Laboratorijska dijagnostika tuberkuloze

Tuberkuloza je bolest koju je u suvremenim uvjetima i znanstvenim dostignućima lako dijagnosticirati. Laboratorijska dijagnostika tuberkuloze zauzima središnje mjesto među ostalim dijagnostičkim metodama, odmah iza rendgenskih metoda pregleda.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Klinički test krvi

Kod pacijenata s tuberkulozom, promjene u općoj krvnoj slici nisu patognomonične. Kod ograničenih i nisko aktivnih oblika tuberkuloze karakteristična je hipokromija eritrocita s normalnim brojem. Kod masivnih infiltrata ili kazeozne pneumonije, s raširenim kazeoznim limfadenitisom, specifičnim oštećenjem crijeva, kao i kod velikih plućnih ili postoperativnih krvarenja, primjećuju se eritropenija i mikrocitoza, oligokromazija, polikromazija. Makrocitoza, a posebno poikilocitoza, susreću se mnogo rjeđe, obično kod teške anemije. Broj retikulocita u kompenziranom stadiju tuberkuloze varira od 0,1 do 0,6%, u subkompenziranom stadiju - od 0,6 do 1,0%, a za dekompenzirani stadij karakteristično je 1% retikulocita.

U nekim slučajevima tuberkuloze može se uočiti umjerena leukocitoza (do 15 tisuća leukocita), rjeđe leukopenija, koja se javlja u 2-7% slučajeva kod pacijenata s ograničenim i blagim oblicima procesa te u 12,5% kod destruktivne i progresivne plućne tuberkuloze.

Najčešće se javljaju promjene u leukocitnoj formuli. Primjećuje se i relativna i apsolutna neutrofilija, umjereni pomak leukocitne formule ulijevo prema promijelocitima. Mijelociti se vrlo rijetko susreću u slučajevima nekomplicirane tuberkuloze. Povećanje broja neutrofila s patološkom granulacijom u hemogramu pacijenta s tuberkulozom uvijek ukazuje na trajanje procesa: kod pacijenata s teškom tuberkulozom gotovo svi neutrofili sadrže patološku granulaciju. Kada se epidemija tuberkuloze smiri, nuklearni pomak se relativno brzo vraća u normalu. Patološka granulacija neutrofila obično traje dulje od drugih promjena u hemogramu.

Sadržaj eozinofila u perifernoj krvi također fluktuira ovisno o fazi procesa i alergijskom stanju organizma. Njihov broj se smanjuje do aneozinofilije kod teških i dugotrajnih izbijanja bolesti i, obrnuto, povećava se tijekom resorpcije infiltrata i pleuralnog izljeva, kao i kod ranih oblika primarne tuberkuloze.

Većinu oblika primarne tuberkuloze prati limfopenija, koja se ponekad opaža i nekoliko godina čak i nakon ožiljavanja specifičnih promjena. Sekundarna tuberkuloza u akutnoj fazi, ovisno o težini procesa, može biti praćena ili normalnim brojem limfocita ili limfopenijom.

Među testovima za procjenu tuberkuloznog procesa, posebno mjesto zauzima određivanje brzine sedimentacije eritrocita (ESR), koja je važna u procjeni tijeka tuberkuloznog procesa i identificiranju njegovih aktivnih oblika. Povećanje ESR-a ukazuje na prisutnost patološkog procesa (infektivno-upalnog, gnojnog, septičkog, hemoblastoze, limfogranulomatoze itd.) i služi kao pokazatelj njegove težine, ali normalne vrijednosti ESR-a ne ukazuju uvijek na odsutnost patologije. Ubrzanje sedimentacije eritrocita olakšava se povećanjem sadržaja globulina, fibrinogena, kolesterola u krvi i smanjenjem viskoznosti krvi. Usporavanje sedimentacije eritrocita karakteristično je za stanja praćena hemokoncentracijom, povećanjem sadržaja albumina i žučnih kiselina.

Hemogram oboljelih od tuberkuloze mijenja se tijekom liječenja. Što je terapijska intervencija uspješnija, brže hematološke promjene nestaju. Istovremeno, treba imati na umu učinak različitih antibakterijskih lijekova na hematopoezu. Često uzrokuju eozinofiliju, u nekim slučajevima - leukocitozu, a češće leukopeniju do agranulocitoze i limfoidno-retikularnu reakciju. Sustavno hematološko praćenje i ispravna analiza dobivenih podataka bitni su za procjenu kliničkog stanja pacijenta, dinamike procesa i učinkovitosti liječenja.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Klinička analiza urina

U slučaju tuberkuloze mokraćnog sustava, analiza urina je glavna laboratorijska dijagnostička metoda. Može se uočiti leukociturija, eritrociturija, proteinurija, hipoizostenurija, tuberkulozna mikobakteriurija, nespecifična bakteriurija.

Leukociturija je najčešći simptom tuberkuloze mokraćnog sustava prije specifične kemoterapije i odsutna je samo u iznimnim slučajevima, kao što je potpuna obliteracija lumena uretera. Nechiporenkov test (određivanje broja leukocita u 1 ml urina) pomaže u objektivnijoj procjeni stupnja leukociturije kod nefrotuberkuloze, a u nekim slučajevima i u njenom otkrivanju normalnom općom analizom urina. Međutim, treba uzeti u obzir da se leukociturija može pojaviti kod akutnog i kroničnog pijelonefritisa, cistitisa, uretritisa, bubrežnih kamenaca i uretera.

Eritrociturija, kao i leukociturija, smatra se jednim od najčešćih laboratorijskih znakova genitourinarne tuberkuloze. Učestalost hematurije ovisi o prevalenciji procesa; povećava se kako se razvija destruktivni tuberkulozni proces u bubregu. Eritrociturija bez leukociturije tipičnija je za rane stadije bubrežne tuberkuloze. Hematurija, koja prevladava nad leukociturijom, važan je argument u korist bubrežne tuberkuloze pri razlikovanju od nespecifičnog pijelonefritisa.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biokemijski test krvi

Kod tuberkuloze, promjene nekih biokemijskih indeksa ovise prvenstveno o fazi procesa, komplikacijama i raznim popratnim bolestima. Kod pacijenata s neaktivnom tuberkulozom pluća i drugih organa, ukupni proteini i proteinske frakcije krvnog seruma nisu promijenjeni i određuju njihov normalan sadržaj.

U akutnim oblicima bolesti, kao i kod pogoršanja i progresije kroničnih oblika tuberkuloze, koeficijent albumin-globulina se smanjuje.

Od značajne važnosti u procjeni funkcionalnog stanja i organskog oštećenja jetre kod tuberkuloze i njezinih komplikacija ima određivanje izravnog i ukupnog bilirubina, aspartat aminotransferaze (AST), alanin aminotransferaze (ALT) u krvnom serumu. Dinamičko određivanje razine aminotransferaza. bilirubin u liječenju bolesnika s tuberkulozom, posebno u njezinim teškim oblicima, obavezna je komponenta biokemijskog pregleda bolesnika s tuberkulozom i provodi se mjesečno.

Procjena funkcionalnog stanja bubrega uključuje određivanje kreatinina u serumu i izračun brzine glomerularne filtracije pomoću Cockcroft-Gaultove formule. Izračun brzine glomerularne filtracije pomoću Rebergovog testa daje manje točne rezultate.

Glavni cilj dinamičkih biokemijskih studija pacijenata s tuberkulozom je praćenje tijeka procesa, pravovremeno otkrivanje nuspojava lijekova i adekvatna korekcija nastalih poremećaja homeostaze.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Primjena biokemijskih metoda istraživanja u ekstrapulmonalnoj tuberkulozi

Najinformativnijim pokazateljem smatra se sadržaj tuberkulostearinske kiseline u biološkim tekućinama, međutim, njegovo određivanje povezano je s tehničkim poteškoćama (potreba za korištenjem plinske kromatografije i masene spektrometrije).

Obećavajuće je mjerenje aktivnosti adenozin deaminaze - enzima koji se određuje u tekućinama: sinovijalnoj, perikardijalnoj, ascitetičnoj ili cerebrospinalnoj. Glavni proizvođači adenozin deaminaze su limfociti i monociti. Određivanje aktivnosti adenozin deaminaze u biološkim tekućinama olakšava dijagnozu tuberkuloznog sinovitisa, tuberkuloze limfnih čvorova, tuberkuloznog meningitisa, tuberkuloznog serozitisa.

Neki biokemijski pokazatelji, zbog svoje nespecifičnosti, određuju se samo u biološkim tekućinama blizu lezije. Razina pokazatelja mjeri se kao odgovor na subkutanu ili intradermalnu primjenu tuberkulina (obično prije primjene te 48 i 72 sata nakon nje). Nakon toga se izračunava stupanj porasta razine markera (u %) u odnosu na početnu razinu.

Optimalno, aktivnost organ-specifičnog enzima transamidinaze određuje se u urinu; njezina pojava primjećuje se kod oštećenja bubrega različitog podrijetla. Proučavanje transamidinaze opravdano je samo u uvjetima potkožne primjene tuberkulina kako bi se pogoršao lokalni upalni proces. Aktivnost transamidinaze određuje se u urinu inicijalno i 24-72 sata nakon primjene 50 TE tuberkulina. Povećanje fermenturije za 2 ili više puta omogućuje u 82% slučajeva razlikovanje aktivne tuberkuloze bubrega od pogoršanja kroničnog pijelonefritisa.

U slučaju tuberkuloze ženskih spolnih organa, koncentracije haptoglobina i malondialdehida u krvi određuju se pod uvjetima provokativnog tuberkulinskog testa. Tuberkulin se primjenjuje potkožno u dozi od 50 TE, a ponovljena biokemijska studija provodi se nakon 72 sata. U slučaju tuberkulozne etiologije, stupanj porasta razine haptoglobina je najmanje 28%, a razina malondialdehida je 39% ili više. Također se koristi određivanje aktivnosti adenozin deaminaze u peritonealnoj tekućini dobivenoj iz Douglasovog džepa. Punkcija se ponovno pregledava 72 sata nakon intradermalne primjene tuberkulina u dozama od 0,1 TE i 0,01 TE u području projekcije unutarnjih spolnih organa na prednju trbušnu stijenku. Povećanje aktivnosti adenozin deaminaze za 10% ili više u usporedbi s početnom vrijednošću ukazuje na tuberkulozni proces.

U slučaju oštećenja oka, ispituje se fokalna reakcija koja se javlja u oku kao odgovor na stimulaciju antigenom. U tom slučaju, razvoj oštro izraženog odgovora praćenog smanjenjem vidnih funkcija je nepoželjan. Budući da je procjena minimalnih fokalnih reakcija često teška, preporučuje se paralelno fokusiranje na stupanj porasta haptoglobina ili adenozin deaminaze u krvnom serumu kako bi se objektivizirao zaključak.

Sve biokemijske studije treba provoditi u kombinaciji s drugim metodama.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Proučavanje sustava koagulacije krvi

Relevantnost proučavanja stanja sustava koagulacije krvi u ftiziologiji posljedica je prisutnosti hemoptize ili plućnih krvarenja kod brojnih pacijenata s tuberkulozom pluća, kao i komplikacija hemokoagulacije u kirurškom liječenju tuberkuloze. Osim toga, prirodno prateća latentna intravaskularna hemokoagulacija utječe na tijek bolesti i učinkovitost kemoterapije.

U bolesnika s plućnom tuberkulozom s pretežno eksudativnom komponentom upale opaža se smanjenje antikoagulantne aktivnosti krvi. U bolesnika s niskom prevalencijom specifičnog oštećenja pluća s pretežno produktivnom komponentom upale, intravaskularna hemokoagulacija je neznatno izražena. U bolesnika s plućnom tuberkulozom s hemoptizom i plućnim krvarenjem, stanje sustava koagulacije krvi je drugačije: u bolesnika s manjim gubitkom krvi na vrhuncu hemoptoeje ili neposredno nakon njezina prestanka opaža se nagli porast koagulacijskog kapaciteta krvi zbog izraženog pojačanja procesa stvaranja trombina uz održavanje povećane "strukturne" koagulabilnosti. U bolesnika s masivnim gubitkom krvi opaža se smanjenje koagulacijskog potencijala zbog smanjenja koncentracije fibrinogena, aktivnosti faktora XIII i broja trombocita. U fazi kirurškog liječenja u bolesnika s ograničenim oblicima plućne tuberkuloze ne dolazi do značajnih poremećaja u sustavu homeostaze. U bolesnika s raširenim procesima, prilikom izvođenja pneumonektomije ili pleuropneumonektomije, često se razvija DIC sindrom, koji može poprimiti oblik "druge bolesti".

Za praćenje stanja sustava koagulacije krvi u bolesnika s plućnom tuberkulozom potrebno je odrediti aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTT), fibrinogen, trombinsko vrijeme, protrombinski indeks, kao i vrijeme krvarenja i vrijeme zgrušavanja krvi.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonske studije

Suvremena eksperimentalna i klinička opažanja ukazuju na prisutnost promjena hormonskog statusa kod specifične tuberkulozne upale pluća. Dokazano je da korekcija disfunkcije hipofizno-nadbubrežnog, hipofizno-tireoidnog sustava i funkcije gušterače u kombinaciji s antituberkuloznom terapijom doprinosi aktivaciji fibrogeneze i reparacijskih procesa u žarištu specifične upale.

Funkcionalno stanje hipofizno-štitnjačnog sustava procjenjuje se sadržajem trijodtironina (T3), tiroksina (T4) i hipofiznog tireostimulirajućeg hormona (TSH) u krvnom serumu _. Utvrđeno je _da se subklinički hipotireoidizam otkriva u 38-45% bolesnika s plućnom tuberkulozom, a najčešće se dijagnosticira kod diseminiranog i fibrozno-kavernoznog oblika procesa. U tim oblicima, razine i T3 i T4 su najoštrije smanjene _, a _neravnoteža ovih hormona javlja se u obliku povećanja _{omjera T4/} T3.

