Laboratorijska dijagnoza tuberkuloze

Tuberkuloza je bolest koja se lako dijagnosticira u suvremenim uvjetima i znanstvenim dostignućima. Laboratorijska dijagnoza tuberkuloze središnje je za druge dijagnostičke metode, a drugo samo za rentgenske metode istraživanja.

[1], [2], [3], [4],

Kliničko ispitivanje krvi

U bolesnika s tuberkulozom, promjene u općoj analizi krvi nisu patognomonične. S ograničenim i neaktivnim oblicima tuberkuloze, eritrocit je hipokromni u normalnoj količini. Kad masivne infiltrati ili kazeozne upala pluća, dok je prevalencija kazeozne limfadenitisu, specifične crijevne lezije, kao i za velike plućnim ili postoperativnog krvarenja i bilješku erythropenia mikrocitoze, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrocitoza, a osobito puikilotsitoz se susreću mnogo rjeđe, obično s teškom anemijom. Broj retikulocita u koraku tuberculosis kompenzacijom u rasponu od 0,1 do 0,6%, a subcompensated - od 0,6 do 1,0% i 1% karakterizira dekompenzacije retikulocita.

Kada tuberkuloze u nekim slučajevima može doći do umjerenu leucocytosis (do 15 tisuća leukocita.), Manje zračenja, koje se javljaju u 2-7% bolesnika s ograničenim i jednostavan proces događa oblicima i na 12,5% - destruktivna i progresivne plućne tuberkuloze ,

Najčešći pomak pojavljuje se u leukocitnoj formuli. Označite i relativnu i apsolutnu neutrofiliju, umjereni pomak leukocitne formule lijevo prije promijelocita. Mijelociti su vrlo rijetki u slučaju nekomplicirane tuberkuloze. Povećanje broja neutrofila s abnormalnim zrna u bolesnika haemogram TB uvijek ukazuje na trajanje postupka: u bolesnika s teškim tuberkuloze gotovo svi neutrofili sadrže abnormalne žita. Kada epidemija tuberkuloze prestane, nuklearni pomak relativno brzo pristupa normama. Patološka granularnost neutrofila obično traje dulje od ostalih promjena u hemogramu.

Sadržaj eozinofila u perifernoj krvi također varira ovisno o fazi procesa i alergijskom stanju organizma. Njihov broj smanji do aneozinofiliya u teškim i produljeno izbijanja bolesti i, s druge strane, kao što se povećava resorpciju infiltrata i pleuralnog izljeva, kao i rane oblike primarne tuberkuloze.

Većina oblika primarne tuberkuloze popraćena je limfopenijom koja se ponekad opaža niz godina, čak i nakon ožiljaka specifičnih promjena. Sekundarna tuberkuloza u fazi egzacerbacije, ovisno o težini postupka, može biti popraćena ili normalnim brojem limfocita ili limfopenije.

Ona zauzima posebno mjesto odlučujući brzinom taloženja eritrocita dodatne testove za procjenu tuberkulozan proces (ESR) koja ima vrijednost u procjeni procesa tuberkuloze protoka i upoznavanja njegovih aktivnih oblika. Povećanje ESR ukazuje na prisutnost patoloških procesa (infektivnih upala, septički gnojna, hemoblastosis, Hodgkin et al.) I govori o njegovoj težini, ali normalne razine ESR nije uvijek pokazuju odsutnost patologije. Ubrzavanje eritrocita sedimentacije je olakšano povećanjem sadržaja globulina, fibrinogena, kolesterola u krvi i smanjenja viskoznosti krvi. Usporavanje eritrocita sedimentacije karakteristično je za stanja koja su pratila hemoconcentracija, povećanje sadržaja albumina i žučnih kiselina.

Hemogram u bolesnika s tuberkulozom mijenja tijekom liječenja. Hematološke smjene nestaju brže, to je uspješnija terapijska intervencija. Međutim, valja imati na umu učinak na hemopoezu različitih antibakterijskih lijekova. Često uzrokuju eozinofiliju, u nekim slučajevima - leukocitozu, a češće leukopenija do agranulocitoze i limfoid-retikularne reakcije. Sustavna hematološka kontrola i ispravna analiza dobivenih podataka bitni su za procjenu kliničkog stanja pacijenta, dinamiku procesa i učinkovitosti korištene terapije.

[5], [6], [7], [8], [9],

Klinička analiza urina

Kod tuberkuloze mokraćnog sustava, analiza urina je glavna laboratorijska dijagnostička metoda. Možete pratiti leukociturija, eritrociturija, proteinurija, hypoisistentura, tuberkuloza mycobacterium, nespecifična bakteriurija.

Leukociturija je najčešći simptom tuberkuloze mokraćnog sustava prije nego što se izvodi specifična kemoterapija i odsutna je samo u izuzetnim slučajevima, na primjer, uz potpuno uništavanje ureteralnog lumena. Nechyporenko Test (određivanje broja leukocita u 1 ml mokraće) pomaže da objektivnije procijeniti stupanj leukocyturia nefrotuberkuloze sa, te u nekim slučajevima to prepoznati u normalnom urina. Međutim, treba uzeti u obzir da se leukociturija mogu pojaviti u akutnom i kroničnom pijelonefritisu, cistitisu, uretritisu, kamenci i bubrega i uretera.

Eritrotsiturii. Kao i leukociturija. Smatraju se jednim od najčešćih laboratorijskih znakova tuberkuloze genitourinarnog sustava. Učestalost hematurije ovisi o prevalenciji procesa, povećava se kada se proces razaranja tuberkuloze razvija u bubrezima. Eritrociturija bez leukociturija je tipičnija za rane stadije bubrežne tuberkuloze. Hematurija, koja prevladava nad leukociturija, važan je argument u korist bubrežne tuberkuloze u njegovoj diferencijaciji s nespecifičnim pijelonefritisom.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Biokemijski test krvi

Kod tuberkuloze, promjene u nekim biokemijskim parametrima ovise prvenstveno o fazi procesa, komplikacija i raznih popratnih bolesti. U bolesnika s neaktivnom tuberkulozom pluća i drugih organa, ukupne proteinske i proteinske frakcije krvnog seruma su nepromijenjene i određuju njihov normalan sadržaj.

U akutnim oblicima bolesti, kao i kod pogoršanja i napredovanja kroničnih oblika tuberkuloze, koeficijent albumin-globulin smanjuje se.

Bitno u procjeni funkcionalno stanje organskih oštećenja jetre i tuberkuloze i komplikacije je određivanje ukupnog serumskog i izravna bilirubin, AST (ACT), alanin aminotransferaze (ALT). Dinamičko određivanje razine aminotransferaza. Bilirubin u liječenju bolesnika s tuberkulozom, osobito u teškim oblicima, je obvezna komponenta biokemijskog pregleda bolesnika s tuberkulozom i obavlja se mjesečno.

Procjena funkcionalnog stanja bubrega uključuje određivanje serumskog kreatinina i izračunavanje brzine glomerularne filtracije prema Cockcroft-Gaultovoj formuli. Izračunavanje brzine glomerularne filtracije pomoću Rebergovog uzorka daje manje točne rezultate.

Glavni cilj dinamičkih biokemijskih istraživanja bolesnika s tuberkulozom je praćenje tijeka procesa, pravodobno otkrivanje nuspojava lijekova i adekvatna korekcija nastalih homeostaških poremećaja.

[17], [18], [19]

Primjena biokemijskih metoda istraživanja u izvanpulmonalnoj tuberkulozi

Najobojljiviji pokazatelj je sadržaj tuberkulostearne kiseline u biološkim tekućinama, ali njegova definicija je povezana s tehničkim poteškoćama (potreba za plinskom kromatografijom i masenom spektrometrijom).

Prospektivno mjerenje aktivnosti adenozin deaminaze - enzim, određen u tekućinama: sinovijalno, perikardijalno, ascitesno ili spinalno. Glavni proizvođači adenozin deaminaze su limfociti i monociti. Određivanje adenozin deaminaze aktivnosti u biološkim tekućinama olakšava dijagnozu tuberkulozan sinovitis, tuberkuloza limfnih čvorova, tuberkulozan meningitisa, tuberkulozan serozity.

Neki biokemijski pokazatelji zbog njihove nespecifičnosti određeni su samo u biološkim tekućinama, blizu fokusa lezije. Izmjerite razinu pokazatelja kao odgovor na subkutanu ili intradermalnu injekciju tuberkulina (obično prije i 48 i 72 sata nakon toga). Nakon toga izračunava se stupanj povećanja razine marker (u%) u odnosu na početnu razinu.

Optimalno određivanje urina djelovanja organskog specifičnog enzima transamnidaze, čiji je izgled zabilježen u porazu bubrega različite prirode. Proučavanje transamidinaze opravdano je samo pod uvjetima subkutane injekcije tuberkulina kako bi se pogoršalo lokalni upalni proces. Odredite aktivnost transamidina u mokraći u početku i 24-72 sata nakon uvođenja 50 TE tuberkulina. Proširivanje fermentacije u dva puta i više omogućava u 82% slučajeva razlikovanje aktivne tuberkuloze bubrega od pogoršanja kroničnog pijelonefritisa.

Kod tuberkuloze ženskih genitalnih organa, koncentracije haptoglobina i malonskog dialdehida u krvi određuju se u uvjetima provokativnog tuberkulinskog testa. Subkutano ubrizgavan tuberkulin u dozi od 50 TE i 72 sata kasnije izvršio je drugu biokemijsku studiju. U slučaju etiologije tuberkuloze, stupanj povećanja razine haptoglobina nije manji od 28%, a razina malondialdehida iznosi 39% ili više. Također se koristi određivanje aktivnosti adenozin deaminaze u peritonejskoj tekućini dobivenoj iz Douglasovog prostora. Punkta se preispituje 72 sata nakon intradermalne injekcije tuberkulina u dozama od 0,1 TE i 0,01 TE u projekciju unutarnjih genitalnih organa na prednjoj trbušnoj stijenki. U korist tuberkularnog procesa povećanje aktivnosti adenozin deaminaze je 10% ili više u usporedbi s početnim.

Kada se oku ponaša, ispitana je fokalna reakcija koja se javlja u oku kao odgovor na antigensku stimulaciju. Neželjeno je razviti izražen odgovor, uz smanjenje vizualnih funkcija. Budući da je procjena minimalnih žarišnih reakcija često teško, za objektivizaciju zaključka preporučuje se paralelno usmjeravanje i stupanj rasta krvnog seruma haptoglobina ili adenozin deaminaze.

Sve biokemijske studije treba provesti u kombinaciji s drugim metodama.

[20], [21], [22], [23],

Istraživanje sustava koagulacije krvi

Relevantnost statusa istraživanja sustava zgrušavanja krvi tuberkuloze je uzrokovano prisustvom većeg broja pacijenata s plućne tuberkuloze hemoptiza ili plućnog krvarenja, kao i komplikacija hemocoagulation na kirurško liječenje tuberkuloze. Osim toga, latentni protok intravaskularne hemokoagulacije koji prirodno prati tuberkulozu utječe na tijek bolesti i učinkovitost kemoterapije.

U bolesnika s plućnom TB prevalencije eksudativni upale komponente promatranog pada antikoagulacijskom krvi aktivnosti. Kod pacijenata s niskim raširenosti određenog lezije u plućima s prevlast produktivni hemocoagulation intravaskularne upalnom komponentom blago izražena. U bolesnika s plućnom tuberkulozom s hemoptiza i sistema zgrušavanja krvi plućna hemoragija državne razlikuje: u bolesnika s niskim gubitkom krvi na visini gemoptoe ili neposredno nakon njegovog prestanka je oštar porast u zgrušavanja krvi sposobnosti zbog teškog intenziviranje trombinoobrazovaniya zadržavajući povećan „strukturni” zgrušavanje. U bolesnika s masivnim gubitkom krvi opaža se smanjenje koagulacijskog potencijala uslijed smanjenja koncentracije fibrinogena. Aktivnost faktora XIII, broj trombocita. U fazi kirurškog liječenja, bolesnici s ograničenim oblicima tuberkuloze ne osjećaju blage značajne poremećaje sa sustavom homeostaze. Bolesnici s raširenom procesa u izvršavanju pnevmon- ili plevropnevmonektomii često razvijaju DIC, što može biti u obliku „drugu bolest.”

Da prati stanje koagulacije krvi u bolesnika s plućna tuberkuloza treba provesti određivanje aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (aPTT), fibrinogen, trombinskog vremena, indeks protrombinsko vrijeme i krvarenja i vremena koagulacije.

[24], [25], [26], [27], [28]

Hormonalna istraživanja

Suvremena eksperimentalna i klinička opažanja ukazuju na prisutnost promjena u hormonskom statusu u određenoj tuberkuloznoj upali pluća. Dokazano je da se korekcija disfunkcije hipofize, nadbubrežne žlijezde hipofize-tiroidni sustava i funkciju gušterače u kombinaciji s anti-TB terapiju doprinose aktiviranje fibrogeneze i popravka na određeni upale lokusa.

