarkoplazme, bazofiliju sarkoplazme, povećan broj mišićnih jezgri, aktivaciju procesa regeneracije itd.

Proučavanje uloge fenomena "iskidanih" crvenih vlakana pokazalo je njegovu važnost za dijagnozu stanja poput MELAS-a, MERRF-a, Kearns-Sayreovog sindroma, kronične progresivne oftalmoplegije i drugih povezanih s mutacijama mtDNK. Ovaj fenomen može se razviti i kod drugih bolesti: Duchenneove mišićne distrofije, dermatomiozitisa, miotoničke distrofije, uzimanja lijekova (klofibrata) i drugih patoloških stanja. Dakle, uz primarne mitohondrijske bolesti, fenomen RRF-a može pratiti sekundarne mitohondrijske disfunkcije.

Trenutno su histokemijski i elektronsko-mikroskopski pregledi mišićnog tkiva radi otkrivanja znakova mitohondrijske insuficijencije postali široko rasprostranjeni. U nekim slučajevima pomažu u dijagnozi, posebno kod normalne morfološke slike mišićnog tkiva prema podacima svjetlosne mikroskopije.

Elektronski mikroskopski znakovi - otkrivanje proliferacije mitohondrija, poremećaj njihovog oblika i veličine, dezorganizacija i povećanje krista, nakupljanje abnormalnih mitohondrija ispod sarkolemme, nakupljanje lipida i abnormalnih parakristalnih (uglavnom se sastoje od proteina) ili osmofilnih inkluzija lokaliziranih između unutarnje i vanjske membrane ili unutar krista, sferni nakupini, često smješteni u matriksu (uglavnom se sastoje od triglicerida) itd.

Kod nekih pacijenata mogu se otkriti citokemijske abnormalnosti u leukocitima.

Kompleks biokemijskih i morfoloških studija nadopunjuje se suvremenim metodama molekularne dijagnostike (detekcija nuklearnih ili mitohondrijskih mutacija), koje se provode u specijaliziranim laboratorijima za DNA dijagnostiku. Kod mitohondrijskih bolesti otkrivaju se različite vrste mutacija: točkaste mutacije, delecije, duplikacije, kvantitativne anomalije DNA itd.

U odsutnosti mutacija u mtDNA, ako se sumnja na mitohondrijsku patologiju, provodi se studija nuklearne DNK.

Dijagnostički kriteriji

Postoje 2 skupine dijagnostičkih kriterija za mitohondrijske bolesti. Glavni dijagnostički kriteriji (prva skupina).

• Klinički:
  • utvrđene dijagnoze: MERRF, MELAS, NARP, MNGIE, Pearsonovi sindromi, Leberova neuropatija, Leighova i Alpersova bolest;
  • prisutnost 2 ili kombinacije sljedećih znakova:
    • multisistemska lezija, patognomonična za bolesti dišnog lanca;
    • progresivni tijek s epizodama pogoršanja ili prisutnošću mitohondrijskih mutacija u obitelji;
    • isključenje metaboličkih i drugih bolesti provođenjem odgovarajućih testova.
• Histološki - otkrivanje RRF fenomena u više od 2% mišićnog tkiva.
• Enzimski:
  • vlakna negativna na citokrom c oksidazu;
  • smanjena aktivnost enzima respiratornog lanca (<20% normalne vrijednosti u tkivu, <30% u stanicama ili nekoliko tkiva).
• Funkcionalno - smanjenje sinteze ATP-a u fibroblastima za više od 3 standardne devijacije.
• Molekularno genetske - patogenetski značajne mutacije nuklearne ili mtDNA.

Dodatni dijagnostički kriteriji (druga skupina).

• Klinički - nespecifični simptomi koji se javljaju kod bolesti dišnog lanca (mrtvorođenče, smanjena motorička aktivnost fetusa, rana neonatalna smrt, poremećaji kretanja, razvojni poremećaji, oštećen mišićni tonus u neonatalnom razdoblju).
• Histološki - mali postotak RRF fenomena, subsarkolemalna akumulacija mitohondrija ili njihove anomalije.
• Enzimski - niska aktivnost enzima respiratornog kompleksa (20-30% norme u tkivu, 30-40% u stanicama ili staničnim linijama).
• Funkcionalno - smanjenje sinteze ATP-a u fibroblastima za 2-3 standardne devijacije ili odsutnost rasta fibroblasta u mediju s galaktozom.
• Molekularna genetika - otkrivanje mutacija u nuklearnoj ili mtDNA s pretpostavljenom patogenetskom vezom.
• Metabolički - otkrivanje jednog ili više metabolita što ukazuje na poremećaj u staničnoj bioenergetici.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]