Funkcija kore nadbubrežne žlijezde procjenjuje se razinom kortizola u serumu, a endokrina funkcija gušterače koncentracijom imunoreaktivnog inzulina. U akutnoj fazi zarazne bolesti povećava se potreba za endogenim kortizolom i inzulinom. Hiperinzulinemija također ukazuje na inzulinsku rezistenciju tjelesnih tkiva, što je tipično za bilo koji aktivni upalni proces, a posebno specifični. Određivanje glukokortikoidne funkcije nadbubrežnih žlijezda kod aktivne plućne tuberkuloze omogućuje nam otkrivanje prisutnosti hiperkorticizma kod većine pacijenata. Normalne koncentracije kortizola u krvi kod pacijenta s infektivnom upalom u akutnom razdoblju treba smatrati relativnom insuficijencijom glukokortikoidne funkcije kore nadbubrežne žlijezde, što može poslužiti kao osnova za nadomjesnu terapiju adekvatnim dozama glukokortikoida.

Gotovo trećina pacijenata s plućnom tuberkulozom ima nisku razinu inzulinemije koja se približava donjoj granici norme, dok 13-20% ima značajan hiperinzulinizam. I relativni hipo- i hiperinzulinizam su visoki čimbenici rizika za razvoj poremećaja metabolizma ugljikohidrata različite težine. Ove promjene u funkcionalnoj aktivnosti B-stanica gušterače zahtijevaju redovito praćenje glikemije kod pacijenata s tuberkulozom i pravovremenu prevenciju dijabetesa melitusa. Osim toga, to služi kao dodatno opravdanje za prikladnost korištenja fizioloških doza inzulina u kompleksnoj terapiji tuberkuloze.

Općenito, smanjenje razine hormona štitnjače, njihov disbalans, hiperkortizolemija i hiperinzulinizam najizraženiji su kod pacijenata s teškim tijekom tuberkuloznog procesa, s opsežnim lezijama pluća i izraženim simptomima tuberkulozne intoksikacije.

Mikrobiološka dijagnostika tuberkuloze

Mikrobiološke studije su potrebne za identifikaciju pacijenata s tuberkulozom, provjeru dijagnoze, praćenje i ispravljanje kemoterapije, procjenu ishoda liječenja, drugim riječima, od trenutka kada je pacijent s tuberkulozom registriran do trenutka kada se ukloni iz registra.

Svi epidemiološki programi i projekti temelje se na procjeni broja bakterija izlučivača, što je nemoguće učiniti bez korištenja laboratorijskih metoda za otkrivanje mikobakterija tuberkuloze. Prilikom ispitivanja privlačnosti tzv. neorganiziranog stanovništva, postotak bakterija izlučivača doseže 70 ili više, što laboratorijske metode čini prilično učinkovitim sredstvom za identifikaciju pacijenata s tuberkulozom među ovom populacijskom skupinom.

Tradicionalne mikrobiološke metode dijagnosticiranja tuberkuloze su bakterioskopske i kulturne studije. Moderne metode uključuju kultiviranje mikobakterija tuberkuloze u automatiziranim sustavima i PCR. Međutim, sve se ove metode nužno kombiniraju s klasičnim bakteriološkim metodama.

Prikupljanje dijagnostičkog materijala

Učinkovitost laboratorijskih testova uvelike ovisi o kvaliteti dijagnostičkog materijala. Poštivanje pravila za prikupljanje, skladištenje i transport dijagnostičkog materijala te precizna provedba algoritma pregleda pacijenta izravno utječe na rezultat i osigurava biološku sigurnost.

Za testiranje na tuberkulozu koristi se niz materijala. Budući da je plućna tuberkuloza najčešći oblik tuberkulozne infekcije, glavnim materijalom za testiranje smatra se sputum i druge vrste traheobronhijalnog iscjetka: iscjedak gornjih dišnih putova dobiven nakon inhalacije aerosola: bronhijalne lavažne vode; bronhoalveolarni ispirci; materijal dobiven tijekom bronhoskopije, transtrahealne i intrapulmonalne biopsije: bronhijalni aspirat, razmazi grkljana, eksudati, razmazi rana itd.

Učinkovitost istraživanja povećava se ako se provodi kontrolirano prikupljanje materijala od pacijenta. U tu svrhu dodjeljuje se posebno opremljena prostorija ili se kupuju posebne kabine. Prikupljanje materijala je opasan postupak, stoga se materijal za istraživanje mora prikupljati u skladu s pravilima sigurnosti od infekcija.

Materijal za testiranje na Mycobacterium tuberculosis sakuplja se u sterilne bočice s čvrsto zatvorenim čepovima kako bi se spriječila kontaminacija okoliša i zaštitio sakupljeni materijal od kontaminacije.

Bočice za prikupljanje dijagnostičkog materijala moraju ispunjavati sljedeće zahtjeve:

• mora biti izrađen od materijala otpornog na udarce;
• treba se lako topiti u autoklavu;
• biti dovoljnog volumena (40-50 ml):
• imati širok otvor za sakupljanje sputuma (promjer ne manji od 30 mm);
• biti jednostavan za rukovanje, proziran ili proziran, tako da se količina i kvaliteta prikupljenog uzorka mogu procijeniti bez otvaranja poklopca.

Za postizanje optimalnih rezultata istraživanja, moraju biti ispunjeni sljedeći uvjeti:

• prikupljanje materijala treba provesti prije početka kemoterapije;
• materijal za studiju mora se prikupiti prije jela ili uzimanja lijekova ujutro;
• Za studiju je preporučljivo prikupiti najmanje 3 jutarnja uzorka sputuma. Sputum se prikuplja 3 uzastopna dana;
• Prikupljeni materijal mora se što prije dostaviti u laboratorij:
• u slučajevima kada je nemoguće odmah dostaviti materijal u laboratorij, čuva se u hladnjaku na temperaturi zraka od 4 °C najviše 48 sati;
• Prilikom transporta materijala potrebno je obratiti posebnu pozornost na integritet boca.

Ispravno prikupljeni sputum ima sluzav ili mukopurulentni karakter. Optimalni volumen pregledanog dijela sputuma je 3-5 ml.

Sputum se prikuplja pod nadzorom zdravstvenog radnika. Osobe odgovorne za prikupljanje sputuma moraju osigurati poštivanje određenih pravila:

• Potrebno je pacijentu objasniti svrhu pregleda i potrebu iskašljavanja ne sline ili nazofaringealne sluzi, već sadržaja dubokih dijelova dišnih putova. To se može postići kao rezultat produktivnog kašlja koji se javlja nakon nekoliko (2-3) dubokih udisaja. Također je potrebno upozoriti pacijenta da prvo mora isprati usta prokuhanom vodom kako bi se uklonio glavni dio mikroflore koja vegetira u usnoj šupljini i ostaci hrane koji kompliciraju pregled sputuma;
• Medicinski radnik koji sudjeluje u prikupljanju sputuma, osim haljine i kape, mora nositi masku, gumene rukavice i gumenu pregaču;
• Stojeći iza pacijenta, savjetuje mu se da bočicu drži što bliže usnama i da odmah u nju odvoji sputum dok ga iskašljava, pri čemu je potrebno osigurati da je protok zraka usmjeren dalje od zdravstvenog radnika:
• Nakon što je skupljanje sputuma završeno, zdravstveni djelatnik treba pažljivo zatvoriti bočicu poklopcem i procijeniti količinu i kvalitetu prikupljenog sputuma. Bočica se zatim označava i stavlja u posebnu kutiju za transport u laboratorij.

Ako pacijent ne sputa, tada mu večer prije i rano ujutro na dan uzimanja materijala treba dati ekspektorans: ekstrakt korijena bijelog sljeza (mukaltin), bromheksin, ambroksol i dr. - ili treba primijeniti nadražujuću inhalaciju, koristeći opremu instaliranu u prostoriji za uzimanje sputuma. Materijal prikupljen na ovaj način ne podliježe konzerviranju i treba ga pregledati na dan uzimanja. Kako bi se izbjeglo njegovo "odbacivanje" u laboratoriju, u uputnici treba napraviti posebnu napomenu.

Ako se mikrobiološke pretrage ne provode u određenoj ustanovi, prikupljeni dijagnostički materijal mora se centralno dostaviti u laboratorij, uz uvjet da se materijal između isporuka čuva u hladnjaku ili s konzervansima. Materijal se u laboratorij dostavlja u transportnim kutijama koje se mogu lako dezinficirati. Svaki uzorak mora biti opremljen odgovarajućom etiketom, a cijela serija mora imati ispunjen prateći obrazac.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Načini i učestalost pregleda pacijenata

Tijekom početnog, takozvanog dijagnostičkog, pregleda pacijenta na tuberkulozu, potrebno je pregledati najmanje 3 porcije sputuma prikupljenih pod nadzorom medicinskog osoblja tijekom 2 ili 3 dana, što povećava učinkovitost mikroskopije.

Primarni probir na tuberkulozu trebaju provoditi sve medicinske i dijagnostičke ustanove zdravstvenog sustava. Nedavno su, kako bi se povećala učinkovitost primarnog pregleda, na temelju kliničkih dijagnostičkih laboratorija organizirani tzv. centri za mikroskopiju, opremljeni modernim mikroskopima i opremom za osiguranje epidemijske sigurnosti.

Antituberkulozne ustanove koriste shemu istraživanja koja predviđa najmanje 3-struki pregled sputuma ili drugog dijagnostičkog materijala unutar 3 dana. Tijekom liječenja, mikrobiološke studije se redovito provode najmanje jednom mjesečno u fazi intenzivne kemoterapije. Pri prelasku u fazu praćenja, studije se provode rjeđe - u intervalima od 2-3 mjeseca, dok se učestalost studija smanjuje na dvije.

Značajke prikupljanja dijagnostičkog materijala za ekstrapulmonalnu tuberkulozu

Značajka patološkog materijala kod ekstrapulmonalnih oblika tuberkuloze je niska koncentracija mikobakterija tuberkuloze u njemu, što zahtijeva osjetljivije metode mikrobiološkog istraživanja, prvenstveno metode sjetve na hranjivi medij.

U slučaju genitourinarne tuberkuloze, urin je najpristupačniji materijal za pregled. Prikupljanje urina treba provoditi posebno obučena medicinska sestra.

Vanjski spolni organi peru se vodom i sapunom ili slabom otopinom kalijevog permanganata. Vanjski otvor uretre pažljivo se tretira. Srednji dio jutarnjeg urina skuplja se u sterilnu bočicu: kod muškaraca - prirodno, kod žena - pomoću katetera. Urin iz bubrežne zdjelice skuplja se u sterilne epruvete tijekom kateterizacije jednog ili dva bubrega, u potonjem slučaju - nužno odvojeno od svakog bubrega. Mala količina ovog urina se centrifugira, a sediment se ispituje.

Kod muškaraca se sperma, ubodi testisa i sekreti prostate centrifugiraju kako bi se dobio sediment. Kod bilo koje lokalizacije specifičnog procesa u genitalnom području kod muškaraca, masaža prostate može potaknuti oslobađanje sekreta koji sadrže mikobakterije tuberkuloze.

Menstrualna krv se od žena prikuplja usisavanjem ili Kafkinom kapicom. Dobiveni materijal se oslobađa od eritrocita ispiranjem destiliranom vodom, a zatim centrifugiranjem. Sediment se ispituje.

Iscjedak iz cervikalnog kanala maternice skuplja se u neku posudu ili Kafkinu kapicu, odnosno poželjno je akumulirati 1-2 ml patološkog materijala.

Materijal dobiven tijekom kirurških zahvata na bubrezima, genitalijama, biopsija, strugotina endometrija, homogenizira se. U tu svrhu stavlja se u sterilni mužar i temeljito usitnjava sterilnim škarama. U dobivenu suspenziju dodaje se sterilni riječni pijesak u količini jednakoj njezinoj masi, zatim se dodaje 0,5-1,0 ml izotonične otopine natrijevog klorida i sve se melje dok se ne stvori kašasta masa uz dodatak izotonične otopine natrijevog klorida (4-5 ml). Zatim se masa ostavi da se slegne 1-1,5 minutu, a supernatant se pregleda.

Tuberkuloza kostiju i zglobova. Ubod (gnoj iz apscesa) dobiven sterilnom štrcaljkom stavlja se u sterilnu posudu i odmah dostavlja u laboratorij. Sterilnom pipetom, prethodno navlaženom sterilnom izotoničnom otopinom natrijevog klorida, uzima se 2-5 ml gnoja, prenosi se u bočicu s kuglicama i dodaje se još 2-3 ml izotonične otopine natrijevog klorida. Bočica se zatvara čepom i trese u šejkeru 8-10 minuta. Ispituje se homogenizirana suspenzija.

Kod fistuloznih oblika osteoartikularne tuberkuloze, gnoj se uzima iz fistule. Obilni iscjedak se skuplja izravno u epruvetu. U slučajevima oskudnog gnojnog iscjetka, fistulni put se ispire sterilnom izotoničnom otopinom natrijevog klorida, a ispirci prikupljeni u epruvetu ili komadić tampona natopljen gnojem šalju se na pregled.

Kirurški materijal dobiven tijekom kirurških zahvata na kostima i zglobovima može se sastojati od gnojno-nekrotičnih masa, granulacija, ožiljnog tkiva, koštanog tkiva, tkiva sinovijalne membrane i drugih supstrata. Njegova obrada provodi se kao u slučaju bubrežne tuberkuloze.