Radno stanje u hipofizi štitnjače sustav ocjenjuje po sadržaju u krvnom serumu trijodtironin (T ₃ ), tiroksina (T ₄ ), hipofize štitnjače stimulirajućeg hormona (TSH). Utvrđeno je da supklinička hipotireoza otkrivena je u 38-45% bolesnika s tuberkulozom pluća, a najčešće se s distribuiraju i fibro-kavernozan oblici procesa dijagnoze. Pod istim oblicima većina znatno smanjene razine oba T ₃ i T ₄, te dolazi neravnoteža ovih hormona u obliku povećavajući omjer T ₄ / T _s.

Nadbubrežne funkcije procijenjena je razina kortizola u krvnom serumu, i endokrine funkcije pankreasa - koncentracije imuno-reaktivni inzulin. U akutnoj fazi zarazne bolesti, povećava se potreba za endogenim kortizolom i inzulinom. Hiperinzulinemija također dokazuje inzulinsku otpornost tjelesnih tkiva, što je tipično za bilo koji aktivni upalni proces, naročito specifičan. Određivanje glukokortikoidne funkcije nadbubrežnih žlijezda aktivnom plućnom tuberkulozom omogućuje otkrivanje prisutnosti hiperkorticizma kod većine bolesnika. Normalne razine koncentracije kortizola u krvi kod pacijenta s infektivnim upale u akutnoj perioda treba smatrati relativne neuspjeh glukokortikoidnog funkciju kore nadbubrežne žlijezde koji može služiti kao temelj za držanje doza odgovarajuću zamjensku terapiju glukokortikoida.

Gotovo trećina bolesnika s plućnom tuberkulozom može ustanoviti da je razina insulinemije u njima prilično niska i da se približava nižoj granici norme, dok 13-20% promatra značajan hiperinzulinizam. I relativni hipo- i hiperinzulinizam su visoki čimbenici rizika za razvoj kršenja metabolizma ugljikohidrata u različitim stupnjevima. Ove promjene u funkcionalnoj aktivnosti B stanica gušterače zahtijevaju redovito praćenje glikemije kod bolesnika s tuberkulozom i pravovremenu prevenciju dijabetes melitusa. Osim toga. Ovo služi kao dodatno opravdanje za svrhovito korištenje fizioloških doza inzulina u složenoj terapiji tuberkuloze.

Općenito, niže razine hormona štitnjače i njihova neravnoteža hypercortisolemia i hiperinzulinizma najveći doseg u bolesnika s teškim tijekom tubercular procesa, s velikim oštećenja pluća i teške simptome tuberkuloze opijenosti.

Mikrobiološka dijagnoza tuberkuloze

Mikrobiološki studije su potrebne u identifikaciji bolesnika s tuberkulozom, verifikaciju dijagnoze, praćenje i korekciju kemoterapije ocjenjuju ishod liječenja, drugim riječima, od registracije tuberkuloze pacijenta prije nego je izvadite iz Registra.

Svi epidemiološki programi i projekti temelje se na procjeni broja bakterijskih excretora, što se ne može učiniti bez uporabe laboratorijskih metoda za detekciju mikobakterija tuberkuloze. U istraživanju takozvane neorganizirane populacije, postotak bakterijskih napadača doseže 70 ili više, što čini laboratorijske metode dovoljno učinkovito sredstvo za identificiranje bolesnika s tuberkulozom u ovoj populacijskoj skupini.

Tradicionalne mikrobiološke metode za dijagnosticiranje tuberkuloze su bakterioskopske i studije kulture. Suvremene metode uzimaju u obzir uzgoj mycobacterium tuberculosis u automatiziranim sustavima, postavljanje PCR-a. Međutim, sve ove metode nužno se kombiniraju s klasičnim bakteriološkim metodama.

Prikupljanje dijagnostičkog materijala

Učinkovitost laboratorijskih istraživanja ovisi u velikoj mjeri o kvaliteti dijagnostičkog materijala. Sukladnost s pravilima za prikupljanje, skladištenje i transport dijagnostičkog materijala i točna provedba algoritma za procjenu pacijenata izravno utječe na ishod i osigurava biološku sigurnost.

Za testiranje na tuberkulozu koriste se razni materijali. S obzirom na činjenicu da je TB logkih- najčešći oblik tuberkuloznih lezija, osnovni materijal za istraživanja u obzir ispljuvak i druge vrste odvojivim Traheobronhalno: gornjeg respiratornog sekreta trakta dobivene nakon inhalacije aerosola: bronhija ispiranja; bronhoalveolarne ispirke; materijal dobiven bronhoskopija, a intrapulmonalno transtracheal Biopsije bronhijalne aspirata, grkljana, obuću eksudata iz rane i mrlja al.

Učinkovitost istraživanja povećava se ako se provodi kontrolirana zbirka materijala od pacijenta. U tu svrhu dodjeljuje se posebno opremljena soba ili se kupuju posebne kabine. Zbirka materijala je opasna procedura, stoga je potrebno prikupiti materijal za istraživanje, pridržavajući se pravila zarazne sigurnosti.

Materijal za testiranje na mycobacterium tuberculosis sakupljen je u sterilnim bocama s čvrsto navijenim kapicama kako bi se spriječila kontaminacija okoliša i zaštitili prikupljeni materijal od onečišćenja.

Bočice za prikupljanje dijagnostičkog materijala moraju ispunjavati sljedeće uvjete:

• mora biti izrađena od materijala otpornih na udarce;
• treba lako rastopiti tijekom autoklaviranja;
• biti dovoljno volumena (40-50 ml):
• imaju široki otvor za prikupljanje sputuma (promjer ne manji od 30 mm);
• biti lako rukovanje, prozirna ili prozirna, tako da možete procijeniti količinu i kvalitetu prikupljenog uzorka bez otvaranja poklopca.

Da bi se dobili optimalni rezultati istraživanja, moraju se pridržavati sljedećih uvjeta:

• Prikupiti materijal prije početka kemoterapije;
• materijal za ispitivanje mora se prikupiti prije jutarnjeg unosa hrane i lijekova;
• za istraživanja poželjno je prikupiti barem 3 uzorka jutarnje sluzi. Prikupiti ispljuvak 3 uzastopna dana;
• prikupljeni materijal mora se dostaviti u laboratorij što je prije moguće:
• u slučaju kada je odmah nemoguće isporučiti materijal u laboratorij, pohranjuje se u hladnjak pri temperaturi zraka od 4 ° C ne više od 48 sati;
• Pri transportu materijala potrebno je pažljivo pratiti integritet bočica.

Ispravno prikupljeni sputum je sluzav ili mukopurulentan. Optimalni volumen ispitivanog sputuma iznosi 3-5 ml.

Sputum se skuplja pod nadzorom liječnika. Osobe odgovorne za prikupljanje ispljušta trebaju slijediti provedbu određenih pravila:

• potrebno je objasniti pacijentu svrhu studije i potrebu za kašlju ne slinom ili nazofaringealnom sluzi, već sadržaj dubokog dišnog trakta. To se može postići kao rezultat produktivnog kašlja koji se javlja nakon nekoliko (2-3) dubokih udisaja. Također je potrebno upozoriti pacijenta da treba isprati usta kuhana voda, ukloniti glavni dio mikroflore koji raste u usnoj šupljini i ostacima hrane koji ometaju ispitivanje sputuma;
• medicinski radnik koji sudjeluje u prikupljanju sputuma, uz ogrtač i šešir, mora nositi masku, gumene rukavice i gumenu pregaču;
• stoji iza bolesnika, preporuča se da bočica bude što bliža usnama i odmah ga razdvoji u sluznicu dok kašlja, a mora se predvidjeti da je strujanje zraka odvojeno od zdravstvenog radnika:
• Po dovršetku sputuma, zdravstveni djelatnik treba pažljivo zatvoriti bočicu s poklopcem i procijeniti količinu i kvalitetu prikupljenog sputuma. Zatim se bočica označi i stavlja u poseban bix za transport u laboratorij.

Ako pacijent ne proizvodi sluz, noć prije i ujutro na dan sakupljanja materijala potrebnog da mu ekspektorans :. Ekstrakt korijena bijelog sljeza (mukaltin), bromheksin, ambroksol, itd - ili primijeniti iritirajuću udisanje korištenjem oprema ugrađena u sobi za prikupljanje ispljuvak. Tako prikupljeni materijal ne podliježe očuvanju i treba ga ispitati na dan sakupljanja. Kako bi izbjegao njegovo "uklanjanje" u laboratoriju u smjeru treba napraviti poseban znak.

Ako mikrobiološke studije nisu provedene u ovom postrojenju, prikupljeni dijagnostički materijal treba dostaviti u laboratorij, pod uvjetom da se materijal čuva u intervalima između isporuke u hladnjaku ili uporabom konzervansa. Dostaviti materijal u laboratorij u transportnim kutijama, koji se mogu lako dezinficirati. Svaki uzorak trebao bi biti priložen odgovarajućoj etiketi, a cjelokupna se cjelina popunjava priloženim obrascem.

[29], [30], [31],

Načini i učestalost ispitivanja bolesnika

U početnom, tzv. Dijagnostičkom pregledu pacijenta za tuberkulozu, potrebno je ispitati najmanje 3 sputuma tijekom 2 ili 3 dana. Prikupljene pod nadzorom medicinskog osoblja, što povećava učinkovitost mikroskopije.

Primarni screening za tuberkulozu treba provoditi sve medicinske dijagnostičke institucije zdravstvenog sustava. Nedavno su na osnovi kliničkih dijagnostičkih laboratorija organizirani takozvani centri mikroskopije, opremljeni modernim mikroskopima i opremom za sigurnost epidemije, kako bi se poboljšala učinkovitost početnog ispitivanja.

U anti-tuberkuloznim sredstvima koristi se probirni test koji uključuje trošenje sputuma ili drugi dijagnostički materijal najmanje 3 puta tijekom 3 dana. Tijekom liječenja, mikrobiološke studije redovito se provode barem jednom mjesečno tijekom intenzivne kemoterapijske faze. Pri prijelazu na fazu liječenja, studije se provode rjeđe - s intervalom od 2-3 mjeseca, dok se učestalost studije smanjuje na dva.

Značajke zbirke dijagnostičkih materijala za extrapulmonalnu tuberkulozu

U fokusu patološki materijal izvanplućni oblika TB - Mycobacterium tuberculosis niske koncentracije u njemu, što zahtijeva više osjetljive metode mikrobioloških studija, u prvom redu o rangiranju tehnike medija.

Uz tuberkulozu genitourinarnog sustava, urin je najdostupniji materijal za proučavanje. Zbirku urina treba obaviti posebno obučena medicinska sestra.

Vanjske genitalije se isperu vodom sapunom ili slabom otopinom kalijevog permanganata. Vanjsko otvaranje uretre pažljivo se obrađuje. U sterilnoj bočici se skuplja prosječni dio jutarnje urine: u muškaraca, naravno, kod žena, koristeći kateter. Urin iz bubrežnog zdjelice skuplja se u sterilnim epruvetama s kateterizacijom jednog ili dva bubrega, u potonjem slučaju - nužno odvojeno od svakog bubrega. Mala količina ovog urina se centrifugira, sediment se ispituje.

U muškaraca, spermija, punktati testisa, tajna prostate podvrgava se centrifugaciji da bi se dobio talog. S bilo kojom lokalizacijom određenog procesa u genitalnom području kod muškaraca, masaža prostate može potaknuti izlučivanje sekreta koje sadrže mycobacterium tuberculosis.

Menstrualna krv u žena prikuplja se sisanjem ili pomoću Kafka kape. Dobiveni materijal se oslobađa iz crvenih krvnih stanica, pranje je destiliranom vodom nakon čega slijedi centrifugiranje. Precipitat se ispituje.

Dijelovi cervikalnog kanala maternice sakupljaju se u nekom Kafka kapacitetu ili poklopcu, tj. Poželjno je akumulirati 1-2 ml patoloških materijala.

Materijal dobiven od operativnih intervencija na bubrege, genitalije. S biopsijama, strugotine iz endometrija, homogenizirati. Da bi to postigao, stavlja se u sterilni mort i temeljito zdrobi sterilnim škarama. U ovaj mulj doda se sterilne riječni pijesak u količini jednakoj svoje težine, a zatim prekrije sa 0,5-1.0 ml izotonične otopine natrijevog klorida, i sve se triturira sve dok masa u obliku paste sa dodatkom izotonične otopine natrijevog klorida (4-5 ml). Zatim se masi ostavlja da se otopi 1-1.5 minuta, pregledava se supernatant.