Mikrobiološki pregled sinovijalne tekućine u 3%-tnoj otopini natrijevog citrata (u omjeru 1:1) radi sprječavanja zgrušavanja provodi se odmah nakon punkcije.

Tuberkuloza limfnih čvorova. Gnoj izvađen tijekom punkcije limfnih čvorova pregledava se na isti način kao i gnoj iz apscesa. Tkivo limfnih čvorova dobiveno tijekom kirurških zahvata i biopsija pregledava se kao i kod drugih oblika tuberkuloze.

Studija fekalija na Mycobacterium tuberculosis provodi se izuzetno rijetko zbog gotovo potpunog nedostatka pozitivnih rezultata.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikroskopija mikobakterija

Mikroskopija sputuma relativno je brza, jednostavna i jeftina metoda koja se treba koristiti u svim slučajevima sumnje na tuberkulozu. Osim toga, ova se studija provodi kako bi se procijenila učinkovitost kemoterapije i potvrdilo ozdravljenje ili neuspjeh liječenja u nedostatku rezultata kulture.

Koriste se dvije metode mikroskopskog pregleda:

• metoda izravne mikroskopije, kada se razmaz priprema izravno iz dijagnostičkog materijala;
• metoda mikroskopije sedimenta pripremljenog od materijala tretiranog dekontaminantima za kulturološka istraživanja.

Prva metoda se koristi u onim laboratorijima gdje se provode samo mikroskopske studije (klinički dijagnostički laboratoriji opće medicinske mreže).

Najbolji rezultati mikroskopskog pregleda postižu se koncentriranjem dijagnostičkog materijala (na primjer, centrifugiranjem).

Da bi se mikroskopijom s 50%-tnom vjerojatnošću otkrila Mycobacterium tuberculosis, 1 ml sputuma mora sadržavati više od 5000 mikrobnih stanica. Sputum bolesnika s plućnim oblicima tuberkuloze obično sadrži značajan broj acidorezistentnih bakterija, što omogućuje njihovo pouzdano otkrivanje bakterioskopijom. Dijagnostička osjetljivost ove metode može se povećati pregledom nekoliko uzoraka sputuma od jednog bolesnika. Negativan rezultat bakterioskopskog pregleda ne isključuje dijagnozu tuberkuloze, budući da sputum nekih bolesnika sadrži manje Mycobacterium nego što se može otkriti mikroskopijom. Loša priprema razmaza sputuma također može biti uzrok negativnog rezultata bakterioskopskog pregleda.

Najčešća metoda za otkrivanje acidorezistentnih mikobakterija u razmazu je Ziehl-Neelsenovo bojenje. Metoda se temelji na prodiranju karbol fuksina u mikrobnu stanicu kroz membranu koja uključuje voštano-lipidni sloj, uz istovremeni učinak zagrijavanja i snažnog djelovanja fenola na jetkanje. Naknadna dekolorizacija razmaza 25%-tnom otopinom sumporne kiseline ili 3%-tnim klorovodičnim alkoholom dovodi do dekolorizacije svih struktura koje nisu acidorezistentne. Dekolorizirani elementi razmaza boje se 0,3%-tnom otopinom metilenskog plavog. Mikobakterije ne percipiraju konvencionalne anilinske boje, zbog čega se acidorezistentne mikobakterije boje malinastocrveno, a ostali mikrobi i stanični elementi plavo.

Za pregled razmaza obojenih prema Ziehl-Neelsenu koristi se svjetlosni binokularni mikroskop s imerzijskim objektivom (uvećanje od 90 ili 100 puta) i okularom sa 7 ili 10-strukim povećanjem. Pregledava se 100 vidnih polja, što je dovoljno za otkrivanje pojedinačnih mikobakterija u razmazu. Ako je rezultat takvog pregleda negativan, preporučuje se pregledati još 200 vidnih polja radi potvrde. Rezultati se bilježe, a naznačen je broj otkrivenih acidorezistentnih mikobakterija (AFB).

Uz ovu metodu, za luminescentnu mikroskopiju koristi se fluorokromsko bojenje, što omogućuje postizanje najboljih rezultata. Korištenje ove metode povećava učinkovitost mikroskopije za 10-15%. Kada se mikobakterije tretiraju luminiscentnim bojama (auramin, rodamin itd.), te se tvari također vežu za voskaste strukture mikrobne stanice. Kada se obojene stanice ozrače uzbudljivim izvorom svjetlosti (određeni spektar ultraljubičastog zračenja), počinju svijetliti narančasto ili jarko crveno na crnoj ili tamnozelenoj pozadini. Zbog visoke svjetline i kontrasta vidljive slike, ukupno povećanje mikroskopa može se smanjiti za 4-10 puta, što proširuje vidno polje i smanjuje vrijeme gledanja preparata. Uz to, zbog znatno veće dubine polja može se povećati udobnost proučavanja.

Pri korištenju fluorescentne mikroskopije, pregledavanje istog područja razmaza traje znatno kraće nego svjetlosna mikroskopija razmaza obojenih prema Ziehl-Neelsenu. Ako mikroskopist pregleda otprilike 20-25 takvih razmaza tijekom radnog dana, tada uz pomoć fluorescentne mikroskopije može pregledati više od 60-80 uzoraka u istom vremenu. Iskusni mikroskopisti znaju da je bojenje stanica smjesom auramina i rodamina na neki način specifično za kiselo-rezistentne mikobakterije, koje u ovom slučaju imaju izgled zlatnih štapića. Saprofiti se boje zelenkasto.

Druga važna prednost metode fluorescentne mikroskopije je mogućnost otkrivanja promijenjenih mikobakterija koje su izgubile svoja svojstva otpornosti na kiseline pod utjecajem niza nepovoljnih čimbenika, posebno intenzivne kemoterapije, te se stoga ne otkrivaju Ziehl-Neelsenovim bojenjem.

Nedostaci metode fluorescentne mikroskopije uključuju relativno visoku cijenu mikroskopa i njegovog rada. Međutim, u centraliziranim ili drugim velikim laboratorijima, gdje opterećenje premašuje normu od tri laboratorijska tehničara koji rade s tri konvencionalna mikroskopa, jeftinije je koristiti jedan fluorescentni mikroskop.

Bakterioskopske metode imaju prilično visoku specifičnost (89-100%). Oko 97% pozitivnih rezultata dobivenih bilo kojom mikroskopskom metodom jasno je potvrđeno rezultatima sjetve.

Treba napomenuti da mikroskopski pregled razmaza patološkog materijala ne omogućuje određivanje vrste otkrivenih mikobakterija otpornih na kiseline. Mikroskopska metoda omogućuje samo zaključak o prisutnosti ili odsutnosti mikroorganizama otpornih na kiseline u pripravku, što se objašnjava postojanjem u prirodi velikog broja netuberkuloznih mikroorganizama otpornih na kiseline, morfološki sličnih mikobakterijama tuberkuloznog kompleksa.

Evaluacija rezultata mikroskopije provodi se u semikvantitativnim jedinicama.

Kako bi se mogli usporediti rezultati različitih mikroskopskih metoda, uvode se empirijski koeficijenti. Na primjer, za usporedbu rezultata razmaza obojenog fluorescentnim bojama s podacima studije svjetlosnom mikroskopijom (1000-struko povećanje), potrebno je broj acidorezistentnih mikobakterija otkrivenih pomoću fluorescentnog mikroskopa podijeliti s odgovarajućim koeficijentom: pri 250-strukom povećanju mikroskopa - s 10, pri 450-strukom povećanju - s 4, pri 630-strukom povećanju - s 2.

Značajke mikroskopije kod ekstrapulmonalne tuberkuloze

Provodi se izravna mikroskopija, kao i mikroskopija razmaza pripremljenih nakon obogaćivanja s naknadnim bojenjem prema Ziehl-Neelsenu ili fluorescentnim bojama. Izravna mikroskopija razmaza je neučinkovita zbog niske koncentracije mikobakterija u materijalu, te je stoga racionalnije koristiti metode obogaćivanja. Centrifugiranje je najučinkovitije. Ako je biološki materijal viskozan, koristi se centrifugiranje s istovremenom homogenizacijom i ukapljivanjem materijala, što se provodi pomoću brzih centrifuga s centrifugirajućom silom od 3000 g i otopina hipoklorita. Druge metode obogaćivanja, poput mikroflotacije, trenutno se ne koriste zbog stvaranja biološki opasnih aerosola.

[ 37 ]

Metoda kulture za dijagnosticiranje tuberkuloze

Metoda sijanja, ili metoda kulture, osjetljivija je od mikroskopije razmaza i ima niz prednosti u odnosu na potonju. Omogućuje detekciju nekoliko desetaka održivih mikobakterija u materijalu koji se ispituje i ima visoku dijagnostičku vrijednost. To je posebno važno pri ispitivanju materijala novodijagnosticiranih ili liječenih pacijenata koji izlučuju mali broj mikobakterija.

U usporedbi s mikroskopijom, istraživanje kulture omogućuje povećanje broja otkrivenih pacijenata s tuberkulozom za više od 15-25%, kao i provjeru tuberkuloze u ranijim fazama, kada se bolest još uvijek lako može liječiti. Vrlo važnom prednošću istraživanja kulture smatra se mogućnost dobivanja kulture patogena, koja se može identificirati i proučavati u odnosu na osjetljivost na lijekove, virulenciju i druga biološka svojstva.

Nedostaci metoda uzgoja uključuju njihovo trajanje (razdoblje čekanja na materijale doseže 10 tjedana), veće troškove i složenost obrade dijagnostičkog materijala.

Principi predsjetvene obrade dijagnostičkog materijala

Konvencionalne mikrobiološke metode ne mogu se koristiti za provođenje testova na tuberkulozu. To je zbog činjenice da mikobakterije tuberkuloze rastu vrlo sporo, a većina kliničkih uzoraka sadrži brzorastuće piogene i trule mikroorganizme i gljivice. Njihov brzi rast na bogatim hranjivim podlogama ometa razvoj mikobakterija i ne dopušta izolaciju uzročnika tuberkuloze, stoga se dijagnostički materijal mora prethodno obraditi prije sjetve. Osim toga, mikobakterije oslobođene iz pacijentovog dišnog trakta obično su okružene velikom količinom sluzi, što otežava njihovu koncentraciju. U tom smislu, prije sjetve sputuma i drugih sličnih materijala, oni se moraju ukapljiti i dekontaminirati.

Svi deterdženti i dekontaminanti imaju manje ili više izražen toksični učinak na mikobakterije. Kao rezultat tretmana, do 90% mikobakterija može uginuti. Kako bi se sačuvao dovoljan dio populacije mikobakterija, potrebno je koristiti blage metode tretmana koje omogućuju, s jedne strane, suzbijanje brzorastućih piogenih i trulih mikroorganizama, a s druge strane, maksimalno očuvanje održivosti mikobakterija prisutnih u materijalu.

Ovisno o materijalu, njegovoj homogenosti i stupnju kontaminacije, za predsjetvenu obradu koriste se različita dekontaminacijska sredstva: za sputum - 4%-tna otopina natrijevog hidroksida, 10%-tna otopina trinatrijevog fosfata, benzalkonijev klorid trinatrijev fosfat, NALC-NaOH (N-acetil-L-cistein-natrijev hidroksid) s konačnom koncentracijom NaOH od 1%, za urin i druge tekuće materijale - 3%-tna otopina sumporne kiseline, za kontaminirane uzorke, materijale koji sadrže masti - otopina oksalne kiseline do 5%. Osim toga, u nekim slučajevima koriste se enzimi i surfaktanti (detergenti). Korištenje Tweena i nekih drugih deterdženata prati manja smrt mikobakterijskih stanica (40-50% preživi). Međutim, mogu se koristiti samo za tekuće materijale. NALC-NaOH, proizveden u kompletima, najčešće se koristi u svijetu. Ova metoda omogućuje izolaciju više od 85% populacije mikobakterijskih stanica. Dekontaminacija čvrstih materijala koji sadrže tkivo je teža, jer je teško pogoditi stupanj disperzije materijala tijekom homogenizacije. Na primjer, obrada biopsija limfnih čvorova često je popraćena povećanom učestalošću kontaminacije stranom florom. U tom slučaju može se koristiti 1%-tni etonij.

Nehomogeni materijal se homogenizira pomoću staklenih kuglica u prisutnosti dekontaminanta. Tekući materijali se prethodno centrifugiraju i obrađuje se samo sediment.

Tehnika sjetve i inkubacije

Nakon preliminarne obrade, materijal se centrifugira, što istaloži mikobakterije i povećava njihov sadržaj u sedimentu („obogaćivanje sedimenta“). Dobiveni sediment se neutralizira i inokulira na površinu gustih hranjivih medija ili epruveta s tekućim (polutekućim) medijima. Iz preostalog sedimenta pripremaju se razmazi za mikroskopski pregled. Tehnika sijanja mora spriječiti unakrsnu kontaminaciju dijagnostičkog materijala.

Za pouzdanu kliničku interpretaciju rezultata mikrobioloških istraživanja mora se poštivati sljedeće pravilo: mikroskopske i kulturološke studije moraju se provoditi paralelno iz istog uzorka dijagnostičkog materijala.

Inokulirane epruvete se stavljaju u termostat na 37 ^° C tijekom 2 dana u horizontalnom položaju. To osigurava ravnomjerniju apsorpciju materijala u hranjivi medij. Nakon 2 dana, epruvete se premještaju u vertikalni položaj i hermetički zatvaraju gumenim ili silikonskim čepovima kako bi se spriječilo isušivanje zasijanih medija.