Tuberkuloza kostiju i zglobova. Pucnja (gnoj apscesa) dobivena sterilnom špricom stavlja se u sterilna posuđa i odmah se dostavlja u laboratorij. Sterilni pipeta, prethodno navlažen sa sterilnom izotoničnom otopinom natrijevog klorida, uzeti 2-5 ml gnoj, se prenese u bočicu od zrnaca doda se još i 2-3 ml izotonične otopine natrijevog klorida. Bočica je zatvorena plutom i potresana u aparat za jarbol 8-10 minuta. Ispitana je homogenizirana suspenzija.

U fistuliranim oblicima osteoartikularne tuberkuloze uzima se gnoj iz fistula. Veliko iscjedak prikuplja se izravno u epruvetu. U slučaju naslanjanje pyorrhea fistula ispere sterilnom izotoničnom otopinom natrijevog klorida i isprani dijelovi su sakupljeni u epruvetu ili komad tampon impregniran gnoj poslan na analizu.

Kirurški materijal dobiven tijekom operacije na kostima i zglobovima mogu se sastojati od gnojne-nekrotično masa, granulacija, ožiljak, koštano tkivo sinovijalne membrane i druge podloge. Liječenje se provodi, kao u tuberkulozi bubrega.

Mikrobiološko ispitivanje sinovijalne tekućine u 3% -tnoj otopini natrijevog citrata (omjer 1: 1), kako bi se spriječila zgrušavanje, vrši se neposredno nakon probijanja.

Tuberkuloza limfnih čvorova. Također se ispituje gnoj, ekstrahiran tijekom probijanja limfnih čvorova. Kao gnoj od apscesa. Tkiva limfnih čvorova dobiveni tijekom kirurških zahvata, biopsija, ispituju se, kao i kod drugih oblika tuberkuloze.

Istraživanje masnih stolica na mycobacterium tuberculosis je vrlo rijetko, zbog gotovo ukupnog nedostatka pozitivnih rezultata.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacterium microscopy

Sputum mikroskopija je relativno brz, jednostavan i jeftin način koji se treba koristiti u svim slučajevima sa sumnjom na tuberkulozu. Osim toga, ovo se istraživanje provodi radi procjene učinkovitosti kemoterapije i utvrđivanja oporavka ili neuspjeha liječenja ako ne postoji test kulture.

Koriste se dvije metode mikroskopskog pregleda:

• metoda izravne mikroskopije, kada se umetak izrađuje izravno iz dijagnostičkog materijala;
• metoda mikroskopije sedimenta pripremljenog iz materijala tretiranog dekontaminantom za kulturu.

Prva metoda se koristi u onim laboratorijima gdje se provode samo mikroskopske studije (klinički i dijagnostički laboratoriji opće medicinske mreže).

Najbolji rezultati mikroskopskog pregleda dobiveni su koncentracijom dijagnostičkog materijala (na primjer centrifugiranjem).

Za otkrivanje mikobakterijskih tuberkuloza s vjerojatnošću od 50% za vrijeme mikroskopije, 1 ml ispljuvka trebalo bi sadržavati više od 5000 mikrobnih stanica. Ispljuvak bolesnika s plućnim oblicima tuberkuloze obično sadrži značajnu količinu kiselih bakterija, što im omogućuje pouzdano otkrivanje bakterioskopijom. Dijagnostička osjetljivost ove metode može se poboljšati ispitivanjem nekoliko uzoraka sputuma jednog pacijenta. Negativan rezultat bakteriskopskog pregleda ne isključuje dijagnozu tuberkuloze, jer ispljuvak nekih bolesnika sadrži manje mikobakterija nego što se može detektirati mikroskopom. Loša priprema nogu ista može također uzrokovati negativni rezultat bakteriskopskog pregleda.

Najčešća metoda detekcije kiselih mikobakterija u testu je boja prema Tsiol-Nelsenu. Metoda se temelji na karbolnu penetracija fuksina na membranu koja sadrži mikrobne stanice voska lipidni sloj s istovremenim djelovanjem topline i jakog djelovanje Etchant fenola. Naknadna obezbojenost premaza s 25% otopinom sumporne kiseline ili 3% klorovodične kiseline dovodi do obezbojenja svih ne-kiselih brzih struktura. Odbojeni elementi premaza se oboje s 0,3% -tnom otopinom metilenskog plavog. Mikobakterija ne percipira uobičajene boje anilina, zbog čega su kiselinski brzi mikobakteri obojeni grimizno crvenom bojom i drugi mikrobovi i stanični elementi - u plavoj boji.

Za mrlja obojene Ziehl-Nelsenu korištenje binokularnog svjetlosni mikroskop s objektivom za uljnu imerziju (90- ili 100-struko povećanje) i okulara u 7- do 10-struko povećanje. Istražite 100 vidnih polja, što je dovoljno za identificiranje pojedinačnih mikobakterija u smearu. U slučaju da je rezultat takvog istraživanja negativan, za potvrdu preporučuje se pogledati još 200 vidnih polja. Zabilježite rezultate, ukazujući na broj otkrivenih kiselih bacila (KUM).

Osim ove tehnike, fluorochroms boja se koriste za luminescentnu mikroskopiju, što omogućuje postizanje najboljih rezultata. Upotreba ove metode povećava učinkovitost mikroskopije za 10-15%. Kod liječenja mikobakterija s luminiscentnim bojama (auramin, rodamin, itd.), Te se tvari također vežu na strukture voska mikrobne stanice. Kada zrači obojene stanice uz uzbudljiv izvor svjetlosti (određeni spektar ultraljubičastog zračenja), počinju sjajiti s narančastim ili svijetlo crvenim svjetlom na crnoj ili tamnozelenkastoj pozadini. S obzirom na visoku svjetlinu i kontrast vidljive slike, ukupni uvećanj mikroskopa može se smanjiti 4-10 puta, vidno polje se širi i vrijeme gledanja pripravka se smanjuje. Uz to, zbog mnogo veće dubine polja, možete povećati udobnost studije.

Kada se fluorescentna mikroskopija upotrebljava za gledanje istog područja, razmaz se znatno manje vremena provodi nego kod svjetlosne mikroskopije Tsiol-Nelsen bojenja. Ako za radni dan mikroskop ispituje oko 20-25 takvih razmaza, tada uz pomoć fluorescentne mikroskopije istodobno može ispitivati više od 60 do 80 uzoraka. Iskusni mikroskopi znaju da je obojenost stanica s mješavinom auramina i rodamina na neki način specifična za kiselinski brzi bacili, koji u ovom slučaju izgledaju kao zlatni štapići. Saprofiti su oslikani u zelenkastoj boji.

Još jedna važna prednost metode fluorescentne mikroskopije - sposobnost detekcije promijenjen Mycobacterium, izgubio pod utjecajem nepovoljnih čimbenika, uključujući intenzivne kemoterapije, kislotousotoychivosti imovine i ne prepoznaje se u vezi s ovim bojenja Ziehl-Nelsenu.

Nedostaci metode fluorescentne mikroskopije uključuju relativno visoke troškove mikroskopa i njegovo djelovanje. Međutim, u centraliziranim ili drugim velikim laboratorijima, gdje opterećenje premašuje normu od 3 laboratorija koji rade s tri konvencionalna mikroskopa, jeftinije koristiti jedan fluorescentni mikroskop.

Bakterijske metode imaju visoku specifičnost (89-100%). Oko 97% pozitivnih rezultata dobivenih bilo kojom metodom mikroskopije nedvosmisleno je potvrđeno rezultatima sjetve.

Treba napomenuti da kada je mikroskopski pregled razmaza patoloških materijala, nemoguće je utvrditi pripadnost vrsta identificiranih kiselih mikobakterija. Metoda mikroskopija omogućava dati mišljenje samo o prisutnosti ili odsutnosti kiseline u pripremi mikroorganizama, koji se može objasniti postojanjem u prirodi velikog broja morfološki sličan tuberkulozan mikobakterija složenih rezistentnih mikroorganizama nontubercular kiseline.

Rezultati mikroskopije procjenjuju se u polukvantitativnim jedinicama.

Da bismo mogli usporediti rezultate različitih metoda mikroskopije, uvedeni su empirijski koeficijenti. Na primjer, za usporedbu rezultata razmaza obojenih fluorescentne boje, istraživanje podataka svjetlosni mikroskop (1.000 puta povećanje), potrebno je podijeliti broj kiseline brzo bacila detektiran pomoću fluorescentnog mikroskopa, odgovarajući koeficijent na 250-puta povećanje - do 10, 450 puta - do 4, sa 630 puta - do 2.

Značajke mikroskopije za extrapulmonalnu tuberkulozu

Izvršena je izravna mikroskopija, kao i mikroskopija razmaza pripremljenih nakon obogaćivanja, praćena Tsiol-Nelsen bojanjem ili luminescentnim bojama. Izravna mikroskopija maziva je neučinkovita zbog niske koncentracije mikobakterija u materijalu, pa je stoga racionalnije koristiti metode obogaćivanja. Najučinkovitiji je centrifugiranje. Ako biološki materijal viskozna centrifugiranje primjenjuje s istovremenim ukapljivanja i homogeniziranja materijala, koji se provodi pomoću centrifuge velike brzine s centrifugalnom silom od 3000 g i hipoklorit rješenja. Druge metode obogaćivanja, poput mikro flotacije, trenutno se ne koriste zbog stvaranja biološki opasnih aerosola.

[37], [38],

Kulturna metoda dijagnoze tuberkuloze

Metoda sjetve, ili metoda kulture, osjetljivija je od testne mikroskopije i ima niz prednosti nad tim potonjem. Omogućuje otkrivanje nekoliko desetaka održivih mikobakterija u ispitnom materijalu i ima veliku dijagnostičku vrijednost. To je osobito važno pri ispitivanju materijala novodijagnosticiranih ili liječenih bolesnika koji oslobađaju malu količinu mikobakterija.

U usporedbi s mikroskopijom, istraživanje kulture omogućuje povećanje broja pacijenata s TB-om dijagnosticiranim za više od 15-25%, kao i potvrđivanje tuberkuloze u ranijim fazama, kada je bolest još uvijek podložna liječenju. Vrlo važna prednost ispitivanja kulture je mogućnost dobivanja uzbudljive kulture koja se može identificirati i proučavati s obzirom na osjetljivost na lijek, virulenciju i druga biološka svojstva.

Nedostaci metoda uzgoja uključuju njihovo trajanje (vrijeme čekanja materijala doseže 10 tjedana). Veći trošak, složenost obrade dijagnostičkog materijala.

Načela predviđanja liječenja dijagnostičkog materijala

Konvencionalne mikrobiološke metode ne mogu se koristiti u provođenju istraživanja tuberkuloze. To je zbog činjenice. Da mycobacterium tuberculosis raste vrlo sporo, a većina kliničkih uzoraka sadrži brzo rastuće piogene i raspadljive mikroorganizme, gljive. Njihov brzi rast na bogatim medijima hranjivih tvari ometa razvoj mikobakterija i ne dopušta izolaciju uzročnika tuberkuloze, pa se dijagnostički materijal mora prethodno obraditi prije sjetve. Osim toga, mikobakterije oslobođene od dišnih putova pacijenta obično su okružene velikom količinom sluzi, što je otežano koncentriranje. U tom smislu, prije sadnje sputuma i drugih sličnih materijala, njihovo ukapljivanje, dekontaminacija je neophodna.

Svi detergenti i dekontamini imaju više ili manje izražen toksični učinak na mikobakterije. Kao rezultat obrade, do 90% mikobakterija može umrijeti. Kako bi dovoljno za mikobakterije stanovništva, štede potrebu za korištenjem tehnike obrade koje omogućuju, s jedne strane, za suzbijanje brzo rastuće piogeni bakterije i truo, as druge - za očuvanje vitalnosti mikobakterija prisutnih u materijalu.

Ovisno o materijalu, sa stupnjem homogenosti i onečišćenja za pre-obradu pomoću različitih decontaminant: sputum - 4% otopina natrij hidroksida, otopine trohzameschonnogo natrijev fosfat 10%, benzalkonijev klorid, trinatrij fosfat, NALC-NaOH (N-acetil-L-cistein natrijev hidroksid) u konačnoj koncentraciji od 1% NaOH, u urinu i drugih tekućih materijala - otopinom sumporne kiseline 3%, za onečišćenih uzorke materijala koji sadrže u masti - otopina oksalne kiseline do 5%. Osim toga, u nekim slučajevima koriste se enzimi, surfaktanti (deterdženti). Korištenje Tweena i nekih drugih deterdženata prati manja smrt mikobakterijskih stanica (40-50% preživjeti). Međutim, mogu se koristiti samo za tekuće materijale. Najveća distribucija na svijetu bila je NALC-NaOH. Proizvedena u setovima. Ova metoda omogućuje dodjeljivanje više od 85% populacije mikobakterijskih stanica. Dekontaminacija tkanesoderzhaschih tvari teže pogoditi, jer je stupanj disperzije materijala tijekom homogenizacije teško. Na primjer, liječenje biopsija limfnih čvorova često prati povećana učestalost kontaminacije stranim florom. U ovom slučaju se može koristiti 1% etonija.

Nepomoćan materijal homogenizira se sa staklenim zrncima u prisustvu dekontaminanta. Tekući materijali se pre-centrifugiraju i obrađuje se samo precipitat.

Tehnike sjetve i inkubacije

Nakon predobrade, materijal se centrifugira, čime se precipitiraju mikobakterije i povećavaju njihov sadržaj u sedimentu ("obogaćivanje mulja"). Rezultirajući talog se neutralizira i inokulira (inokulira) s gustom medijem hranjivih tvari ili cijevi s tekućim (polutvrlim) medijem. Iz ostatka sedimenta pripremaju se pokusi za mikroskopski pregled. Tehnika sjetve treba spriječiti unakrsnu kontaminaciju dijagnostičkog materijala.

Za pouzdano kliničko tumačenje rezultata mikrobiološke studije treba slijediti sljedeće pravilo: mikroskopske i studije kulture moraju se provesti paralelno iz istog uzorka dijagnostičkog materijala.

Cijepljene cijevi se stave u termostat na 37 ^° C 2 dana u vodoravnom položaju. To osigurava ravnomjernu apsorpciju materijala u medij kulture. Nakon 2 dana, epruvete se prenesu u vertikalni položaj i hermetički brtve gumenim ili silikonskim čepovima kako bi se spriječilo sušenje usitnjenog medija.

Usjevi se inkubiraju na 37 ^o C za 10-12 tjedana redovitog tjednog pregleda. Za svaki pregled bilježe se sljedeći parametri:

• razdoblje vizualno promatranog od dana sjetve rasta;
• stopa rasta (broj CFU);
• kontaminacija usjeva stranom mikrobnom florom ili gljivicama (takve cijevi se uklanjaju);
• nedostatak vidljivog rasta. Cijevi ostaju u termostatu do sljedećeg pregledavanja.

Hranjivi mediji

Za uzgoj mikobakterija koriste se razni mediji hranjivih tvari; gusta, polutekuća tekućina. Međutim, nijedan od poznatih nutrientnih medija nema svojstva koja osiguravaju rast svih mikobakterijskih stanica. U svezi s tim, preporuča se da se 2-3 hranjivog medija različitog sastava istodobno koriste kako bi se povećala učinkovitost.

WHO preporučuje Levenstein-Jensen okoliš kao standardni medij za primarnu izolaciju uzročnika tuberkuloze i za određivanje njegove osjetljivosti na lijekove. Ovo je gusto jaje okoliša na kojem se dobiva mikobakterija 20.-25. Dana nakon što je posijala bakterioskopski pozitivan materijal. Uzgoj bakterioskopski negativnog materijala zahtijeva dulje razdoblje inkubacije (do 10-12 tjedana).

U našoj zemlji, predloženi E.R. Finnovo jaje okoliš Finn-II. Razlikuje se time, umjesto L-asparagina, koristi natrijev glutamat, koji aktivira druge načine sintetiziranja aminokiselina mikobakterija. Rast se pojavljuje na ovom mediju nešto ranije, a učestalost dodjele mikobakterija je 6-8% viša nego u Lowenstein-Jensen mediju.

Da bi se poboljšala učinkovitost bakteriološke dijagnoze extrapulmonalne tuberkuloze, poželjno je uključiti modificirane Finn-II medije u kompleks nutrijenata medija. Da bi se ubrzao rast, 0,05% natrijevog tioglikolata koji smanjuje koncentraciju kisika dodaje se dodatno u Finn-II hranjivi medij. Za zaštitu enzimskih sustava mikobakterija od toksičnih produkata lipidne peroksidacije u Finn-II hranjivom mediju dodaje se antioksidansni α-tokoferol acetat pri koncentraciji od 0,001 μg / ml. Sjeme dijagnostičkog materijala provodi se prema standardnom postupku.

U laboratorijima za borbu protiv tuberkuloze u Rusiji također se koriste i druge izmjene gustih nutrientnih medija; predložio G.G. Mordovska hranjiva tvar "New", koju je razvio V.A. Anični hranjivi mediji A-6 i A-9 itd.

S obzirom na činjenicu da je u procesu kemoterapije do oštećenja različitih metaboličkih sustava mikrobnih stanica, neki mikobakterijski stanovništvo gubi sposobnost da se razvije obično u uobičajenim hranjivim medijima i zahtijeva osmotski uravnotežen (ili polu-tekuće) za kulturu.

Procjena i bilježenje rezultata sijanja dijagnostičkog materijala

Neki sojevi i vrste mikobakterija rastu polako, rast se može pojaviti čak i do 90. Dana. Broj takvih usjeva je mali, ali to omogućava izdržavanje usjeva u termostatu 2.5-3 mjeseca.

Virulentne kulture mycobacterium tuberculosis obično rastu na gustim uvjetima jaja u obliku R-oblika kolonija različitih veličina i vrsta. Kolonije su suhe, naborane, slonovače, blago pigmentirane. U drugim medijima, kolonija mycobacterium tuberculosis može biti vlažnija. Nakon kemoterapije ili tijekom liječenja mogu se dodijeliti glatke kolonije s vlažnim rastom (S-oblike).

Prilikom izolacije usjeva, niz specijalnih studija koristi se za razlikovanje mycobacterium tuberculosis od ne-tuberkuloznih mikobakterija i saprofitnih otpornih na kiseline.

Pozitivan odgovor dan je nakon obaveznog mikroskopskog ispitivanja zamrljanog Tsiol-Nelsenovog premaza iz uzgojenih kolonija. U slučaju rasta mikobakterija u smearima, pronađeni su svijetli crveni štapići koji leže pojedinačno ili u skupinama koje tvore klastere u obliku pusta ili pletenice. U mladih kulturama, posebno izoliran dugotrajnog liječenje bolesnika s kemoterapijom, mikobakterije razlikuju eksprimirani polimorfizam, dok prisutnost šipke obliku, zajedno s kratkim, gotovo prekomjernog rasta kokoidnih ili izduženih inačice koje nalikuju micelija.

Stopa rasta mikobakterija je naznačena sljedećom shemom: (+) - 1-20 cfu in vitro (slabo izlučivanje bakterija); (++) - 20-100 CFU in vitro (umjereno bakterijsko izlučivanje); (+++) -> 100 CFU in vitro (obilni bakterijski izlučivanje). U laboratorijskoj dijagnozi tuberkuloze, nije dovoljno odgovoriti je li mikobakterija detektirana jednim ili drugim metodom. Imaju detaljno razumijevanje opsega i prirode mikobakterijskog populacije, njegovog sastava i svojstava. To su ti podaci koji nam omogućuju ispravno tumačenje stanja procesa, planiranje taktike i pravodobno ispravljanje liječenja.

Posljednjih godina, kako bi se ubrzao rast mikobakterija, hranjivi mediji na osnovi agara s različitim aditivima rasta i upotrebom posebne mješavine plinova su predloženi. Za dobivanje rasta mikobakterija na tim medijima, tijekom uzgoja nastaje atmosfera s visokim sadržajem ugljičnog dioksida (4-7%). U tu svrhu koriste se posebni inkubatori CO ₂. Međutim, najrazvijeniji automatizirani sustavi za uzgoj mikobakterija: MGIT-BACTEC-960 i MB / Bact.

Jedan od takvih sustava - MGIT sustav (rasta mikobakterija pokazuje cijevi), koji se odnosi na razvoj visoke tehnologije i namijenjena je za brzu bakteriološke dijagnostici tuberculosis i Mycobacterium podložnost prva linija lijekovima i neke druge linije lijekova. MGIT je usredotočen na korištenje kao dio VASTES-960 uređaja. Mikroorganizmi se uzgajaju u posebnim cijevima s tekućim nutrientnim medijem na temelju modificiranog Middlebrook-7H9 medija. Za poticanje rasta mikobakterija i suzbijanje rasta vanjske mikroflore koriste se MGIT Supplement za rast i smjesu PANTA antibakterijskih lijekova.

Rast mikroorganizama bilježi se optički. Temelji se na fluorescenciji, što se događa kada kisik konzumira mikobakterije tijekom rasta. Fluorkromna boja ovisna o kisiku nalazi se na dnu posebne epruvete i prekrivena slojem silikona. Umnožavanje mikobakterije dovodi do smanjenja količine kisika u cijevi i smanjivanje koncentracije koja uzrokuje porast fluorescencije koja postaje vidljiva pod zračenjem sa ultraljubičastim svjetlom cijevi i automatski zabilježen fotosenzorom ugrađen aparat VASTES-960. Intenzitet luminescencije zabilježen je u jedinicama rasta (GU-jedinice rasta). Podaci o rastu zabilježeni su u računalu, gdje se mogu spremiti automatski. Računalna analiza krivulja rasta može pružiti informacije o prisutnosti raznih Mycobacterium bazena, uključujući nontubercular, a također pomaže za procjenu svojstava rasta mikobakterija.

Kao rezultat uvođenja takvih sustava, vrijeme za rast mikobakterija znatno je smanjeno, prosječno 11 dana na VASTES-960 i 19 dana na MB / Bact u odnosu na 33 dana na standardnom gustu hranjivu podlogu. Treba napomenuti da ti sustavi zahtijevaju visoko kvalificirano osoblje. Sjetva materijal za tekuće medije će se u pratnji sjetve na Lowenstein-Jensen medija, u ulozi zamjenik u slučajevima kada su drugi mediji Mycobacterium tuberculosis ne dopuštaju rast.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Određivanje osjetljivosti lijekova mikobakterija

Određivanje spektra i stupnja osjetljivosti mikobakterija na anti-tuberkulozne lijekove ima veliku kliničku važnost, kao i za epidemiološku procjenu širenja tuberkuloze kod otpornosti na lijekove. Nadalje, praćenje otpornosti na lijekove omogućuje procjenu učinkovitosti tuberkuloznog programa u cjelini, što je integralni pokazatelj učinka svih komponenti antitoaktivnih tuberkuloza.

Mnogostrukost i vrijeme osjetljivosti na lijek:

• prije početka liječenja jednom za određivanje strategije i taktike liječenja:
• kada se izoliraju iz bolesnih kultura različitih materijala (sputuma, BAL tekućine, urina, eksudati, liker, itd.), svi izolirani sojevi se ispituju:
• na kraju intenzivne faze liječenja u odsustvu kliničke i radiološke dinamike:
• ako je potrebno promijeniti režim liječenja u sljedećim slučajevima:
  • odsutnost pljuskanja;
  • ponovna izolacija kulture nakon što je naglo negativan;
  • drastično povećanje broja CMB-a u obrvu nakon početnog pada. Dobro je poznato da su sojevi mycobacterium tuberculosis, koji su heterogeni u smislu osjetljivosti na lijekove, izolirani iz materijala od pacijenta s tuberkulozom. Osjetljivost sojeva na lijekove protiv tuberkuloze može se razlikovati u rasponu lijekova, stupnja, učestalosti i učestalosti pojavljivanja otpora.

Stupanj rezistencije na lijek Mycobacterium tuberculosis je određena u skladu s utvrđenim kriterijima, koji su usmjereni na kliničkom značenju i stabilnost ovisi o aktivnosti protiv tuberkuloze droge, farmakokinetiku, koncentracije lezije. Maksimalnu terapijsku dozu i tako dalje.

Određivanje osjetljivosti lijekova mikobakterija se provodi mikrobiološkim metodama:

• Apsolutne koncentracije (postupak razrjeđivanja na gustim ili tekućim medijima hranjivih tvari),
• proporcije,
• koeficijent otpora.

Obično stabilnost očituje kao vizualno primjetan rast kolonija Mycobacterium tuberculosis, ali postoje tehnike koje izazivaju rane faze rasta u diobu stanica Mycobacterium u obliku reakcije u boji. Ove metode skratiti vrijeme testiranja od 3-4 do 2 tjedna.

Kao ujedinjeni u Rusiji je proširena, preporučio kemoterapije metodom KOJI odbora apsolutnih koncentracija, koja je s metodološkog gledišta, je najjednostavniji, ali to zahtijeva visoku preciznost i standardizaciju laboratorijskih postupaka. Ispitivanje osjetljivosti na lijek sastoji se od seta epruvete s hranjivim medijem modificiranim anti-TB lijekovima. Set sastoji od 2-3 cijevi s različitim koncentracijama od lijekova se koristi, jedan kontrolne cijevi bez lijeka za okoliš i jedna cijev, koja sadrži 1.000 mcg / ml natrij Sali tsilovokislogo ili 500 ug / ml paranitrobenzoynoy kiselina nontubercular otkrivanja rasta mikobakterija.