Usjevi se drže u termostatu na 37 ^° C tijekom 10-12 tjedana uz redovite tjedne preglede. Pri svakom kontrolnom pregledu bilježe se sljedeći parametri:

• razdoblje vizualno vidljivog rasta od dana sjetve;
• stopa rasta (broj CFU);
• kontaminacija kulture stranom mikrobnom florom ili gljivicama (takve epruvete se uklanjaju);
• nema vidljivog rasta. Cijevi se ostavljaju u termostatu do sljedećeg pregleda.

Hranjivi mediji

Za uzgoj mikobakterija koriste se različiti hranjivi mediji: čvrsti, polutekući, tekući. Međutim, nijedan od poznatih hranjivih medija nema svojstva koja osiguravaju rast svih mikobakterijskih stanica. U tom smislu, radi poboljšanja učinkovitosti, preporučuje se istovremena upotreba 2-3 hranjiva medija različitog sastava.

Kao standardni medij za primarnu izolaciju uzročnika tuberkuloze i određivanje njegove osjetljivosti na lijekove, WHO preporučuje Lowenstein-Jensenov medij. To je gusti medij s jajima na kojem se rast mikobakterija postiže 20.-25. dana nakon sjetve bakterioskopski pozitivnog materijala. Sjetva bakterioskopski negativnog materijala zahtijeva dulje razdoblje inkubacije (do 10-12 tjedana).

U našoj zemlji je široko rasprostranjen Finn-II jajni medij koji je predložio ER Finn. Razlikuje se po tome što umjesto L-asparagina koristi natrijev glutamat, koji pokreće druge putove sinteze aminokiselina u mikobakterijama. Rast se na ovom mediju pojavljuje nešto ranije, a učestalost izolacije mikobakterija je 6-8% veća nego na Lowenstein-Jensen mediju.

Kako bi se povećala učinkovitost bakteriološke dijagnostike ekstrapulmonalne tuberkuloze, preporučljivo je u kompleks hranjivih medija uključiti modificirane Finn-II medije. Za ubrzanje rasta, u Finn-II hranjivi medij dodatno se unosi 0,05% natrijevog tioglikolata, što smanjuje koncentraciju kisika. Kako bi se zaštitili enzimski sustavi mikobakterija od toksičnih produkata lipidne peroksidacije, u Finn-II hranjivi medij unosi se antioksidans α-tokoferol acetat u koncentraciji od 0,001 μg/ml. Dijagnostički materijal se sije standardnom metodom.

U antituberkuloznim laboratorijima u Rusiji koriste se i druge modifikacije gustih hranjivih medija: hranjivi medij "Novaya" koji je predložio G. G. Mordovsky, hranjivi mediji A-6 i A-9 koje je razvio V. Anikin itd.

Zbog činjenice da tijekom kemoterapije dolazi do oštećenja različitih metaboličkih sustava mikrobne stanice, dio mikobakterijske populacije gubi sposobnost normalnog razvoja na konvencionalnim hranjivim medijima i zahtijeva osmotski uravnotežene (polutekuće ili tekuće) hranjive medije.

Evaluacija i bilježenje rezultata dijagnostičke kulture materijala

Neki sojevi i vrste mikobakterija rastu sporo, rast se može pojaviti čak i do 90. dana. Broj takvih kultura je malen, ali to prisiljava sjetvu da se drži u termostatu 2,5-3 mjeseca.

Virulentne kulture Mycobacterium tuberculosis obično rastu na čvrstim jajnim medijima kao R-oblici kolonija različite veličine i izgleda. Kolonije su suhe, naborane, boje slonovače i blago pigmentirane. Na drugim medijima, kolonije Mycobacterium tuberculosis mogu biti vlažnije. Nakon kemoterapije ili tijekom liječenja mogu se izolirati glatke kolonije s vlažnim rastom (S-oblici).

Prilikom izolacije kultura koristi se skup posebnih studija za razlikovanje tuberkuloznih mikobakterija od netuberkuloznih mikobakterija i kiselootpornih saprofita.

Pozitivan odgovor daje se nakon obveznog mikroskopskog pregleda razmaza iz uzgojenih kolonija obojenih prema Ziehl-Neelsenu. U slučaju rasta mikobakterija, u razmazima se nalaze jarko crveni štapići, koji leže pojedinačno ili u skupinama, tvoreći nakupine u obliku filca ili pletenica. U mladim kulturama, posebno onima izoliranima od pacijenata koji su dugo liječeni kemoterapijom, mikobakterije se odlikuju izraženim polimorfizmom, do prisutnosti kratkih, gotovo kokoidnih ili izduženih varijanti koje nalikuju gljivičnom miceliju, uz štapićaste oblike.

Intenzitet rasta mikobakterija označava se prema sljedećoj shemi: (+) - 1-20 CFU u epruveti (nisko izlučivanje bakterija); (++) - 20-100 CFU u epruveti (umjereno izlučivanje bakterija); (+++) - >100 CFU u epruveti (obilno izlučivanje bakterija). U laboratorijskoj dijagnostici tuberkuloze nije dovoljno dati odgovor koji ukazuje na to jesu li mikobakterije otkrivene određenom metodom ili ne. Također je potrebno imati detaljnu predodžbu o volumenu i prirodi mikobakterijske populacije, njenom sastavu i svojstvima. Upravo ti podaci omogućuju ispravno tumačenje stanja procesa, planiranje taktike i pravovremeno prilagođavanje liječenja.

Posljednjih godina predloženi su hranjivi mediji na bazi agara s raznim aditivima za rast i korištenje posebne mješavine plinova za ubrzavanje rasta mikobakterija. Kako bi se postigao rast mikobakterija na tim medijima, tijekom uzgoja stvara se atmosfera s povećanim udjelom ugljikovog dioksida (4-7%). U tu svrhu koriste se posebni CO2 inkubatori _. Međutim, najveći razvoj doživjeli su automatizirani sustavi za uzgoj mikobakterija: MGIT-BACTEC-960 i MB/Bact.

Jedan od takvih sustava je MGIT (epruveta za indikaciju rasta mikobakterija), koji je visokotehnološki razvoj i namijenjen je ubrzanoj bakteriološkoj dijagnostici tuberkuloze i određivanju osjetljivosti mikobakterija na lijekove prve linije i neke lijekove druge linije. MGIT je dizajniran za upotrebu kao dio uređaja VASTEC-960. Mikroorganizmi se uzgajaju u posebnim epruvetama s tekućim hranjivim medijem na bazi modificiranog Middlebrook-7H9 medija. Za poticanje rasta mikobakterija i suzbijanje rasta strane mikroflore koristi se MGIT dodatak za rast i mješavina antibakterijskih lijekova PANTA.

Rast mikroorganizama se optički registrira. Temelji se na fluorescenciji, koja nastaje kada mikobakterije konzumiraju kisik tijekom rasta. Fluorokramska boja ovisna o kisiku nalazi se na dnu posebne epruvete i prekrivena je slojem silikona. Razmnožavanje mikobakterija dovodi do smanjenja količine kisika u epruveti i smanjenja njegove koncentracije, što uzrokuje povećanje fluorescencije, koja postaje vidljiva kada se epruveta ozrači ultraljubičastim svjetlom i automatski se registrira fotosenzorima ugrađenim u uređaj VASTES-960. Intenzitet luminiscencije registrira se u jedinicama rasta (GU). Podaci o rastu automatski se unose u računalo, gdje se mogu spremiti. Računalna analiza krivulja rasta može pružiti informacije o prisutnosti različitih skupova mikobakterija, uključujući i netuberkulozne, a također pomaže u procjeni svojstava rasta mikobakterija.

Kao rezultat uvođenja takvih sustava, vrijeme rasta mikobakterija značajno je smanjeno, u prosjeku 11 dana na VASTEC-960 i 19 dana na MB/Bact u odnosu na 33 dana na standardnom gustom hranjivom mediju. Treba napomenuti da ovi sustavi zahtijevaju visokokvalificirano osoblje. Sjetvu materijala na tekuće medije nužno prati sjetva na Lowenstein-Jensen medij, koji igra ulogu rezerve u slučajevima kada mikobakterije tuberkuloze ne rastu na drugim medijima.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Određivanje osjetljivosti mikobakterija na lijekove

Određivanje spektra i stupnja osjetljivosti mikobakterija na antituberkulotske lijekove od velike je kliničke važnosti, kao i za epidemiološke procjene širenja tuberkuloze rezistentne na lijekove. Osim toga, praćenje rezistencije na lijekove omogućuje nam procjenu učinkovitosti antituberkuloznog programa u cjelini, što je sastavni pokazatelj rada svih komponenti antituberkuloznih mjera.

Učestalost i vrijeme testiranja osjetljivosti na lijekove:

• prije početka liječenja, jednom kako bi se odredila strategija i taktika liječenja:
• Prilikom izolacije kultura iz različitih materijala od pacijenta (sputum, BAL, urin, eksudati, cerebrospinalna tekućina itd.), pregledavaju se svi izolirani sojevi:
• na kraju intenzivne faze liječenja u nedostatku kliničke i radiološke dinamike:
• ako je potrebno promijeniti režim liječenja u slučaju:
  • odsutnost negativnosti sputuma;
  • ponovna kultura nakon negativnog rezultata sputuma;
  • nagli porast količine AFB u razmazu nakon početnog smanjenja. Dobro je poznato da se iz materijala pacijenta s tuberkulozom izoliraju sojevi Mycobacterium tuberculosis s različitom osjetljivošću na lijekove. Osjetljivost sojeva na antituberkulotske lijekove može se razlikovati u spektru lijekova, stupnju, učestalosti i brzini razvoja rezistencije.

Stupanj otpornosti Mycobacterium tuberculosis na lijekove određuje se u skladu s utvrđenim kriterijima, koji su usmjereni na klinički značaj otpornosti i ovise o antituberkulotičnoj aktivnosti lijeka, njegovoj farmakokinetici, koncentraciji u leziji, maksimalnoj terapijskoj dozi itd.

Određivanje osjetljivosti mikobakterija na lijekove trenutno se provodi mikrobiološkim metodama:

• apsolutne koncentracije (metoda razrjeđivanja na krutim ili tekućim hranjivim medijima),
• proporcije,
• koeficijent otpora.

Obično se otpornost manifestira u obliku vizualno uočenog rasta kolonija mikobakterija tuberkuloze, međutim postoje metode koje induciraju rast u ranim fazama diobe mikobakterija u obliku reakcija boje. Ove metode smanjuju vrijeme testiranja s 3-4 na 2 tjedna.

Metoda apsolutne koncentracije koju preporučuje Odbor za kemoterapiju SZO-a postala je široko rasprostranjena u Rusiji kao unificirana metoda. S metodološkog gledišta, najjednostavnija je, ali zahtijeva visoku standardizaciju i preciznost laboratorijskih postupaka. Test osjetljivosti na lijekove sastoji se od seta epruveta s hranjivim medijem modificiranim antituberkuloznim lijekovima. Set se sastoji od 2-3 epruvete s različitim koncentracijama svakog od korištenih lijekova, jedne kontrolne epruvete s medijem bez lijeka i jedne epruvete koja sadrži 1000 μg/ml natrijevog salicilata ili 500 μg/ml paranitrobenzojeve kiseline za otkrivanje rasta netuberkuloznih mikobakterija.

Za pripremu seta medija s preparatima koristi se modificirani Lowenstein-Jensenov medij (bez škroba) koji se ulije u tikvice. U svaku tikvicu dodaje se određeni volumen odgovarajućeg razrjeđenja antituberkulotskog lijeka. Sadržaj tikvica se temeljito promiješa, ulije u epruvete i koagulira u kosom položaju 40 minuta na temperaturi od 85 °C. Preporučuje se koagulacija medija u električnom koagulatoru s automatskom kontrolom temperature. Medij s antituberkulotskim lijekovima

1. red može se čuvati u hladnjaku na 2-4 °C tijekom 1 mjeseca, s lijekovima 2. reda - ne dulje od 2 tjedna. Čuvanje medija s lijekovima na sobnoj temperaturi je neprihvatljivo. Prilikom pripreme otopina antituberkuloznih lijekova uzima se u obzir njihova aktivnost, izračunavajući koncentraciju s prilagodbom za molekularnu težinu nespecifičnog dijela lijeka, čistoću itd. Za određivanje osjetljivosti na lijek koriste se samo kemijski čiste tvari.

Princip metode je određivanje koncentracije antituberkuloznog lijeka koja potiskuje rast značajnog dijela populacije mikobakterija. Kada se pravilno izvede, ova metoda ima dobru pouzdanost.

Prije provođenja testa potrebno je provjeriti da izolirana kultura Mycobacterium tuberculosis ne sadrži stranu mikrofloru. Iz kulture mikobakterija u 0,9%-tnoj otopini natrijevog klorida priprema se homogena suspenzija koja sadrži 500 milijuna mikrobnih tijela u 1 ml (optički standard mutnoće 5 jedinica). Dobivena suspenzija se razrjeđuje s 0,9%-tnom otopinom natrijevog klorida (1:10) i u svaku epruvetu seta hranjivih medija dodaje se 0,2 ml suspenzije. Inokulirane epruvete se stavljaju u termostat na 37 °C i drže vodoravno 2-3 dana tako da se kosa površina hranjivog medija ravnomjerno inokulira suspenzijom Mycobacterium tuberculosis. Zatim se epruvete pomiču u okomiti položaj i inkubiraju 3-4 tjedna. Rezultati se bilježe nakon 3-4 tjedna.

Budući da je vrijeme potrebno za izolaciju patogena iz kliničkog materijala na hranjivim podlogama najmanje 1-1,5 mjeseci, rezultati određivanja osjetljivosti na lijekove ovom metodom mogu se dobiti najranije 2-2,5 mjeseca nakon sijanja materijala. To je jedan od glavnih nedostataka metode.

Rezultati ispitivanja osjetljivosti mikobakterija na lijekove interpretiraju se na temelju određenih kriterija. Na čvrstim medijima, kultura se smatra osjetljivom na koncentraciju lijeka sadržanog u mediju ako broj mikobakterijskih kolonija uzgojenih na određenoj epruveti s lijekom ne prelazi 20 s obilnim rastom na kontrolnoj epruveti bez lijekova. Samo ako postoji više od 20 kolonija, kultura se smatra otpornom na određenu koncentraciju. U praksi, kada se dobiju rezultati rasta u epruvetama blizu 20 CFU, potrebno je obavijestiti kliničku jedinicu da je osjetljivost ili otpornost u ovom slučaju granična, budući da to ponekad može objasniti nejasnu dinamiku kliničkih pokazatelja.

Za različite pripravke utvrđuje se određena koncentracija pri kojoj se opaža reprodukcija kritičnog udjela mikobakterijske populacije. Te se koncentracije nazivaju "kritične". Veličina rasta mikobakterijske populacije na hranjivoj podlozi s pripravkom u kritičnoj koncentraciji koristi se kao kriterij stabilnosti.

U domaćoj ftiziološkoj praksi, pri određivanju otpornosti na lijekove, ne ograničavaju se samo na određivanje kritičnih koncentracija. To je zbog činjenice da proširena definicija razine otpornosti patogena na lijekove omogućuje kliničaru da ispravnije formulira taktiku kemoterapije, koristeći znanje o potencirajućem učinku kombinacija lijekova, da predvidi unakrsnu otpornost ili da koristi učinkovitije lijekove iz korištene skupine antituberkuloznih lijekova.

Metoda apsolutne koncentracije je najjednostavnija, ali i najosjetljivija na pogreške u njezinoj provedbi. Pouzdanija, posebno pri određivanju osjetljivosti na lijekove druge linije, i raširena izvan Rusije je metoda proporcije. Uzima u obzir nedostatke metode apsolutne koncentracije, ali je njezina provedba zahtjevnija od punog rada.

Metoda je vrlo slična metodi apsolutne koncentracije. Priprema epruveta s lijekovima je ista kao i kod metode apsolutne koncentracije. Međutim, sjetvena doza suspenzije mikobakterija tuberkuloze smanjuje se 10 puta, što eliminira učestalost spontane rezistencije nekih sojeva mikobakterija tuberkuloze na lijekove poput etambutola, protionamida, kapreomicina. Kao kontrole koriste se 2 ili 3 epruvete s sjetvenom dozom jednakom onoj u epruvetama, uzastopno razrijeđene 10 i 100 puta. Kriterij rezistencije je udio vizualno uočenog rasta mikobakterija tuberkuloze. Za lijekove 1. linije kriterij rezistencije je prekomjerni rast od 1% početne populacije, za lijekove 2. linije - rast od 1 ili više od 10% početne, ovisno o odabranoj kritičnoj koncentraciji.

Godine 1997., radna skupina WHO-a i Međunarodne unije protiv tuberkuloze za otkrivanje rezistencije na antituberkulotske lijekove prilagodila je ove kriterije, predlažući da se mikobakterije koje rastu na gustom Lowenstein-Jensenovom jajnom mediju pri sljedećim koncentracijama smatraju rezistentnima:

• dihidrostreptomicin - 4 μg/ml;
• izoniazid - 0,2 µg/ml:
• rifampicin - 40 mcg/ml:
• Etambutol - 2 mcg/ml.

Godine 2001. predložene su kritične koncentracije za sljedeće lijekove druge linije (za kritični udio od 1%):

• kapreomicin - 40 mcg/ml;
• protionamid - 40 mcg/ml;
• kanamicin - 30 μg/ml;
• viomicin - 30 μg/ml;
• cikloserin - 40 mcg/ml;
• aminosalicilna kiselina - 0,5 mcg/ml;
• ofloksacin - 2 mcg/ml.

Rezultati rasta procjenjuju se nakon 4 tjedna kao preliminarni, a nakon 6 tjedana uzgoja kao konačni.

Za određivanje osjetljivosti na lijek pirazinamid, koji se široko koristi u modernoj kemoterapiji tuberkuloze, preporučena kritična koncentracija je 200 μg/ml. Međutim, još uvijek ne postoji općeprihvaćena metoda za određivanje otpornosti na ovaj lijek na krutim hranjivim medijima, budući da se njegova antibakterijska aktivnost očituje samo u kiselom okruženju (pH <6), što je tehnički teško održavati. Osim toga, mnoge kliničke kulture Mycobacterium tuberculosis nerado rastu na jajnim medijima s kiselim okruženjem.

Kako bi se procijenila kvaliteta rezultata određivanja osjetljivosti mikobakterija na lijekove, preporučuje se kontrolirati svaku novu seriju Lowenstein-Jensen medija paralelnim određivanjem osjetljivosti standardnog muzejskog soja H37Rv. Osim toga, postoje određeni mikrobiološki kriteriji koji moraju biti ispunjeni kako bi metode dale dobro ponovljiv i ispravno interpretiran rezultat. To uključuje održivost kulture tuberkuloznih mikobakterija, pravila za dobivanje homogene suspenzije i suspenzije, pravila za odabir kultura tuberkuloznih mikobakterija te reprezentativnost odabrane bakterijske mase. Pouzdanost određivanja otpornosti na lijekove smanjuje se s izrazito slabim izlučivanjem bakterija.

Nedavno je metoda određivanja osjetljivosti na lijekove pomoću automatiziranih sustava prepoznata kao obećavajuća. Najnapredniji u ovom području su razvoji temeljeni na VASTEC MGIT-960. U ovom slučaju, osjetljivost mikobakterija tuberkuloze na lijekove određuje se na temelju modificirane metode proporcija. Tijekom određivanja uspoređuje se brzina rasta mikobakterija tuberkuloze u kontrolnoj epruveti i u epruvetama s lijekovima. Za određivanje osjetljivosti na streptomicin, izoniazid, rifampicin i etambutol koriste se obogaćujući aditivi i antibiotici uključeni u SIRE kit. Za određivanje osjetljivosti na pirazinamid koristi se PZA kit. Tijekom ispitivanja, epruvete s lijekovima inokuliraju se suspenzijom mikobakterija tuberkuloze, kao i kontrolne epruvete sa 100-strukim razrjeđenjem suspenzije za sve lijekove, s izuzetkom pirazinamida, gdje je razrjeđenje suspenzije 10 puta. Kriterij stabilnosti je pokazatelj rasta mikobakterija od 100 GU kada rast u kontrolnoj epruveti dosegne 400 GU (vidi "Kulturne metode za izolaciju mikobakterija"). Rezultati se bilježe i interpretiraju automatski, a postavlja ih uneseni ili odabrani program.

Konačne koncentracije u epruveti s tekućim hranjivim medijem koriste se kao kritične koncentracije. Trenutno su kritične koncentracije razvijene i za lijekove prve linije i za neke lijekove druge linije. Treba napomenuti da se određivanje osjetljivosti mikobakterija tuberkuloze na cikloserin i aminosalicilnu kiselinu provodi samo na hranjivim medijima s jajima.

Detaljan protokol za rad s opisanim sustavom omogućuje testiranje osjetljivosti na lijekove i na izoliranoj kulturi (s gustim hranjivim medijem) i korištenjem primarnog rasta mikobakterija u MGIT epruveti. Potonja opcija značajno smanjuje vrijeme potrebno za provođenje studija kulture, omogućujući dobivanje potpunih rezultata kulture tuberkuloznih mikobakterija (uključujući informacije o osjetljivosti na lijekove) unutar 3 tjedna od prikupljanja materijala, dok tradicionalna metoda to može pružiti tek do 3. mjeseca. Pravovremeni rezultati, kada je pacijent u intenzivnoj fazi liječenja, mogu nadoknaditi relativno visoke troškove studija.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Diferencijacija mikobakterija

S obzirom na to da korištene hranjive podloge nisu strogo selektivne, naknadna diferencijacija izoliranih mikobakterija smatra se obveznom. Potreba za diferencijacijom mikobakterija posljedica je niza značajki patoloških procesa uzrokovanih predstavnicima roda: različitog tijeka i ishoda tuberkuloze i mikobakterioze, prisutnosti prirodne rezistencije na neke antituberkulotske lijekove.

Prepoznato je da se primarna identifikacija mikobakterija kompleksa M. tuberculosis od netuberkuloznih mikobakterija provodi prema sljedećim karakteristikama: brzina rasta na gustim hranjivim medijima, stvaranje pigmenata, morfologija kolonija, prisutnost otpornosti na kiseline i temperaturni optimum za rast.

Nažalost, ne postoji jedinstvena laboratorijska metoda koja može pouzdano razlikovati mikobakterije kompleksa M. tuberculosis od drugih mikobakterija otpornih na kiseline; međutim, kombinacija gore opisanih znakova s rezultatima niza biokemijskih testova navedenih u nastavku omogućuje identifikaciju mikobakterija kompleksa M. tuberculosis s vjerojatnošću do 95%.

Za razlikovanje mikobakterija kompleksa M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii i druge) od spororastućih netuberkuloznih mikobakterija, koriste se osnovni biokemijski testovi za otkrivanje prisutnosti sljedećih znakova:

• sposobnost proizvodnje nikotinske kiseline (niacin test):
• aktivnost nitrat reduktaze;
• termostabilna katalaza;
• rast na mediju s natrijevim salicilatom (1 mg/ml).

Kao dodatni test, mogu se koristiti i testovi rasta na mediju koji sadrži 500 μg/ml para-nitrobenzojeve kiseline ili 5% natrijevog klorida.

Mnogi bakteriološki laboratoriji identificiraju ove mikroorganizme samo na kompleksnoj razini, što je zbog ograničenih mogućnosti laboratorija i metodoloških mogućnosti stručnjaka.

U većini slučajeva u praksi, sljedeći testovi su dovoljni za razlikovanje M. tuberculosis i M. bovis: niacin, nitrat reduktaza, pirazinamidaza i registracija rasta na mediju koji sadrži 2 μg/ml tiofen-2-karboksilne kiseline hidrazida. Uzima se u obzir da su mikobakterije kompleksa M. tuberculosis karakterizirane sljedećim skupom značajki:

• spor rast (više od 3 tjedna);
• temperatura rasta unutar 35-37 ^° C;
• odsutnost pigmentacije (boja slonovače);
• izražena obojenost otporna na kiseline;
• pozitivan test na niacin;
• pozitivan test nitrat reduktaze;
• odsutnost termostabilne katalaze (68 ^o C).
• nedostatak rasta na Lowenstein-Jensenovom mediju koji sadrži:
  • 1000 µg/ml natrijeve salicilne kiseline,
  • 500 mcg/ml para-nitrobenzojeve kiseline,
  • 5% natrijevog klorida:
• rast u prisutnosti 1-5 μg/ml tiofen-2-karboksilne kiseline.

Relevantnost diferencijacije izoliranih mikobakterija značajno će se povećati s porastom učestalosti registracije slučajeva HIV-a/AIDS-a povezanih s tuberkulozom ili mikobakteriozom. Trenutno ne postoji apsolutna sigurnost u spremnost praktičnih regionalnih laboratorija da ispravno obave ovaj obujam posla.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Imunološka dijagnostika tuberkuloze

Postoji niz univerzalnih fenomena, preparata i imunoloških testova koji su u početku otkriveni specifično kod tuberkuloze ili u modelu imunološkog odgovora na mikobakterije. To uključuje BCG i tuberkulin, fenomen poput kožnog DST-a (tuberkulinskih testova - Pirquetova i Mantouxova reakcija), reakciju na potkožnu primjenu tuberkulina senzibiliziranim životinjama (Kochov fenomen). Neka od prvih antitijela kod zaraznih bolesti također su otkrivena kod tuberkuloze. Naravno, što je dublje razumijevanje mehanizama antituberkuloznog imuniteta i njihove genetske kontrole, to se šira može koristiti imunološke metode i preparati koji utječu na imunitet za rješavanje praktičnih problema ftizijalizma.

Najvažnijim i najsloženijim praktičnim problemom trenutno se smatra otkrivanje tuberkuloze u procesu masovnog probira stanovništva. Međutim, unatoč brojnim izvješćima o "uspjesima" (na ograničenom materijalu), ne postoji imunološka metoda (reproducibilna u "bilo kojim rukama") ili lijek prikladan za te svrhe.

Imunološke metode, posebno serološke studije (određivanje antigena, antitijela) i tuberkulinski provokacijski testovi, široko se koriste u kliničkoj praksi.

Serološke metode, koje određuju antigene i antitijela u različitim okruženjima tijela, na prvom su mjestu među imunološkim studijama koje se koriste u diferencijalnoj dijagnostici.

Specifičnost određivanja antitijela na mikobakterije tuberkuloze ovisi o antigenima koji se koriste u imunološkoj analizi. Predložen je značajan broj antigena, od kojih je prvi tuberkulin PPD:

• PPD i drugi složeni pripravci iz tekućine za kulturu;
• ultrazvučni dezintegrator;
• Tritonov ekstrakt i drugi složeni pripravci staničnih stijenki;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomanan;
• faktor vrpce (trehaloza-6,6-di-mikolat);
• fenolni i drugi glikolipidi;
• lipopolisaharidi;
• antigen koji veže fibronektin;
• proteini (najčešće rekombinantni); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15,12 KDA, itd.