Za pripremu seta medija s pripravcima koristi se modificirani medij Levenstein-Jensen (bez škroba) koji se ulijeva u posude. U svakoj od bočica dodana je specifična količina prikladnog razrjeđenja antituberkuloznog pripravka. Sadržaji tikvica temeljito se izmiješaju, sipaju se u cijevi i presavijeni u nagnutom položaju 40 minuta pri temperaturi od 85 ° C. Preporuča se cirkuliranje medija u električnom rewinderu s automatskom regulacijom temperature. Srijeda s anti-TB lijekovima

Serija 1 može se čuvati u hladnjaku na 2-4 ° C tijekom 1 mjeseca, priprema drugog reda - ne duže od 2 tjedna. Prihvaćanje medija pri pripremanju na sobnoj temperaturi neprihvatljivo je. Prilikom pripreme otopina anti-tuberkuloznih lijekova uzima se u obzir njihova aktivnost, računajući koncentraciju prilagođenu molekulskoj masi nespecifičnog dijela pripravka, čistoći itd. Da bi se odredila osjetljivost na lijek, koriste se samo kemijski čiste tvari.

Princip metode je odrediti koncentraciju antituberkuloznog lijeka koji inhibira rast značajnog dijela mikobakterijske populacije. Ako je to ispravno, ova metoda ima dobru pouzdanost.

Prije testiranja, potrebno je osigurati da izolirana kultura mikobakterije tuberkuloze ne posjeduje nepoznatu mikroflora. Iz kulture mikobakterija u 0,9% otopini natrij klorida, priprema se homogena suspenzija koja sadrži 500 milijuna mikrobnih tijela po ml (standard optičke zamućenosti od 5 jedinica). Dobivena suspenzija se razrijedi s 0,9% otopinom natrijevog klorida (1:10) i doda se 0,2 ml suspenzije u svaku epruvetu kulture medija kulture. Cijepljene epruvete su stavljene u inkubator pri 37 ° C i drži se u vodoravnom položaju za 2-3 dana u nagnutoj površini mediju ravnomjerno inokulirane sa suspenzijom Mycobacterium tuberculosis. Cijevi se zatim prenesu u vertikalni položaj i inkubiraju 3-4 tjedna. Rezultati se bilježe nakon 3-4 tjedna.

Budući da je vrijeme agenta puštanje iz kliničkog materijala na hranjivoj podlozi čine najmanje 1-1,5 mjeseci osjetljivosti lijeka može se dobiti ovom metodom nije ranije nego nakon 2-2,5 mjeseca nakon sijanje materijala. Ovo je jedan od glavnih nedostataka metode.

Tumačiti rezultate određivanja osjetljivosti lijekova mikobakterija na temelju određenih kriterija. Na čvrstom mediju za kulturu, smatra osjetljivi na koncentraciju lijeka koji je sadržan u mediju, ako je broj kolonija mikobakterija uzgaja in vitro s ove droge je ne više od 20 s obilnom rasta u kontrolnoj epruveti bez lijekova. Samo u prisutnosti više od 20 kolonija smatra se kultura koja je otporna na ovu koncentraciju. U praksi, pri dobivanju rasta dobivaju se ispitne cijevi blizu 20 cfu. Potrebno je obavijestiti kliničku jedinicu da je osjetljivost ili otpornost u ovom slučaju granična, jer ponekad može objasniti nejasnu dinamiku kliničkih pokazatelja.

Za različite lijekove uspostavljena je određena koncentracija, pri čemu se opaža reprodukcija kritičnog dijela mikobakterijske populacije. Te koncentracije nazivaju se "kritičnim". Kao kriterij stabilnosti, koristi se rast populacije mikobakterija na hranjivom mediju s pripravkom pri kritičnoj koncentraciji.

U domaćoj TB praksi, pri određivanju otpornosti na lijekove, one nisu ograničene samo na određivanje kritičnih koncentracija. To je zbog činjenice. Da je razina proširena definicija otpornost na lijek omogućuje medicinarima da preciznije pozicioniranje taktika kemoterapiju koristeći znanje potenciranje djelovanja kombinacije lijekova, križaju se očekuje otpor ili primijeniti učinkovitiji lijekovi skupina koristi protiv tuberkuloze droge.

Apsolutna metoda koncentracije je najjednostavnija, ali je također najosjetljivija na pogreške koje se vrše prilikom izvođenja. Pouzdaniji, pogotovo u određivanju osjetljivosti na lijekove druge linije, a zajednički izvan Rusije, je metoda proporcija. Uzima u obzir nedostatke metode apsolutnih koncentracija, ali u izvršenju je naporno.

Metoda je vrlo slična metodi apsolutne koncentracije. Priprema ispitnih epruveta s lijekovima provodi se na isti način. Kao u apsolutnoj metodi koncentracije. Međutim, sjemenska doza suspenzije mycobacterium tuberculosis je smanjena za faktor 10. što eliminira učestalost spontane rezistencije nekih sojeva mycobacterium tuberculosis na takve lijekove kao što su Etambutol, protionamid, capreomycin. Kao kontrola, koriste se 2 ili 3 epruvete s dozom sjemena jednake u epruvetama, sukcesivno razrijeđene 10 i 100 puta. Kriterij stabilnosti je udio vizualno promatranog rasta mikobakterijum tuberkuloze. Za lijekove iz serije 1, kriterij stabilnosti je višak rasta od 1% početne populacije, za lijekove drugog reda - povećanje od 1 ili više od 10% početnog, ovisno o odabranoj kritičnoj koncentraciji.

Godine 1997. Radna skupina WHO i Međunarodne unije za identifikaciju dobro tuberkuloze otpora TB droga je napravio prilagodbe tim kriterijima, nudeći smatra otporan na mikobakterije, koja raste na čvrste jaje medija Lowenstein-Jensen u sljedećim koncentracijama:

• dihidrostreptomicin - 4 ug / ml;
• izoniazid 0,2 ug / ml:
• rifampicin 40 ug / ml:
• Etambutol - 2 ug / ml.

U 2001. Godini predložene su kritične koncentracije za sljedeće lijekove drugog reda (za kritični udio od 1%):

• kapreomicin - 40 mcg / ml;
• protionamid - 40 mcg / ml;
• kanamicin - 30 ug / ml;
• viomicin - 30 mcg / ml;
• cikloserin 40 ug / ml;
• aminosalicilna kiselina - 0,5 ug / ml;
• ofloxacin - 2 ug / ml.

Rezultati rasta procjenjuju se nakon 4 tjedna kao preliminarni i nakon 6 tjedana uzgoja - kao konačni.

Da bi se odredila osjetljivost lijeka na pirazinamid, koja se široko koristi u suvremenoj kemoterapiji za tuberkulozu, preporučena kritična koncentracija je 200 ug / ml. Međutim, još uvijek ne postoji općenito prihvaćena metoda za određivanje otpornosti na ove droge na čvrstim hranjivim podlogama zbog svog antibakterijskog djelovanja je izložen samo u kiselom mediju (pH <6), koji je tehnički teško održavati. Osim toga, mnoge kliničke kulture mycobacteria tuberculosis nevoljko rastu na okolišu jaja s kiselim okolišem.

Za procjenu kvalitete rezultata ispitivanja osjetljivosti lijeka mikobakterija, preporuča se da svaka nova serija srednje LJ kontrolu paralelnog određivanje osjetljivosti standardne muzej soja H37Rv. Osim toga, postoje određeni mikrobiološki kriteriji koji se moraju održavati tako da tehnike daju dobro reproducirati i ispravno tumačiti rezultat. To uključuje održivost kulture Mycobacterium tuberculosis, pravila za dobivanje homogene suspenzije i suspenzije kulture izbor pravila Mycobacterium tuberculosis, reprezentativnosti odabranog bakterijske mase. Pouzdanost određivanja rezistencije na lijek smanjena je s iznimno oskudnim oslobađanjem bakterija.

Nedavno je smatrano da je obećavajuća metoda za određivanje osjetljivosti lijekova pomoću automatiziranih sustava. Najsavršeniji na ovom području su razvoj događaja na temelju VASTES MGIT-960. U tom slučaju, osjetljivost lijeka mycobacterium tuberculosis određuje se na temelju modificirane metode proporcija. U procesu određivanja, uspoređuje se brzina rasta mikobakterijum tuberkuloze u kontrolnoj cijevi i testnim cijevima s lijekovima. Da bi se odredila osjetljivost na streptomicin, izoniazid, rifampicin i etambutol, koriste se dodatke za obogaćivanje i antibiotike uključene u kit SIRE. Da biste odredili osjetljivost na pirazinamid, koristite PZA kit. U tijeku ispitivanja suspenzija Mycobacterium tuberculosis inokulirani epruvetama s lijekovima, kao i za kontrolu cijevi s rekonstituirane suspenzije 100 puta za sve lijekove osim pirazinamid, pri čemu je suspenzija je razrjeđenje 10 puta. Kriterij stabilnosti je pokazatelj rasta mikobakterija od 100 GU kada se postigne rast u kontrolnoj cijevi 400 GU (vidi "Metode kulture za izolaciju mikobakterija"). Računanje i tumačenje rezultata provode se automatski i postavljeni su ulazom ili odabranim programom.

Kao kritične koncentracije, konačne koncentracije se koriste u epruveti s tekućim nutrientnim medijem. Trenutno su razvijene kritične koncentracije za lijekove u prvom i drugog reda. Treba napomenuti da je osjetljivost mikobakterija tuberkuloze na cikloserinu i aminosalicilnu kiselinu određena samo na mediju hranjivih tvari jaja.

Razraditi rad protokol opisan sustav omogućuje proučavanje osjetljivosti lijeka u obliku posvećen kulture (gusta hranjivom mediju), te se koristi primarni Mycobacterium MGIT-rast in vitro. Druga opcija značajno smanjuje vrijeme za kulturu, omogućujući vam da se pune rezultate kulture Mycobacterium tuberculosis (uključujući informacije o osjetljivosti lijeka) nakon 3 tjedna od dana prikupljanja materijala, a tradicionalni način moguće je dobiti samo treći mjesec. S vremenom, dobiveni rezultati, kada je pacijent u intenzivnoj fazi liječenja, mogu nadoknaditi relativno visoke troškove istraživanja.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Razlikovanje mikobakterija

Uzimajući u obzir da korišteni nutrijenti nisu strogo selektivni. Naknadna diferencijacija izoliranih mikobakterija prepoznata je kao obvezna. Potreba za razlikovanje mikobakterija je zbog niza obilježja patoloških procesa uzrokovanih roda: drugačiji tijek i ishod tuberkuloze i mycobacteriosis, prisutnost otpora prirodni lijek za neke anti-TB droge.

Poznato je da se primarni identifikacija Mycobacterium tuberculosis kompleksa M. Nontubercular iz mikobakterija obavlja sljedeće karakteristike: brzina rasta na čvrstim hranjivoj podlozi, pigmentacije, morfologiju kolonija, u prisustvu kiselinskog otpornosti i temperature optimalan rast.

Nažalost, ne postoji niti jedan laboratorij način pouzdano razlikovati M. Tuberculosis kompleksa mikobakterije od drugih kiselina brzim bacila, ipak se kombinacija svojstava koja su gore opisani s rezultatima danim ispod niza biokemijskih testova omogućuje identifikaciju Mycobacterium tuberculosis kompleksa s M. Vjerojatno da 95%.

Za diferencijaciju Mycobacterium tuberculosis kompleksa M. (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. I dr canettii) iz sporo rastu mikobakterije koristi nontubercular osnovne biokemijske pretrage koje otkrivaju prisutnost sljedećih simptoma:

• sposobnost proizvodnje nikotinske kiseline (niacin test):
• aktivnost nitrat reduktaze;
• termostabilna katalaza;
• rast na mediju s natrijevim salicilatom (1 mg / ml).

Kao dodatna ispitivanja, također se može koristiti rast na mediju koji sadrži 500 ug / ml paranitrobenzojeve kiseline ili 5% natrij klorida.

Mnogi bakteriološki laboratoriji identificiraju ove mikroorganizme samo na razini kompleksa, što je posljedica ograničenih mogućnosti laboratorija i metodoloških sposobnosti stručnjaka.

U većini slučajeva, međutim, u praksi za razlikovanje M. Tuberkuloze i M. Bovis dovoljna sljedeća ispitivanja: niacina, jer prisutnost nitrata, registracije prisutnosti i pirazinamidazy rastu u mediju koji sadrži 2 ug / ml hidrazida tiofen-2-karboksilne kiseline. Uzima se u obzir da mikobakterije M. Tuberculosis kompleksa karakteriziraju sljedeći skup znakova:

• spor rast (više od 3 tjedna);
• temperatura rasta u rasponu od 35-37 ^° C;
• odsutnost pigmentacije (bjelokost);
• označena kiselom-brzo bojom;
• pozitivan niacin test;
• pozitivno testiranje nitratne reduktaze;
• odsutnost termostabilne katalaze (68 ^° C).
• Odsutnost rasta na Levenstein-Jensen mediju koji sadrži:
  • 1000 ug / ml natrij salicilata,
  • 500 ug / ml paranitrobenzojeve kiseline,
  • 5% natrij klorid:
• rast u prisutnosti 1-5 μg / ml tiofen-2-karboksilne kiseline.