Kao rezultat dugogodišnjeg istraživanja ruskih i stranih znanstvenika, utvrđeni su glavni obrasci stvaranja antitijela i učinkovitost serološke dijagnostike tuberkuloze: što je antigen složeniji, to je osjetljivost veća, a specifičnost testova niža. Specifičnost varira u različitim zemljama ovisno o zaraženosti populacije M. tuberculosis i netuberkuloznim mikobakterijama, o BCG cijepljenju itd. Kod djece je informativnost serodijagnostike niža nego kod odraslih. Kod primarne tuberkuloze (češće kod djece) informativnije je određivanje IgM; kod sekundarne tuberkuloze - IgG. Kod HIV-om zaraženih osoba informativnost serodijagnostike u određivanju antitijela je smanjena. Učinkovitost određivanja antitijela ovisi o nizu "kliničkih trenutaka": aktivnosti procesa (prisutnost ili odsutnost "izolacije" mikobakterija, prisutnost karijesnih šupljina, stupanj infiltracije), prevalenciji procesa, trajanju njegovog tijeka.

Osjetljivost metode enzimskog imunološkog testa (EIA) je oko 70%. Nedovoljna učinkovitost studije posljedica je njezine niske specifičnosti. Prethodno su razmatrane mogućnosti korištenja serološkog probira u skupinama visokog rizika, posebno među osobama s posttuberkuloznim promjenama na plućima.

Kako bi se povećala specifičnost ELISA testa, traže se specifičniji antigeni, uključujući one dobivene genetskim inženjeringom: ESAT-6 itd. (vidi gore). Korištenje strogo specifičnih antigena (38 kDa, ESAT) povećava specifičnost, ali značajno smanjuje osjetljivost analize. Uz ELISA test (eksperimentalni laboratorijski testni sustavi, kao što je Pathozyme ELISA kit), nude se i imunokromatografski kitovi s lateralnom filtracijom (Mycodot), kao i drugi slični testovi (membranska točkasta analiza) s vizualnom procjenom rezultata testa. Prilikom provođenja ovih testova, analiza traje 10-30 minuta; ne zahtijevaju posebnu opremu, već vizualnu procjenu rezultata, što je povezano s određenom subjektivnošću. Ove metode imaju približno iste karakteristike osjetljivosti i specifičnosti (70% odnosno 90-93%) kao i tradicionalni ELISA test.

Korištenje metoda imunološke analize ima određenu vrijednost kao dodatna metoda koja se uzima u obzir u kompleksu metoda koje se koriste u diferencijalnoj dijagnozi tuberkuloze, posebno u dijagnozi njezinih ekstrapulmonalnih oblika. ELISA metoda je najučinkovitija u dijagnozi tuberkuloznog meningitisa pri pregledu cerebrospinalne tekućine. U ovom slučaju, osjetljivost analize je 80-85%, a specifičnost 97-98%. Postoje informacije o učinkovitosti određivanja antitijela na Mycobacterium tuberculosis u suznoj tekućini u dijagnozi tuberkuloznog uveitisa.

Indukcija sinteze gama interferona in vitro

Gama interferon (IFN-γ) je faktor specifične imunološke zaštite, koji se ostvaruje aktivacijom enzimskih sustava makrofaga. Indukcija sinteze IFN-γ senzibiliziranim T-limfocitima uzrokovana je njihovom interakcijom s mikobakterijskim antigenima.

Kao antigeni koriste se i tuberkulin PPD i specifični antigeni dobiveni genetskim inženjeringom, posebno ESAT-6 antigen (rani izlučeni antigen molekularne težine 6 kDa) i CFP-10 (protein filtrata kulture, 10 kDa). Genetski modificirani ili rekombinantni antigeni su odsutni u stanicama BCG cjepiva i drugih mikobakterija. Pri korištenju tuberkulina, rezultati IFN-γ indukcijskog testa usporedivi su s rezultatima tuberkulinskog kožnog testa (izravna korelacija). Pri korištenju genetski modificiranih antigena, rezultati testa su specifičniji i ne ovise o prethodnom BCG cijepljenju. Pri pregledu cijepljenih osoba koje nisu imale kontakt s tuberkulozno infekcijom, specifičnost testa je 99%. Osjetljivost testa među oboljelima od tuberkuloze kreće se od 81 do 89%.

Razvijeni su testovi i dijagnostika temeljeni na kratkotrajnom uzgoju stanica pune krvi ili mononuklearnih stanica izoliranih iz krvi s antigenima tuberkulozne mikobakterije in vitro, nakon čega slijedi određivanje koncentracije IFN-γ ili brojanje broja T-limfocita koji sintetiziraju IFN-γ. Koncentracija interferona sintetiziranog u epruveti određuje se ELISA testom korištenjem monoklonskih antitijela koja vežu IFN-γ. Zatim se, kalibracijom standardnog IFN-γ, određuje njegova koncentracija u epruveti ili jažicama ploče.

U Elispot testu, broj T stanica koje sintetiziraju IFN-γ broji se na površini posude obložene antitijelima protiv IFN-γ.

Razvojni tim in vitro IFN-γ indukcijske dijagnostike, koju je odobrila Američka agencija za hranu i lijekove (FDA), tvrdi da test ne može razlikovati latentnu tuberkulozu od aktivne tuberkuloze. Stoga, u regijama s visokom stopom zaraze, test nema izravnu dijagnostičku vrijednost. Međutim, u našoj zemlji može se koristiti za razlikovanje tuberkulozne infekcije kod djece od alergije nakon cijepljenja, kao i za procjenu razine specifičnog imuniteta tijekom liječenja.

Trenutno se proučava domaći testni sustav za određivanje indukcije sinteze IFN-γ specifičnim antigenima tuberkuloze in vitro.

Imunološki status i tijek tuberkuloze, imunokorekcija

Tijekom liječenja tuberkuloze kod ljudi dolazi do promjena u antigenemiji i stanju imunološkog sustava.

Podaci o promjenama u eksudatima i tkivima uglavnom su kontradiktorni. Jedino što se s punim opravdanjem može primijetiti jest da tuberkulozni granulomi, u pravilu, sadrže značajan broj aktiviranih T-limfocita.

Ima smisla zaustaviti se na još dvije točke koje su potrebne za razumijevanje uloge imunoloških mehanizama u liječenju tuberkuloze kod ljudi:

• Pacijenti s AIDS-om imaju posebno visoku učestalost razvoja višestruke rezistencije na lijekove;
• U slučaju višestruke rezistencije na lijekove (i u odsutnosti HIV infekcije), imunološki poremećaji (prvenstveno imunitet T-stanica) su posebno značajni.

Kod tuberkuloze se široko koriste različite metode imunokorekcije: prije svega, to su lijekovi koji djeluju uglavnom na imunitet T-stanica i mononuklearni fagocitni sustav (timusni hormoni, izofon, likopid, polioksidonij itd.), kao i cijele (atenuirane) mikobakterije i njihove komponente.

Molekularno biološka dijagnostika tuberkuloze

Metode molekularne biologije u dijagnostici zaraznih bolesti uglavnom uključuju metode temeljene na manipulaciji genomskim materijalima bakterijskih i virusnih patogena kako bi se identificirao specifičan genetski materijal - dijelovi DNA s nukleotidnim slijedom specifičnim za određenu vrstu ili soj patogena, za analizu specifičnih DNA slijedova u genima koji određuju osjetljivost patogena na određene lijekove, kao i za analizu funkcionalne aktivnosti određenih gena patogena. Molekularno biološke metode postale su široko rasprostranjene u znanstvenim istraživanjima i praktičnoj primjeni u dijagnostici i praćenju različitih bakterijskih i virusnih infekcija nakon otkrića lančane reakcije polimeraze 1985. godine od strane Carrie Mullis (dobitnica Nobelove nagrade. 1989.).

Principi i mogućnosti metode lančane reakcije polimeraze

PCR omogućuje amplifikaciju (umnožavanje) nukleotidnog niza (fragmenta patogene DNA) u epruveti u nekoliko sati milijunima puta. Provođenje reakcije u prisutnosti pojedinačnih lanaca DNA određuje iznimno visoku osjetljivost analize.

Nukleotidni slijed određenih dijelova lanca DNA određuje genetsku jedinstvenost mikroorganizma, što objašnjava visoku specifičnost PCR-a.

Važnost ove metode za otkrivanje i proučavanje karakteristika Mycobacterium tuberculosis posljedica je bioloških karakteristika mikroorganizma koji ima vrlo spor rast: vrijeme udvostručenja DNA Mycobacterium tuberculosis tijekom njihovog uzgoja je 12-24 sata.

Princip PCR metode je amplifikacija - višestruko, milijun puta umnožavanje dijelova specifičnog DNA niza u mikrovolumenu epruvete s cikličkim ponavljanjem sljedeće tri reakcijske faze, od kojih se svaka odvija u drugom temperaturnom režimu:

• Faza I - denaturacija dvolančane DNA zagrijavanjem s divergencijom njezinih lanaca;
• Faza II - komplementarno vezanje (hibridizacija) primera (priming oligonukleotida) s krajnjim dijelovima lanaca strogo specifičnog fragmenta DNA odabranog za amplifikaciju;
• Faza III – dovršetak lanca fragmenta DNA pomoću termostabilne DNA polimeraze.

Za amplifikaciju, epruveta mora sadržavati molekule matrične DNA. Četiri vrste deoksinukleozid trifosfata (nukleotida) koji sadrže odgovarajuće dušične baze: adenin (A), timin (T), gvanin (G), citozin (C); umjetno sintetizirani početni oligonukleotidi (primeri) koji se sastoje od 18-20 baznih parova; termostabilni enzim, DNA polimeraza, s temperaturnim optimumom od 68-72 ^° C i magnezijevi ioni.

Specifičnost PCR-a ovisi o izboru fragmenta DNA. U skladu s njim sintetiziraju se bočni primeri oligonukleotidi. Specifičnost hibridizacije i dovršetka lanca DNA određena je principom komplementarnosti sljedećih parova dušičnih baza: adenin-timin, gvanin-citozin.

Za određivanje genoma mikobakterija tuberkuloznog kompleksa, najučinkovitija meta amplifikacije u većini testnih sustava je fragment DNA IS6110, koji u većini sojeva mikobakterija tuberkuloze ima značajan broj (10-20) ponavljanja u genomu, što uz specifičnost osigurava i visoku osjetljivost analize. Istodobno, opisani su sojevi mikobakterija tuberkuloze s malim brojem ponavljanja ili odsutnošću fragmenta IS6110.

Ekstrakcija molekula DNA iz biološkog uzorka

Za izvođenje PCR-a, molekule DNA patogena moraju se izolirati iz biološkog materijala u minimalnom volumenu, s minimalnom količinom nespecifične DNA i različitih inhibitora enzima - DNA polimeraze.

Priprema uzoraka mora se provoditi u uvjetima koji sprječavaju unakrsnu kontaminaciju uzoraka koji se proučavaju izoliranim molekulama DNA. To zahtijeva prethodnu obradu prostorije ultraljubičastim svjetlom, podova i radnih površina stolova i uređaja - otopinama koje sadrže klor. Također je potrebno koristiti čiste rukavice, jednokratne epruvete i nastavke za automatske pipete.

Za izolaciju DNA Mycobacterium tuberculosis iz kliničkih uzoraka (cerebrospinalna tekućina, bronhalni ispirak) koji ne sadrže veliki broj leukocita, staničnih ostataka ili soli, dovoljno je centrifugirati uzorak pri 3-4 tisuće okretaja u minuti, dodati 20-30 µl 2%-tne otopine Tritona X-100 u sediment i zagrijavati na 90 ^° C tijekom 30 minuta.

Priprema uzorka sputuma zahtijeva učinkovito ukapljivanje, obično korištenjem 4%-tnog natrijevog hidroksida i N-acetil-L-cisteina (NALC) u koncentraciji od 50-80 mg po uzorku, ovisno o viskoznosti uzorka. Otopina NALC-a treba se pripremiti ex tempore ili se NALC prah može dodati suh izravno u uzorak. Nakon ukapljivanja, uzorke treba centrifugirati 15 minuta pri 3500-4000 okretaja u minuti (3000 g) u epruvetama od 50 ml s navojnim čepom, tj. pod istim uvjetima koji se preporučuju za pripremu sputuma prije kulture.

Za ekstrakciju DNA iz sedimenta najčešće se koristi metoda koja se temelji na korištenju 5-6 molarne otopine gvanidin izotiocijanata kao lizirajućeg reagensa i mikroporoznih čestica silicijevog oksida ("diatomejska zemlja") koje sorbiraju molekule DNA. Nespecifične tvari, uključujući moguće inhibitore, zatim se ispiru u 2,5 molarnoj otopini gvanidin izotiocijanata i otopini etanola, nakon čega se molekule DNA desorbiraju u vodi, a ti se uzorci koriste za izvođenje PCR-a. Kako bi se pojednostavila tehnologija ekstrakcije DNA, "diatomejska zemlja" se često zamjenjuje magnetskim mikročesticama obloženim silicijevim oksidom. U tom slučaju, za taloženje čestica umjesto centrifugiranja koristi se poseban magnetski stalak za mikroepruvete.

U Rusiji je razvijena originalna metoda imunomagnetskog odvajanja mikobakterija s naknadnom ekstrakcijom DNA patogena. Za imunomagnetsko odvajanje mikobakterija tuberkuloze koriste se feročestice veličine 3-5 μm, obložene silicijevim oksidom, na koje su kemijskom vezom vezana poliklonska (zečja) antitijela na mikobakterije tuberkuloze. Uzorci sputuma nakon alkalne lize neutraliziraju se kiselom otopinom Tris-HCl i inkubiraju s imunomagnetskim sorbentom. Zatim se imunoferočestice skupljaju magnetskim štapićem sa zamjenjivim vrhom, prenose u mikroepruvetu i talože. Dodaje se 20-30 μl 2%-tne otopine Triton X-100 i zagrijava 30 minuta na 90 ^° C. Supernatant se koristi kao DNA matrica za PCR analizu.

Težak problem predstavlja ekstrakcija DNA tuberkulozne mikobakterije iz uzoraka biopsije. Za lizu biopsije koristi se enzim proteinaza K u konačnoj koncentraciji od 200-500 mg/l na temperaturi od 56 ^° C preko noći. Zatim se ekstrahira jednom od poznatih metoda. Višak nespecifične DNA u PCR analizi uzoraka biopsije često uzrokuje inhibiciju reakcije, što zahtijeva ponovljenu ekstrakciju DNA.

Metode detekcije rezultata

Nakon završetka reakcije, amplificirani fragmenti patogene DNA identificiraju se različitim metodama.

Metoda gel elektroforeze je dobro poznata. U ovom slučaju, dobiveni fragment DNA identificira se pozitivnom kontrolom koja sadrži željeni specifični fragment DNA ili prethodno poznatom veličinom (brojem nukleotidnih parova) fragmenta, koja se određuje pomoću standardnog molekularnog markera.

U prisutnosti specifične boje - etidijevog bromida, koji je uključen u dvolančanu DNA, sintetizirani fragment DNA otkriva se kao traka koja svijetli pod utjecajem ultraljubičastog svjetla.

Veličina fragmenta DNA, određena elektroforezom na temelju prijeđene udaljenosti od početka, mora odgovarati poznatom markeru molekularne težine ili pozitivnoj kontroli.

Druge metode za određivanje PCR rezultata temelje se na hibridizaciji jednolančanih PCR produkata s komplementarnim oligonukleotidom - DNA sondom obilježenom biotinom, nakon čega slijedi detekcija pomoću enzimske reakcije, na primjer vezanjem konjugata streptavidin-alkalne fosfataze na biotin.

Na temelju ove vrste detekcije stvoreni su PCR analizatori u kojima se detekcija PCR rezultata provodi automatski kao rezultat očitavanja optičke gustoće u uzorcima nakon što je došlo do enzimske reakcije.

Nedostaci ovih metoda uključuju mogućnost intralaboratorijske kontaminacije prilično kratkim fragmentima molekula DNA. Kada te molekule uđu u novo testirane uzorke, postaju matrica za PCR i dovode do lažno pozitivnih rezultata.

U tom smislu, kako bi se spriječili lažno pozitivni rezultati, uvode se stroga pravila za odvajanje i izolaciju prostorija: za ekstrakciju DNK iz bioloških uzoraka; prostorija za detekciju rezultata (elektroforeza) od čiste zone. Ove prostorije predstavljaju zonu vjerojatne kontaminacije. Druga izolirana zona je čista prostorija za unošenje uzoraka DNK koji se proučavaju u epruvete s reakcijskom smjesom za PCR. I na kraju, pretpostavlja se da glavni uređaj - DNK pojačalo - treba iznijeti u zasebnu, moguće uredsku, prostoriju.

Kako bi se spriječila kontaminacija produktima prethodnih reakcija - amplikonima, neki PCR testni sustavi sadrže deoksinukleozid uridin umjesto deoksinukleozidnog timidina, koji se ugrađuje u odgovarajući položaj tijekom in vitro sinteze lanca, tj. dušična baza timin prisutna u nativnoj DNA zamjenjuje se uracilom. Uracil DNA glikozilaza dodana u reakcijsku smjesu analiziranog materijala uništava samo kontaminirajuće fragmente deoksiuridinom, ali ne i nativnu analiziranu DNA koja sadrži deoksitimidin. Naknadno zagrijavanje na 94 ^o C inaktivira ovaj enzim i ne ometa amplifikaciju u PCR-u.

Postoji testni sustav temeljen na izotermnoj amplifikaciji rRNA, za koji se prvo provodi reverzna transkripcija i sinteza molekula DNA, koje pak predstavljaju matricu za naknadnu sintezu molekula RNA. Amplikoni RNA detektiraju se pomoću DNA sonde obojene akridinom tijekom hibridizacije u otopini reakcijske epruvete. Ova metoda, osim visoke osjetljivosti, ima prednost provođenja analize u jednoj epruveti, što sprječava kontaminaciju. Prema autorima, osjetljivost ove metode u respiratornim uzorcima doseže 90% sa specifičnošću od 99-100%.

Nove metode detekcije implementirane su u PCR u stvarnom vremenu. Ove se metode razlikuju prvenstveno po tome što se PCR i detekcija njegovih rezultata provode istovremeno u jednoj zatvorenoj epruveti. To ne samo da tehnološki pojednostavljuje metodu analize, već i sprječava kontaminaciju laboratorijskih prostorija i uzoraka produktima prethodne PCR.

U PCR-u u stvarnom vremenu, rezultati se detektiraju fluorescencijom koja nastaje hibridizacijom fluorogene DNA sonde sa specifičnim fragmentom DNA amplificiranim tijekom PCR-a. Struktura fluorogenih DNA sondi konstruirana je na takav način da se fluorescentni marker oslobađa kao rezultat enzimske reakcije ili se distancira od molekule gasitelja fluorescencije tek nakon specifične hibridizacije sa željenom molekulom DNA amplificiranom tijekom PCR-a. Kako se broj molekula hibridiziranih sa sondom povećava, povećanje fluorescencije do detektabilne razine proporcionalno je broju molekula amplificiranog produkta. Budući da se broj molekula DNA fragmenata udvostručuje tijekom svakog PCR ciklusa, broj ciklusa iz kojeg se detektira i povećava fluorescencija obrnuto je proporcionalan broju molekula DNA u izvornom uzorku. Ako se u reakciju uvede nekoliko različitih poznatih koncentracija molekula odgovarajućeg fragmenta DNA tuberkulozne mikobakterije kao kalibrator, tada se broj DNA genoma u materijalu koji se proučava može izračunati pomoću računalnog programa.

Svaki standardni uzorak se duplicira. Kvantitativni kriterij je minimalni broj PCR ciklusa potreban za početak i rast detektabilne fluorescencije. Apscisa je broj ciklusa; ordinata je vrijednost fluorescencije. Koncentracije DNA obrnuto su proporcionalne broju ciklusa potrebnih za pojavu fluorescencije. Prozori u desnom stupcu (21-32) prikazuju brojeve ciklusa za odgovarajuće koncentracije. Razlike između 10-strukih koncentracija fragmenata DNA 10² ^-10⁶ ml iznose 3,2-3,4 ciklusa. Za dva pacijenta, koncentracije fragmenata IS6110 bile su oko 10³ ^/ml i 10⁴ ^/ ml. Uzimajući u obzir broj ponavljanja (6-20) analiziranih fragmenata u genomu Mycobacterium tuberculosis, broj Mycobacterium tuberculosis u kliničkim uzorcima je oko 100 odnosno 1000 stanica.

Primjena PCR-a u dijagnostici tuberkuloze

PCR metoda se u najvećoj mjeri koristi za brzu dijagnozu tuberkuloze - detekciju Mycobacterium tuberculosis u kliničkim uzorcima: sputumu, bronhijalnim ispircima, pleuralnom eksudatu, urinu, cerebrospinalnoj tekućini, punktatima osteolize, aspiratima ženskog genitalnog trakta i raznim biopsijama. U studiji provedenoj u Nizozemskoj na oko 500 uzoraka sputuma i bronhijalnih ispiraka od 340 pacijenata s potvrđenom dijagnozom plućne tuberkuloze, proučavana je komparativna osjetljivost PCR, kulture i mikroskopije razmaza. Osjetljivost analize bila je 92,6%, 88,9% i 52,4%. Specifičnost svih metoda bila je oko 99%.

Uspoređena je učinkovitost detekcije Mycobacterium tuberculosis pomoću mikroskopije razmaza, sjetve na Lowenstein-Jensen medij, VASTES testnog sustava i PCR analize. PCR je pokazao osjetljivost od 74,4%, mikroskopija - 33,8%, sjetva na čvrsti medij - 48,9% i VASTES - 55,8%. Prosječno vrijeme detekcije za sjetvu na Lowenstein-Jensen medij je 24 dana. VASTES - 13 dana, PCR - 1 dan.

Također se raspravlja o potencijalu korištenja PCR-a kao osjetljive i brze metode za praćenje učinkovitosti liječenja tuberkuloze.

Detekcija DNA Mycobacterium tuberculosis PCR metodom uz učinkovitu kemoterapiju određuje se tijekom duljeg vremenskog razdoblja - u prosjeku 1,7 mjeseci u usporedbi s bakterijskim izlučivanjem određenim fluorescentnom mikroskopijom, te 2,5 mjeseca u usporedbi s bakteriološkim pregledom.

Dijagnoza ekstrapulmonalnih oblika tuberkuloze

Važnost PCR-a kao osjetljive metode posebno je velika za ekstrapulmonalne oblike, budući da su upravo kod tih oblika kliničke i radiološke metode te tradicionalne bakteriološke metode za određivanje Mycobacterium tuberculosis u dijagnostičkim materijalima neučinkovite.

Prilikom pregleda uzoraka urina, rezultati PCR analize bili su pozitivni kod 16 od 17 pacijenata s aktivnom tuberkulozom mokraćnog sustava, a negativni kod 4 pacijenta s inaktivnom bubrežnom tuberkulozom i 39 pacijenata s netuberkuloznim bolestima mokraćnog sustava.

Dokazana je učinkovitost PCR analize u proučavanju aspirata koštane srži u bolesnika s vrućicom nepoznate geneze sa sumnjom na tuberkuloznu prirodu bolesti. Za dijagnozu tuberkuloznog limfadenitisa u djece proučavana su 102 punkcijska aspirata i uzorci biopsije od 67 djece sa sumnjom na tuberkulozni limfadenitis. Pozitivni rezultati dobiveni su: PCR-om u stvarnom vremenu - 71,6%, fluorescentnom mikroskopijom - 46,3%, studijom kulture - 41,8%. U studiji 50 biopsija limfnih čvorova u bolesnika s bolešću mačjeg ogreba, svi rezultati bili su negativni. Dakle, dokazana je 100%-tna specifičnost PCR analize. U istom radu prikazana je mogućnost detekcije M. avium u punkcijskoj biopsiji limfnih čvorova.

Poznato je da je dijagnoza tuberkuloze ženskog genitalnog sustava kod neplodnosti jedan od najtežih dijagnostičkih problema. Pozitivni rezultati dobiveni su PCR studijama biopsija endometrija, aspirata endometrija i uzoraka tekućine iz Douglasovog vrećica kod 14 (56%) od 25 pacijentica pregledanih laparoskopski sa sumnjom na tuberkulozu. Mikroskopski razmaz i studije kulture dale su 1 odnosno 2 pozitivna rezultata. Ovi slučajevi bili su također PCR-pozitivni. Većina PCR-pozitivnih rezultata bila je u slučajevima s karakterističnim značajkama tuberkuloze prema histološkom pregledu; manji broj bio je u slučajevima sa sumnjom na tuberkulozu prema laparoskopiji. Samo jedan pozitivan PCR rezultat dobiven je u nedostatku laparoskopskih podataka za tuberkulozu.

Prilikom dijagnosticiranja izvanplućnih oblika tuberkuloze, kliničari često imaju pitanje o mogućnosti identifikacije uzročnika prilikom pregleda uzoraka krvi PCR metodom. Podaci iz literature ukazuju na to da je detekcija DNA Mycobacterium tuberculosis iz uzoraka krvi moguća kod uznapredovalih oblika HIV infekcije. DNA Mycobacterium tuberculosis otkrivena je samo kod generalizirane tuberkuloze različitih organa kod pacijenata s transplantiranim bubregom i imunosupresijom.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Identifikacija vrsta mikobakterija

PCR metoda može biti prilično učinkovita za brzu identifikaciju mikobakterija tuberkuloznog kompleksa i nekih vrsta netuberkuloznih mikobakterija nakon postizanja njihovog primarnog rasta. U ovom slučaju, korištenje PCR-a može uštedjeti 7-10 dana potrebnih za naknadnu kulturološku identifikaciju pozitivnog rezultata. PCR studija je tehnički vrlo jednostavna, jer ne zahtijeva složenu pripremu uzorka kliničkog materijala za postizanje visoke osjetljivosti. Prilikom ispitivanja 80 pozitivnih kultura u takvom testnom sustavu (MB BacT. tvrtke Organon), svi pozitivni rezultati PCR analize bili su strogo specifični i provedeni su unutar 1 dana. Za identifikaciju drugih vrsta mikobakterija kada se dobiju u kulturi, DNA patogena se hibridizira sa specifičnim DNA sondama označenim akridinom, a sojevi se detektiraju pojavom kemiluminiscencije pomoću kemiluminometra ili na nitroceluloznim trakama s vizualnom procjenom nakon hibridizacije. Ovaj komplet identificira ograničen broj vrsta: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii i M. gordonae.

A. Telenti i suradnici također su razvili relativno jednostavnu i jeftinu metodu za identifikaciju vrsta klinički važnih mikobakterija na temelju PCR-a i naknadne obrade s dva restrikcijska enzima (enzimi koji imaju sposobnost rezanja molekule DNA na određenim točkama). U ovom slučaju, fragment DNA koji kodira protein toplinskog šoka (65 kDa) se amplificira, nakon čega se fragment DNA dobiven PCR-om, veličine 439 nukleotidnih parova, odvojeno tretira s dva enzima - Bste II i Nae III. Zatim se, pomoću elektroforeze na agaroznom gelu, analiziraju dva dobivena produkta, određujući njihove veličine (broj nukleotidnih parova) korištenjem skupa standardnih fragmenata DNA (molekularnih markera DNA) duljine od 100 do 1000 nukleotidnih parova. U svakoj od definiranih vrsta (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) nalaze se 2 ili 3 fragmenta DNA različitih veličina za svaki restrikcijski enzim. Kombinacija rezultirajućih fragmenata DNA različitih veličina omogućuje međusobno razlikovanje ovih vrsta.