Važnost diferencijacije izoliranih mikobakterija značajno će se povećati s povećanjem učestalosti snimanja slučajeva HIV / AIDS povezanih s tuberkulozom ili mikobakterijem. Trenutno ne postoji apsolutna sigurnost spremnosti praktičnih regionalnih laboratorija da pravilno izvode ovaj volumen rada.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Imunološka dijagnoza tuberkuloze

Postoji niz univerzalnih pojava, lijekova i imunoloških testova koji su izvorno pronađeni upravo tuberkulozom ili na modelu imunog odgovora na mikobakterije. To uključuje BCG tuberkulina, takvu pojavu kao kožni DTH (tuberkulina - Pirquet i Mantoux reakcija), reakcija na potkožne tuberkulinske senzibilizirane životinje (Koch fenomen). Jedno od prvih antitijela u zaraznoj bolesti također je otkriveno u tuberkulozi. Naravno, dublje razumijevanje dobrih mehanizama tuberkuloze imunitet i njihova genetska kontrola, veća može biti korištenje imunoloških metoda i lijekova koji utječu na imunološki sustav, za rješavanje praktičnih problema TB.

Najvažniji i najteži praktični problem trenutno se smatra prepoznavanjem tuberkuloze u procesu masovnog probira populacije. Međutim, unatoč brojnim izvješćima o "uspjehu" (na ograničenom materijalu), ne postoji prikladna imunološka metoda (reproducibilna u "bilo kojem ruku") i droga prikladna za tu svrhu.

Imunološke metode, osobito serološke studije (određivanje antigena, protutijela) i tuberkulin izazvane testove vrlo su široko korištene u kliničkoj praksi.

U prvom redu među imunološkim istraživanjima koja se koriste u diferencijalnoj dijagnostici, postoje serološke metode - određivanje antigena i protutijela u različitim okruženjima tijela.

Specifičnost protutijela na mikobakterije tuberkuloze ovisi o antigenom korištenim u imunotestu. Predložena je značajna količina antigena, od kojih je prva tuberkulin PPD:

• PAP i druge složene pripravke iz tekućine za kulturu;
• ultrazvučna raspad;
• Ekstrakt Tritona i ostali kompleksni pripravci staničnih stijenki;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• žičani faktor (trehaloza-6,6-di-mikollat);
• fenolnih i drugih glikolipida;
• lipopolisaharid;
• fibronektin-vezujući antigen;
• proteini (najčešće rekombinantni); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA itd.

Kao rezultat godina istraživanja od strane ruskih i stranih znanstvenika otkrila temeljne zakone i učinkovitost antitijela serološko dijagnosticiranje tuberkuloze: složenije antigen, veća osjetljivost i nižu specifičnost testa. Specifičnost u različitim zemljama varira ovisno o broju stanovnika infekcije M. Tuberculosis i nontubercular mikobakterija iz noseći BCG cijepljenje i drugih. Kod djece, sadržaj informacije o serodiagnosis je niža nego u odraslih. U primarnoj tuberkulozi (češće djeci), definicija IgM je više informativna. S sekundarnim IgG. Kod pacijenata s HIV-om infektivna vrijednost serodiagnoze u određivanju antitijela je smanjena. Određivanje učinkovitosti antitijela ovisi o broju „klinički aspekti”: postupak aktivnost (prisutnost ili odsutnost za „izoliranje”, mikobakterija prisutnost raspadanja šupljina, stupnja infiltracije), učestalost postupka, trajanje toka.

Osjetljivost metode enzimskog imunološkog testa (ELISA) je oko 70%. Nedovoljna učinkovitost studije je zbog svoje niske specifičnosti. Razmotreno je mogućnost korištenja seroloških pregleda u skupinama s visokim rizikom, osobito među osobama s promjenama nakon tuberkuloze u plućima.

Da bi se povećala specifičnost ELISA-e, traži specifičnije antigene, uključujući one dobivene genetskim inženjeringom: ESAT-6, itd. (Vidi gore). Upotreba strogo specifičnih antigena (38 kDa, ESAT) povećava specifičnost. Ali značajno smanjuje osjetljivost analize. Uz IFA (eksperimentalno laboratorijskih pretraga sustava. Npr Pathozyme ELISA kit) također osigurava komplete s bočnom imunokromatografskc filtracijom (Mycodot), kao i drugih sličnih testova (dot-analiza na membranu) s vizualnom procjenom rezultata ispitivanja. Tijekom ovih testova, analiza se provodi 10-30 minuta; oni ne zahtijevaju posebnu opremu, oni zahtijevaju vizualnu procjenu rezultata, koja je povezana s određenom subjektivnošću. Ove metode imaju otprilike istu osjetljivost i specifičnost (70% i 90-93%) kao i tradicionalna ELISA.

Korištenje metoda imunološke analize ima određenu vrijednost kao dodatni, uzeti u obzir u kompleksu korištenih metoda, u diferencijalnoj dijagnostici tuberkuloze, posebno u dijagnostici njezinih extrapulmonarnih oblika. Najučinkovitija ELISA metoda je u dijagnostici tuberkuloznog meningitisa u proučavanju cerebrospinalne tekućine. U ovom slučaju, osjetljivost analize je 80-85%, a specifičnost je 97-98%. Postoje podaci o učinkovitosti otkrivanja antitijela na mikobakterije tuberkuloze u tekućini za suzenje u dijagnostici tuberkuloznog uveitisa.

Indukcija sinteze gama interferona in vitro

Gamma interferon (IFN-γ) je specifični faktor imunološkog obrane ostvaren aktiviranjem enzima enzima makrofaga. Indukcija sinteze IFN-γ senzibiliziranim T-limfocitima uzrokuje njihovu interakciju s antigenom mikobakterija.

Kao antigeni koji se koriste kao tuberkulinski PPD. I specifične antigene, dobivene genetskim inženjeringom, posebno antigena ESAT-6 (ranije izlučuje antigen koja ima molekularnu masu 6 kDa) i HFP-10 (filtrat kulture protein 10 kDa). Genetski inženjering ili rekombinantni antigeni nisu prisutni u stanicama BCG cjepiva i drugim mikobakterijama. Kada se koristi tuberkulin, rezultati indukcijskog testa IFN-γ su usporedivi s rezultatima tuberkulinskog testiranja kože (izravna korelacija). Kada koristite genetski inženjerske antigene, rezultati testa su specifičniji i ne ovise o prethodnom BCG cijepljenju. Kod ispitivanja cijepljenih osoba koje nisu imale kontakt s tuberkuloznom infekcijom, specifičnost testa je 99%. Osjetljivost testa kod pacijenata s tuberkulozom varira od 81 do 89%.

Testovi i dijagnostički alati su razvijeni na temelju kratkoročni uzgoj stanica ili cijeli krvnih mononuklearnih stanica izoliranih iz krvi s antigenima Mycobacterium tuberculosis in vitro s naknadnim određivanje koncentracije IFN-y ili prebrojavanjem broja T limfocita koje sintetiziraju IFN-y u. Koncentracija interferona sintetizirana je in vitro je određena s ELISA korištenjem monoklonskih protutijela vezne IFN-y. Zatim, pomoću standardne kalibracijske IFN-y određena njegova koncentracija u epruveti ili jažice ploče.

Prilikom provođenja Elispot testa, broj T-limocita koji sintetiziraju IFN-γ. Se broje na površini ploče obložene protutijelima na IFN-y.

Programeri Diagnosticum na IFN-γ in vitro putem indukcije, koji je odobren od strane Agencije za lijekove i američke proizvode, tvrde da je test je nemoguće razlikovati latentne infekcije tuberkuloze od aktivne tuberkuloze. Stoga, u područjima s visokom razinom infekcije, test nije izravno dijagnostički. Međutim, u našoj zemlji se može koristiti za razlikovanje infekcije tuberkuloze kod djece od alergije nakon cijepljenja, te za procjenu razine specifičnog imuniteta u postupku liječenja.

Trenutno se proučava domaći testni sustav za određivanje indukcije sinteze IFN-γ specifičnim tuberkuloznim antigenima in vitro.

Imuni status i tijek tuberkuloze, imunološko ispravljanje

U procesu liječenja tuberkuloze kod ljudi postoje promjene u antigenemiji i stanju imunološkog sustava.

Podaci o promjenama u eksudatu i tkivima uglavnom su kontradiktorni. Jedino što se može primijetiti s dobrim razlogom je da u tuberkularnim granulomima, u pravilu, detektira značajan broj aktiviranih T-limfocita.

Ima smisla zadržati još dvije odredbe potrebne za razumijevanje uloge imunoloških mehanizama u liječenju tuberkuloze kod ljudi:

• Pacijenti s AIDS-om imaju posebno visoku učestalost višestrukog otpornosti na lijek;
• s višestrukom rezistencijom na lijek (i u odsutnosti HIV infekcije), poremećaji imuniteta (osobito veza T-stanica) su posebno značajni.

Kada tuberkuloza široko primijeniti različite metode imunološko: to je prije svega lijekovi koji djeluju prvenstveno na imunitet T-stanica i sustava mononuklearnih fagocita (timusa hormoni, izoforon, likopid, polioksidony et al.). Kao i cijele (atenuirane) mikobakterije i njihove komponente.

Molekularno-biološka dijagnoza tuberkuloze

Za postupci molekularne biologije u dijagnostici zaraznih bolesti uključuju, uglavnom, metoda se temelji na manipuliranje s genomske materijalom bakterijskih i virusnih patogena da se identificira specifična genetskog materijala - DNA segmenti koji imaju sekvencu nukleotida koji su specifični za određeni tip ili patogenih sojeva za analizu specifične DNA sljedovi gena koji određuju osjetljivost na određene patogena ljekovitih tvari, ali i za analizu funkcionalna aktivnost određenih gena patogena. Tehnike molekularne biologije su široko u znanstvena istraživanja i praktične primjene u dijagnostici i praćenju različitih bakterijskih i virusnih infekcija nakon otvaranja 1985. Godine, Carrie Myullisom (dobitnik Nobelove nagrade. 1989) lančane reakcije polimeraze.

Načela i mogućnosti postupka lančane reakcije polimeraze

PCR omogućuje umnožavanje (umnožavanje) in vitro nukleotidne sekvence (fragment DNA patogena) nekoliko sati milijun puta. Reakcija u prisutnosti pojedinačnih lanaca DNA određuje iznimno visoku osjetljivost analize.

Nukleotidni slijed određenih područja lanca DNA određuje genetički identitet mikroorganizma koji objašnjava visoku specifičnost PCR-a.

Vrijednost ove tehnike za detekciju i istraživanje karakteristika uzrokovane bakterijama Mycobacterium tuberculosis bioloških svojstava mikroorganizma koji imaju vrlo sporo rastu: vremena udvostručavanja Mycobacterium tuberculosis DNA kada kultiviranje je 12-24 sati.

Načelo PCR metode sastoji se u pojačanju - višestrukim, milijunima puta. Množenjem odjeljaka specifične DNA sekvencije u mikrovolumu cijevi tijekom cikličkog ponavljanja sljedećih tri reakcijska stupnja, od kojih svaka prolazi u različitom temperaturnom režimu:

• Faza I - denaturacija dvolančane DNA nakon zagrijavanja s divergencijom lanaca;
• II stupanj - komplementarno vezanje (hibridizacija) primera (primarni oligonukleotidi) s terminalnim dijelovima lanaca strogo specifičnih, odabranih za umnožavanje fragmenta DNA;
• Faza III - završetak lanca fragmenta DNA korištenjem termostabilne DNA polimeraze.

Za pojačavanje in vitro, moraju postojati molekule matrične DNA. Četiri vrste deoksinukleozid trifosfata (nukleotida) koja sadrži odgovarajuće dušične baze: adenin (A), timin (T), gvanin (G), citozin (C); umjetno sintetizirani početni oligonukleotidi (primeri) koji se sastoje od 18-20 parova baza; Termostabilna DNA polimeraza enzim koji ima temperaturu od 68-72 optimum ^na C i magnezijevih iona.

Specifičnost PCR-a ovisi o izboru fragmenta DNA. U skladu s tim, sintetizirani su sjemenske oligonukleotide. Specifičnost hibridizacije i završetka lanca DNA je zbog načela komplementarnosti sljedećih para dušičnih baza: adenin-timina, gvanin-citozin.

Odrediti genomske tuberkulozan mikobakterija kompleks najučinkovitiji meta pojačavanje kod većine sustava za ispitivanje odabranih DNA fragment od IS6110, koja je u većini sojeva Mycobacterium tuberculosis genoma ima značajan broj (10-20) ponavljanja, koja omogućava, uz specifičnost, visoka osjetljivost testa. Istodobno su opisani sojevi Mycobacterium tuberculosis s malim brojem ponavljanja ili odsutnosti fragmenta IS6110.

Izolacija DNA molekula iz biološkog uzorka

Za provedbu PCR, DNA molekule patogena bi se trebale izolirati iz biološkog materijala u minimalnom volumenu, uz minimalnu količinu nespecifične DNA i razne inhibitore enzimske DNA polimeraze.