Razvija se tehnologija za biološke DNA mikročipove koja će pomoći u identifikaciji više od 100 vrsta mikobakterija u jednoj studiji.

Identifikacija vrste može se provesti i PCR amplifikacijom varijabilne regije 16S rRNA nakon čega slijedi sekvenciranje amplikona u usporedbi s odgovarajućom primarnom strukturom, što omogućuje identifikaciju više od 40 vrsta mikobakterija.

PCR se također može koristiti za identifikaciju vrsta unutar kompleksa tuberculosis mycobacterium, uključujući diferencijaciju između M. bovis i M. bovis BCG. To se radi analizom prisutnosti ili odsutnosti određenih gena u genomskim regijama RD1, RD9 i RD10. RD1 je odsutan u M. bovis BCG, ali je prisutan u virulentnim vrstama, uključujući M. bovis.

Određivanje osjetljivosti Mycobacterium tuberculosis na lijekove pomoću PCR-a

Zadaci molekularno-genetskih metoda za određivanje osjetljivosti ili otpornosti Mycobacterium tuberculosis na lijekove svode se na identificiranje mutacija u određenim nukleotidnim sekvencama poznatih gena. Glavne metode temelje se ili na izravnom očitavanju (sekvenciranju) tih sekvenci nakon amplifikacije ili na hibridizaciji biotinom obilježenih fragmenata DNA amplificiranih tijekom PCR-a s DNA sondama. Obje opcije uključuju identificiranje supstitucija u nukleotidnim sekvencama koje, pri korištenju DNA sondi, dovode do odsutnosti ili nepotpune hibridizacije na nitroceluloznoj membrani pomoću enzimskog konjugata (streptavidin-alkalna fosfataza) - LIPA-Rif-TB metoda.

Metoda mjerenja fluorescencije u lokalno fiksiranim DNA sondama na mikroregijama komplementarnim poznatim mutacijama u PCR-amplificiranim genskim regijama odgovornim za osjetljivost ili otpornost na lijekove naziva se metoda mikrobiočipova. Osnovni algoritam za provođenje ove studije je sljedeći. Nakon što se DNA izolira iz kliničkog uzorka ili mikobakterijske kulture, mora se provesti PCR kako bi se amplificirali odgovarajući fragmenti gena groB odgovornog za osjetljivost na rifampicin ili geni katG i inhA koji kodiraju mikobakterijske proteine odgovorne za osjetljivost na izoniazid. Rezultati PCR-a procjenjuju se elektroforezom na agaroznom gelu, koja potvrđuje primitak odgovarajućih DNA fragmenata željene duljine. Zatim se provodi drugi krug PCR-a kako bi se u DNA uvela fluorescentna oznaka. Rezultati PCR-a ponovno se potvrđuju gel elektroforezom. Nakon toga se provodi hibridizacija (inkubacija preko noći) s naknadnim pranjem dobivenog materijala na biočipu, koji predstavlja veliki broj kratkih lanaca DNA (sondi) fiksiranih na maloj staklenoj ploči, komplementarnih nukleotidnim sekvencama mikobakterija tuberkuloze osjetljivih na lijekove na mjestima mogućih mutacija, kao i mutantnim sekvencama odgovornim za otpornost na lijekove. Položaj DNA sondi na ploči je strogo definiran, a za određivanje rezultata pomoću posebnog uređaja za očitavanje utvrđuje se razina fluorescencije uočena tijekom hibridizacije. U tom smislu, rezultati analize određuju se pomoću posebnog računalnog programa.

Posljednjih godina razvijene su alternativne metode za određivanje osjetljivosti Mycobacterium tuberculosis na lijekove temeljene na PCR tehnologiji u stvarnom vremenu, što omogućuje provođenje ovih studija u zatvorenoj epruveti.

Slika 13-13 prikazuje rezultat analize kliničkih kultura Mycobacterium tuberculosis u određivanju rezistencije na rifampicin korištenjem PCR-a u stvarnom vremenu: 218 - kontrolni uzorak (osjetljiv na rifampicin); 93 - pozitivna kontrola za mutaciju Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - pozitivna kontrola za mutaciju Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - eksperimentalni uzorci. Rezultat izračuna kinetičkih krivulja amplifikacije za 4 kanala: kanal 1: 393 - pozitivna kontrola za mutaciju Ser-Trp TCG-TGG; kanal 2: 4482 - pozitivna kontrola za mutaciju Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - eksperimentalni uzorci; kanal 4: kinetičke krivulje amplifikacije svih uzoraka koji sudjeluju u eksperimentu. Pozitivna kontrola reakcije amplifikacije. Zaključci: Analiza je otkrila sljedeće mutacije koje određuju rezistenciju na rifampicin: u uzorcima 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Isti princip korišten je za određivanje rezistencije na izoniazid genima katG i inhA, koji određuju najčešće mutacije.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Identifikacija soja Mycobacterium tuberculosis

Najproučavanija metoda identifikacije soja Mycobacterium tuberculosis je tehnologija nazvana polimorfizam duljine restrikcijskih fragmenata (RFLP) koja se temelji na fragmentaciji (restrikciji) DNA Mycobacterium tuberculosis enzimom Pvu II i naknadnoj hibridizaciji dobivenih fragmenata s određenim specifičnim sekvencama na DNA njegovog ponavljajućeg elementa IS6110. Intraspecifična varijabilnost ostvaruje se zbog različitog broja ponavljanja IS6110 i njihovog položaja na DNA, kao i raznolikosti udaljenosti između određenih točaka napada restrikcijskog enzima (restrikcijskih mjesta) i elementa IS6110. Ova tehnologija je vrlo složena i radno intenzivna. Nakon tretiranja DNA izolirane iz kulture mikobakterija tuberkuloze restrikcijskim enzimom, provodi se gel elektroforeza, zatim se fragmenti DNA različitih duljina prenose na nitroceluloznu membranu, hibridiziraju s fragmentima elementa IS6110, a rezultati se detektiraju pomoću enzimske reakcije. Rezultirajući specifični uzorak traka karakterizira DNA specifičnog soja mikobakterija tuberkuloze. Računalna analiza otkriva identitet ili srodstvo sojeva. Unatoč činjenici da je RFLP metoda najdiskriminatornija, tj. otkriva najveći broj razlika u analiziranim sojevima, neučinkovita je s malim brojem (manje od 5) IS6110 ponavljanja, uočenih kod nekih sojeva. Slike 13-14 prikazuju rezultate RFLP tipizacije sojeva.

Alternativa može biti metoda spoligotipizacije - analiza polimorfizma razmaknica DNA sekvenci - međupojasa između izravnih ponavljanja DR regije. Prilikom provođenja spoligotipizacije sojeva, PCR se provodi s primerima koji ograničavaju DR regiju, nakon čega se formiraju fragmenti različitih duljina, koji se hibridiziraju s varijabilnim međupojasnicama DNA. Analiza razmaknica DR regije čini se, prema istraživačima, jednostavnijom, produktivnijom i prikladnijom za primarni probir sojeva i preliminarnu epidemiološku analizu, kao i za izravno proučavanje kliničkog materijala.

Očito je da je učinkovitija i tehnološki pristupačnija metoda VNTR (kratica od engleskih riječi), odnosno metoda određivanja varijabilnog broja točnih tandemskih ponavljanja u DNA Mycobacterium tuberculosis. Ova metoda temelji se samo na korištenju PCR-a i ne zahtijeva dodatne manipulacije. Budući da je broj tandemskih ponavljanja u različitim sojevima i u različitim lokusima različit, fragmenti različitih veličina određuju se i analiziraju na dobivenom elektroforegramu PCR produkata. Prema istraživačima, uz pomoć VNTR-a postiže se veći stupanj diskriminacije sojeva nego RFLP metodom.

Posljednjih godina velika se pozornost posvećuje širenju sojeva Mycobacterium tuberculosis iz porodice W-Beijing (ponekad nazvanih soj Peking), koji su uglavnom otporni na lijekove.

Osnovni zahtjevi za kvalitetu molekularno-bioloških istraživanja

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Glavni regulatorni dokumenti za provođenje PCR-a

Naredbe Ministarstva zdravstva Ruske Federacije: br. 45 od 7.02.2000.; br. 109 od 21.03.2003.; br. 64 od 21.02.2000. Smjernice: 1.3.1888-04 "Organizacija rada tijekom PCR istraživanja materijala zaraženog patogenim biološkim agensima III-IV skupina patogenosti"; 1.3.1794-03 "Organizacija rada tijekom PCR istraživanja materijala zaraženog mikroorganizmima I-II skupina patogenosti". 2003.; 3.5.5.1034-01 "Dezinfekcija ispitnog materijala zaraženog bakterijama I-IV skupina patogenosti pri radu PCR metodom", 2001. Dodatak 11 Uputama o jedinstvenim metodama mikrobiološkog istraživanja u otkrivanju, dijagnostici i liječenju tuberkuloze.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Osoblje

Molekularno biološke studije mogu provoditi liječnici kliničke laboratorijske dijagnostike, bakteriolozi, virolozi, biolozi kliničke dijagnostičke laboratorije, kao i specijalisti sa srednjom medicinskom naobrazbom koji su prošli specijalizaciju i usavršavanje na utvrđeni način.

Uređenje laboratorijskih prostora

Potrebna je sljedeća laboratorijska oprema:

• Prostor za obradu uzoraka - laboratorij prilagođen za rad s uzročnicima zaraznih bolesti skupina patogenosti III-IV, u skladu s Metodološkim smjernicama 13.1888-04.
• Prostor za pripremu PCR reakcijskih smjesa je laboratorijska prostorija koja pruža zaštitu od unutarnje laboratorijske kontaminacije - „čisto“ područje.
• • Ako se za analizu PCR produkata koristi elektroforeza ili hibridizacija, laboratorijska prostorija u kojoj se amplificirani fragmenti DNA ekstrahiraju iz amplifikacijske epruvete i, sukladno tome, mogu ući u okoliš, u skladu sa zahtjevima za PCR laboratorije (Metodološke smjernice 1.3.1794-03, Metodološke smjernice 1.3.1888-04) mora biti potpuno izolirana od prostorija navedenih u prethodnim stavcima. Kretanje bilo kojeg osoblja, opreme, bilo kakvih materijala i predmeta iz područja elektroforeze u područje obrade uzoraka i „čisto“ područje, kao i prijenos zraka kroz ventilacijski sustav ili kao posljedica propuha, mora biti isključeno. Ovo područje nije potrebno za fluorimetrijsku detekciju PCR produkata.
• Prostor za dokumentiranje i obradu rezultata opremljen je računalima i potrebnom uredskom opremom. Ovaj prostor može sadržavati opremu koja osigurava detekciju PCR produkata bez otvaranja epruvete. - fluorescentne PCR detektore i termociklere za PCR u stvarnom vremenu.

Sanitarni i epidemiološki zahtjevi za primarnu obradu sputuma slični su standardnim mikrobiološkim zahtjevima za rad s Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Kompletan set laboratorijske opreme za PCR dijagnostiku

Laboratorijski komplet uključuje opremu za sljedeće prostorije.

• Prostor za pripremu uzoraka sadrži sljedeću opremu: laminarnu napu klase zaštite II "SP-1.2": termostat s grijanim poklopcem za Eppendorf epruvete; mikrocentrifugu na 13 000 okretaja u minuti; centrifugu ("Vortex"); hladnjak s temperaturnim rasponom od -20 ^° C do +10 ^° C; pipete promjenjivog volumena serije "Proline"; pumpu s tikvicom za zamjenu OM-1; stalak za pipete; stalak radne stanice 200x0,5 ml; stalak radne stanice 50x1,5 ml; stalci za pohranu epruveta 80x1,5 ml;
• prostorija za pripremu reakcijske smjese: zaštitna komora PCR kutija („Laminar-C. 110 cm); centrifuga „Vortex“; pipete promjenjivog volumena serije „Proline“; stalak za pipete; stalak za radnu stanicu 200x0,2 ml; stalci za pohranu epruveta 80x1,5 ml; hladnjak s temperaturnim rasponom od -20 ^° C do +10 ^° C;
• Prostorija za elektroforezu: horizontalna komora za elektroforezu; izvor napajanja; transiluminator;
• Pojačivač DNA ili analizator nukleinskih kiselina (PCR u stvarnom vremenu) s računalom i softverom; može se smjestiti u bilo koju dostupnu prostoriju. Ako se koristi tehnologija PCR-a u stvarnom vremenu, prostorija za elektroforezu nije potrebna.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Vanjska kontrola kvalitete

Kako bi osigurali objektivno pouzdane rezultate, laboratoriji moraju sudjelovati u sustavu vanjske procjene kvalitete laboratorijskih istraživanja.

Sudionici sustava kontrole kvalitete primaju: 12 ampula s liofiliziranim suspenzijama bakterijskih stanica, od kojih dvije sadrže E. coli, 3 ampule s mikobakterijama tuberkuloze (avirulentni soj) u koncentraciji od 10² ^/ ml; 3 ampule sa stanicama sličnog soja u koncentraciji od 10² ^/ ml; 2 ampule s netuberkuloznim mikobakterijama M. avium-intracellulare i M. kansasii u koncentraciji od 10³ ^/ ml.

Testovi poslani na vanjsku procjenu kvalitete prethodno se testiraju u dva neovisna laboratorija s bogatim iskustvom u ovom području.

[ 85 ], [ 86 ]