Priprema uzoraka treba provoditi pod uvjetima koji sprečavaju unakrsno onečišćenje uzoraka pomoću izoliranih DNA molekula. Da bi se to postiglo, potrebno je prethodno tretirati sobu s ultraljubičastim, podovima i radnim površinama stolova i uređaja, s otopinama koje sadrže klor. Također obvezno korištenje čistih rukavica, jednokratnih epruveta i savjeta za automatske pipete.

Da se izdvoji DNA iz Mycobacterium tuberculosis iz kliničkih uzoraka (cerebrospinalna tekućina, bronhijalna ispiranje) ne sadrži veliki broj stanica, staničnih ostataka, ili njihove soli, koja je dovoljna da centrifugi uzorak 3-4 tisuća. Rpm, dodati u mulj 20-30 ul 2% otopine Triton X-100 i zagrijana na 90 ° C ^oko C tijekom 30 minuta.

Za pripremu uzoraka sputuma mora biti učinkovita rastapanje, koji se obično koristi za 4% otopine natrijevog hidroksida i N-acetil-L-cisteina (NALC) u količini od 50-80 mg po uzorku su - ovisno o viskoznosti uzorka. NALC otopina mora biti pripremljena ex tempore ili NALC prašak može se izravno dodati suhom uzorku. Nakon ukapavanja, uzorci se centrifugiraju 15 minuta pri 3,5-4,000 okretaja u minuti (3000 g) u 50 ml bočicama s vijčanim kapicama, tj. E. Pod istim uvjetima koji se preporučuju za prerastu pripremu sluzi.

Za ekstrakciju DNA iz postupka peleta se koristi najčešće temelje na upotrebi 5-6 molarne otopine gvanidin izotiocijanata lizu reagensom kao i mikroporozna čestica i silicijevog oksida ( „dijatomejska zemlja”) sorbing molekule DNA. Nespecifično tvari, uključujući inhibitore moguće, zatim ispere u 2,5 molarne otopine gvanidinijevog izotiocijanata i otopinom etanola, nakon čega se DNA molekula desorbira u vodi, a ta uzoraka koristi za izvođenje PCR. Kako bi se pojednostavila tehnologija ekstrakcije DNA, "dijatomejska zemlja" često se zamjenjuju magnetskim mikročesticama obloženim silicijskim oksidom. U ovom slučaju umjesto centrifugiranja se koristi posebni magnetski stalak za mikrotube kako bi se istaložile čestice.

U Rusiji je razvijena izvorna metoda za imunoomagnetno odvajanje mikobakterija, nakon čega slijedi ekstrakcija DNA patogena. Za Mycobacterium tuberculosis imunomagnetskim separacijom koristeći ferroparticles veličine 3-5 mikrona, prevučena silikagela, na koji su vezani, kemijskom lijepljenje poliklonalna (zeca) protutijela na Mycobacterium tuberculosis. Uzorci sputuma nakon alkalne lize neutraliziraju se kiselom otopinom tris-HCl i inkubiraju s imunomagnetskim sorbentom. Zatim se imunoferroparticles skupljaju pomoću magnetske šipke s zamjenjivim vrhom, prenesu u mikrotubu i istaložu. Dodati 20-30 ul otopine 2% Triton X-100 i zagrijati 30 minuta na 90 ^° C. Supernatant se koristi kao DNA predložak za PCR analizu.

Teški problem je izolacija DNA mikobakterijskog tuberkuloza iz biopsijskih uzoraka. Za biopsiju enzima, enzim proteinaza K se koristi pri konačnoj koncentraciji od 200-500 mg / l pri temperaturi od 56 ^° C preko noći. Nadalje se koristi jedna od poznatih metoda. Višak nespecifične DNA u PCR analizi biopsija često uzrokuje inhibiciju reakcije koja zahtijeva ponovnu ekstrakciju DNA.

Metode za otkrivanje rezultata

Nakon završetka reakcije, amplificirani fragmenti DNA patogena identificirani su različitim metodama.

Metoda gel elektroforeze dobro je poznata. Tako dobiven fragment DNA su identificirani pomoću pozitivna kontrola koja sadrži željene specifičan fragment DNA ili unaprijed poznato veličine (broj parova baza fragment) koja je određena pomoću standardne molekulske marker.

U prisutnosti specifične boje, etidijev bromid je uključen u dvolančanu DNA. Sintetizirani fragment DNA detektira se kao svjetlosna vrpca pod djelovanjem ultraljubičastog.

Veličina fragmenta DNA, određena elektroforezom s udaljenosti od početka, mora odgovarati poznatom markeru molekulske težine ili pozitivnoj kontroli.

Ostali postupci određivanja na temelju rezultata PCR hibridizaciji jednolančani PCR proizvodi s oligonukleotida komplementarna - DNA sonde obilježen biotinom, nakon čega slijedi određivanje putem enzimske reakcije, na primjer vezanjem za streptavidin-alkalne fosfataze biotin.

Na temelju ove vrste detekcije, stvoreni su PCR analizatori u kojima se detekcija PCR rezultata provodi automatski kao rezultat čitanja optičke gustoće u uzorcima nakon manifestacije enzimske reakcije.

Nedostaci tih metoda su mogućnosti intralaboratorijske kontaminacije pomoću prilično kratkih fragmenata DNA molekula. Kada molekule uđu u nove uzorke, one postaju matrica za PCR i dovode do lažnih pozitivnih rezultata.

U tom smislu, kako bi se spriječili lažno pozitivni rezultati, uvode se stroga pravila za odvajanje i izolaciju prostora: ekstrakciju DNA iz bioloških uzoraka; prostorije za otkrivanje rezultata (elektroforeza) iz čiste zone. Ti prostori su zona vjerojatnog onečišćenja. Još jedno izolirano područje je čista prostorija za uvođenje uzoraka DNA koji se ispituju u epruvetama s reakcijskom smjesom za PCR. Konačno, pretpostavlja se da glavni uređaj - DNA-pojačalo - treba biti postavljen u zasebnu, moguće uredsku, sobu.

Da se spriječi kontaminacija proizvoda iz prethodnih reakcije - neki Likon-amp PCR test sustava umjesto dezoksinukleozidtimidina sadrži dezoksinukleoziduridin koji, kada je ugrađen u vitro sintezu spoja, umjesto u pravilnom položaju, tj Duksionska baza timina prisutna u nativnoj DNA zamijenjena je uracilom. Uracil DNK glikozilazom se doda u reakcijsku smjesu na analit, uništava samo kontaminirajućih fragmenti deoksiuridin, ali ne i DNA nativne analizirani. . Naknadno zagrijavanje na 94 ^° C inaktivira ovaj enzim i ne ometa amplifikaciju u PCR-u.

Postoji testni sustav koji se temelji na izotermnoj amplifikaciji rRNA, za koju se najprije provodi reverzna transkripcija i sinteza DNA molekula. što je, pak, matrica za naknadnu sintezu molekula RNA. RNA amplikoni su detektirani pomoću akridinske obojene DNA sonde kada su hibridizirane u otopini reakcijske cijevi. Ova metoda, uz visoku osjetljivost, ima prednost analize u jednoj cijevi koja sprečava onečišćenje. Prema autorima, osjetljivost ove metode u respiratornim uzorcima doseže 90% s specifičnosti 99-100%.

Nove metode detekcije provode se u realnom vremenu PCR. Ove metode razlikuju se ponajprije u tom PCR-u i detekcija njegovih rezultata provodi se istodobno u jednoj zatvorenoj cijevi. To ne samo da tehnološki pojednostavljuje tehniku analize, nego također sprječava onečišćenje laboratorijskih prostorija i uzoraka za ispitivanje sa proizvodima prethodnih PCR.

U realnom vremenu PCR rezultate za otkrivanje je zbog fluorescencije se javlja tijekom fluorogenu hibridizacijsku probu s DNA amplifitsi Rui-PCR tijekom specifičnog DNA fragmenta. Struktura fluorogenski DNA sonde konstruiran tako da je fluorescentni marker oslobađa uslijed enzimatske reakcije ili udaljeni od molekule gasioca fluorescencije samo pod određenim hibridizacije sa željenom DNA molekule biti umnožene u PCR. Kao broj molekula proba hibridizirana s povećanjem fluorescencije je proporcionalna detektirane razine broj molekula od amplificirane proizvoda. Budući da u svakom broju ciklusa PCR fragment DNA molekule množi pola, broj ciklusa u kojem se određuje fluorescencija i povećava obrnuto proporcionalna broju molekula DNA u početnom uzorku. Ako je reakcija predstaviti kao kalibratora nekoliko različitih poznatih koncentracija molekula DNA fragment od odgovarajućih Mycobacterium tuberculosis, pomoću računalnog programa može se izračunati i količinu genomske DNA u ispitivanog materijala.

Svaki standardni uzorak je dupliciran. Kvantitativni kriterij je minimalni broj PCR ciklusa potrebnih za početak i rast određene fluorescencije. Na apscisi - broj ciklusa; ordinata je vrijednost fluorescencije. Koncentracije DNA su obrnuto proporcionalne broju ciklusa potrebnih za pojavu fluorescencije. U desnom stupcu (21-32) označeni su brojevi ciklusa za odgovarajuće koncentracije. Razlike između 10-strukih koncentracija DNA fragmenata 10 ² -10 ⁶ ml - 3.2-3.4 ciklusa. Za dva bolesnika, koncentracije fragmenata IS6110 bile su oko 10 ³ / ml i 10 ⁴ / ml. Uzimajući u obzir broj ponavljanja (6-20) fragmenata analiziranih u genomu Mycobacterium tuberculosis, broj mikobakterija u kliničkim uzorcima iznosi oko 100 i 1000 stanica.

Korištenje PCR-a u dijagnostici tuberkuloze

PCR metoda je najčešće korištena za ubrzanu dijagnozu tuberkuloze - detekciju mycobacterium tuberculosis u kliničkim primjercima: sputuma. Bronhijalno navodnjavanje, pleuralni eksudat, urin, cerebrospinalna tekućina, osteoliza punctate, aspirati ženskog genitalnog trakta i razni uzorci biopsije. U studiji u Nizozemskoj su proučavali oko 500 sputuma i ispiranje bronha uzorke iz 340 bolesnika s potvrđenom dijagnozom plućne tuberkuloze usporediti osjetljivost PCR metoda, mikroskopa i studija kulture brisa. Osjetljivost analize bila je 92,6,88,9 i 52,4%. Specifičnost svih metoda bila je oko 99%.

Uspoređivana je učinkovitost detekcije mikobakterijskih tuberkuloznih mikroskopija mikrorazom, sijanje na mediju Levenstein-Jensen, testni sustav VASTES i PCR analiza. PCR je pokazala osjetljivost od 74,4%, mikroskopija - 33,8%, sijanje na gustu mediju - 48,9% i VASTES - 55,8%. Prosječno vrijeme detekcije sjemena na mediju Levenstein-Jensen je 24 dana. VASTES - 13 dana, PCR - 1 dan.

Također se raspravlja o mogućnostima korištenja PCR-a kao osjetljive i brze metode za praćenje učinkovitosti liječenja tuberkuloze.

Otkrivanje Mycobacterium tuberculosis DNK PCR-om s učinkovitom kemoterapije utvrđen tijekom dužeg vremena - u prosjeku 1,7 mjeseci u usporedbi s razmazu definiranim pod fluorescentnim mikroskopom, te 2,5 mjeseci u odnosu na bakteriološku pregled.

Dijagnoza izvanpulmonarnih oblika tuberkuloze

Vrijednost kao osjetljiv PCR postupkom je osobito velika za izvanplućni oblika, kako se on oblikuje u skladu s ovim kliničkim i rendgenske metode konvencionalne bakteriološke metode za određivanje Mycobacterium tuberculosis u dijagnostičkim materijalima nedjelotvornim.

U ispitivanju uzoraka urina PCR Rezultati su bili pozitivni na 16 od 17 bolesnika s aktivnim TB i negativnog mokraćnog 4 bolesnika neaktivnom bubrega tuberculosis i 39 bolesnika s urinarnim nontubercular bolesti sustava.

U slučajevima sumnje na tuberkulozu je dokazana učinkovitost PCR analize u istraživanju aspirata koštane srži u bolesnika s groznicom nepoznatog podrijetla. Za dijagnosticiranje tuberkuloznog limfadenitisa u djece je proučavano 102 aspirata bakterija i uzorak biopsije 67 djece s sumnjivim tuberkuloznim limfadenitisom. Dobiveni su pozitivni rezultati: 71,6% real-time PCR. Fluorescentna mikroskopija - 46,3%. Istraživanje kulture - 41,8%. U istraživanju 50 biopsija limfnih čvorova u bolesnika s "mačkama" bolesti, svi su rezultati bili negativni. Tako je dokazana 100% specifičnost PCR analize. U istom radu, s biopsijom probijanja limfnih čvorova, dokazana je mogućnost otkrivanja M. Avium.

Dijagnoza tuberkuloze ženskog genitalnog područja neplodnost, kao što je poznato, jedan je od najtežih problema dijagnoze. Pri ispitivanju PCR biopsija endometrija, endometrija usisava tekućina uzorci Douglas prostor 14 (56%) od 25 pacijenata laparoskopski ispitanih sumnja tuberkuloze, dobiveni su dobri rezultati. Korištenje mrlja mikroskopije i kulture dobivene su 1 i 2 rezultate. Ovi slučajevi također su bili PCR-pozitivni. Većina PCR-pozitivnih rezultata odnosila se na slučajeve s karakterističnim znakovima tuberkuloze prema histološkoj studiji; manji broj - s sumnjom na tuberkulozu prema laparoskopskim podacima. Samo je jedan pozitivan rezultat PCR analize dobiven u odsutnosti laparoskopskih podataka za tuberkulozu.

Kod dijagnosticiranja izvanpulmonalnih oblika tuberkuloze, kliničari često postavljaju pitanje o mogućnosti otkrivanja patogena prilikom ispitivanja uzoraka krvi PCR metodom. Književni podaci ukazuju da je moguće otkrivanje DNA iz mikobakterijum tuberkuloze iz uzoraka krvi s dalekosežnim oblicima HIV infekcije. DNK mycobacterium tuberculosis je otkriven samo s generaliziranom tuberkulozom različitih organa u bolesnika s transplantiranim bubrezima i imunosupresijom.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Identifikacija vrsta mikobakterija

PCR metoda može biti vrlo učinkovit za brzu identifikaciju mikobakterija tuberkuloze kompleksa i nekih vrsta mikobakterija nontubercular nakon primitka njihov početni rast. U tom slučaju, korištenje PCR može uštedjeti 7-10 dana potrebnih za naknadne kulture pozitivne identifikacije. Istraživanje PCR je tehnički vrlo jednostavna, jer ne zahtijevaju kompliciranu priprema uzorka kliničkog materijala kako bi se postigla visoka osjetljivost. U studiji 80 pozitivno u ovom test sustavu (MB Vasto. Organon društvo) svi pozitivni kulture PCR bili su strogo specifična i drži 1 dan. Identificirati druge vrste mikobakterija u pripravi DNA patogena kulture hibridiziranog specifičnih DNA proba označenih akridina i sojeva otkrivene pojavom kemiluminescencije preko chemiluminometer ili nitrocelulozne trake s vizualnom procjenom nakon hibridizacije. Koristeći takav kit identificirala ograničen broj vrsta: Mycobacterium tuberculosis kompleksa. M. Avium, M. Avium kompleks, M. Kansasii i M. Gordonae.

A.Telenti i sur. Razvila relativno jednostavan i jeftin način identifikacije vrsta klinički važnih vrsta mikobakterija PCR i zatim obradom s dva enzima (enzimi restrikcijskih imaju svojstva smanjiti DNA molekulu na određene točke). DNA fragment je amplificiran. Koji kodira protein toplinskog šoka (65 kDa), a zatim PCR fragment od 439 nukleotidnih parova proizvedenih PCR-om tretira se odvojeno s dva enzima, Bste II i Nae III. Zatim se analizira pomoću elektroforeze na agaroznom gelu dobije se dva proizvoda, određivanje njihove veličine (broj parova baza) koristeći standardni skup DNA fragmenata (molekularni DNK-markere) u dužini od 100 do 1000 parova baza. U svaki od specifičnih tipova (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii M.fortuitum) otkriti dvije ili tri DNA fragmenti različite veličine za svaku restrikcijskog enzima. Kombinacija različitih dobivenih DNA veličina omogućuje razlikovanje tih vrsta među sobom.

Razvija se tehnologija bioloških DNA mikropraksa. Koji će pomoći u identificiranju više od 100 vrsta mikobakterija u jednoj studiji.

Identifikacija vrsta može se provesti PCR amplifikacije 16S rRNA varijabilne regije, nakon čega je slijedilo sekvenciranje amplikona u usporedbi s odgovarajućim primarne strukture koja omogućuje identifikaciju više od 40 vrsta mikobakterija.

Uz pomoć PCR-a može se provesti identifikacija vrste unutar kompleksa mikobakterija tuberkuloze, uključujući diferencijaciju M. Bovis i M. Bovis BCG. Da bi se to postiglo, analizira se prisutnost ili odsutnost nekih gena u genomskim područjima RD1. RD9 i RD10. RD1 je odsutan u M. Bovis BCG, ali je prisutan u virulentnim vrstama, uključujući M. Bovis.

Određivanje osjetljivosti na lijek Mycobacterium tuberculosis PCR - om

Ciljevi molekularno genetičke metode osjetljivosti lijeka ili otpornost Mycobacterium tuberculosis smanjiti za identifikaciju mutacija u određenim nukleotidnim sekvencama poznatih gena. Osnovni postupci temelje se na izravnom prochityvanii (sekvenciranje) ovih sekvenci ili nakon amplifikacije hibridizaciju biotinom obilježene DNA fragmenata amplificiranih tijekom PCR DNA sonde. Obje alternative uključuju identificiranje nukleotidne supstitucije u sekvenci koje koriste DNA sonde dovode do nedostatka ili nepotpunog hibridizaciju u nitroceluloznu membranu korištenjem enzimskog konjugata (Streptavidin-alkalna fosfataza) - Postupak lipa-Rif-TB.

Postupak za mjerenje fluorescencije u lokalno na fiksni microsections DNA sonde komplementarna poznate mutacije u PCR amplificiranih regija gena odgovornih za otpornost na lijek ili osjetljivosti, nazvane mikrobiochipov metoda. Glavni algoritam za provedbu ovog istraživanja je sljedeći. Nakon izolacije DNA iz kliničkog uzorka ili kulture mikobakterija je provesti PCR amplifikacije odgovarajućih fragmenata rpoB gena odgovornog za osjetljivost na lijek ili rifampicin i katG inhA gena koji kodiraju proteine odgovorne za Mycobacterium su osjetljivost na isonazid. Rezultati su procijenjeni PCR elektroforezom na agaroznom gelu, u kojoj je potvrditi primitak odgovarajućih DNA fragmenata na željenu duljinu. Zatim se provodi drugi krug PCR-a radi uvođenja fluorescentne oznake u DNA. Rezultati PCR-a opet se potvrđuju gel elektroforezom. Nakon toga, hibridizacija je provedena (inkubacija preko noći), nakon čega slijedi ispiranje se dobiveni materijal na biočip, što je veliki broj fiksiran u malu staklenu ploča kratkih lanaca DNA (sonde) koje su komplementarne nukleotidne sekvence tipa Mycobacterium tuberculosis lijek osjetljiv na mjestima moguće mutacije. Kao i na mutantne sekvence odgovorne za rezistenciju na lijek. Lokacija DNA sondi na tanjuru - strogo definirana, a razina fluorescencije promatrane nakon hibridizacije za određivanje rezultata pomoću posebnog uređaja za čitanje instaliran. S tim u vezi, rezultati analize određuju se posebnim računalnim programom.

Posljednjih godina razvijene su alternativne metode za određivanje osjetljivosti lijekova mikobakterija tuberkuloze na temelju PCR tehnologije u stvarnom vremenu, što omogućuje provođenje ovih studija u ispitivanju zatvorene epruvete.

Na sl. 13-13 prikazuje rezultat analize kliničkih izolata Mycobacterium tuberculosis u određivanju rezistenciju na rifampicin PCR-om u realnom vremenu: 218 - kontrolni uzorak (osjetljiv na rifampicin); 93 - pozitivna kontrola za mutaciju Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - pozitivna kontrola za mutaciju Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - eksperimentalni uzorci. Rezultat izračuna kinetičkih krivulja amplifikacije na 4 kanala: kanal 1: 393 - pozitivna kontrola za mutaciju Ser-Trp TCG-TGG; kanal 2: 4482 - pozitivna kontrola za mutaciju Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - eksperimentalni uzorci; kanal 4: kinetičke krivulje pojačanja svih uzoraka koji sudjeluju u eksperimentu. Pozitivna kontrola reakcije amplifikacije. Zaključak: Rezultati analiza pokazala slijedeće mutacije koje određuju otpornost na rifampicin: u uzorcima 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Isti princip korišten je za određivanje otpornosti na lijek s izoniazidom za gene katG i inhA, koji određuju najčešće mutacije.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Identifikacija soje mycobacterium tuberculosis

Najviše temeljito istraživanje Postupak identifikacije sojeva Mycobacterium tuberculosis je tehnika naziva ograničenje polimorfizam duljine fragmenta (RFLP RFLP,, ili na engleskom jeziku), a koji se temelji na fragmentirovanin (restrikcijskom) Mycobacterium tuberculosis DNA enzima Pvu II i fragmenti dobiveni naknadne hibridizaciju s određenim specifičnim sekvencama na DNK njegov ponovljeni element IS6110. Intraspecifičko varijabilnost ostvaruje se različitim brojem ponavljanja IS6110 i njihov položaj na DNK. Kao i raznim udaljenostima između pojedinih točaka napada restrikcije enzima (restrikcijskih mjesta koja) i element IS6110. Ova je tehnologija vrlo složena i dugotrajna. Nakon tretmana s DNA iz kulture Mycobacterium tuberculosis, gel elektroforeza je izvedena s restrikcijskim enzimom, i zatim su prenesene DNA fragmenti različitih duljina na nitroceluloznu membranu, hibridizacija je provedena s fragmentima IS6110 elementu i detektira pomoću enzimske reakcije. Dobivena uzorak specifične DNA vrpce karakterizira određeni soj Mycobacterium tuberculosis. Pomoću računalne analize otkriva se identitet ili povezanost sojeva. Unatoč činjenici da je RFLP metoda najdjelotvornija, tj. Identificira najveći broj razlika u analiziranim sojevima, to je neučinkovit za mali broj (manje od 5) IS6110-ponavljanja opažene u nekim sojevima. Na sl. 13-14 prikazuje rezultate RFLP-tipizacije sojeva.

Alternativa može biti metoda spoligotipizacije - analize polimorfizma spacer DNA sekvenci - intermedijera između izravnih ponavljanja DR regije. Pri provedbi spoligotipizacije sojeva, PCR se izvodi s primerima koji vežu DR regiju, nakon čega nastaju fragmenti različitih duljina koji hibridiziraju s varijabilnim međupredmetama DNA. Prikazana je analiza distantnih sekvenci DR regije. Prema istraživačima, jednostavniji, produktivniji i prikladniji za primarnu analizu sojeva i preliminarnu epidemiološku analizu, kao i izravno istraživanje kliničkog materijala.

Očito, učinkovitija i tehnološki pristupačnija metoda je VNTR (kratica engleskog jezika) ili metoda za određivanje promjenjivog broja točnih ponovljenih točaka u DNA mycobacterium tuberculosis. Ova se metoda temelji samo na korištenju PCR-a i ne zahtijeva dodatnu manipulaciju. Budući da je broj ponovljenih tandema u različitim vrstama i različitim lokusima različit, fragmenti različitih veličina se određuju i analiziraju na nastalom elektroforemramu produkata PCR. Prema istraživačima, korištenje VNTR postiže veći stupanj diskriminacije sojeva nego s RFLP metodom.

Posljednjih godina mnogo je pozornosti posvećeno širenju sojeva Mycobacterium tuberculosis obitelji W-Beijing (koji se ponekad naziva i soj Pekinga), koji su uglavnom otporni na lijekove.

Osnovni zahtjevi za kvalitetu molekularnih bioloških istraživanja

[72], [73], [74], [75],

Osnovni regulatorni dokumenti za PCR

Narudžbe Rusko ministarstvo zdravstva: №45 od 02.07.2000 g .. Broj 109 od 21.03.2003 g .. Broj 64 od 21.02.2000, Smjernicama: 1.3.1888-04 „Organizacija rada u studijama PCR materijala zaraženo patogenim biološka agensi skupine III-IV patogenosti "; 1.3.1794-03 "Organizacija rada u istraživanju PCR materijala, zaražena mikroorganizmima skupina I-II patogenosti". 2003. 3.5.5.1034-01 „dekontaminaciju materijala, inficirane bakterije I-IV patogenosti grupe kada se koristi PCR”, 2001., 11 dodatak za združene uputama za mikrobioloških metoda ispitivanja na identifikaciju, dijagnostiku i liječenje tuberkuloze.

[76], [77], [78]

Osoblje

Izvršenje molekularnu bioloških istraživanja mogu držati doktora kliničke laboratorijske dijagnostike, liječnici bacteriologists, virolozi, liječnika, biologa, klinički dijagnostički laboratorij, kao i stručnjaka sa srednjom medicinskom obrazovanju, prošao specijalizaciju i usavršavanje na propisani način.

Raspored laboratorijskih prostorija

Sljedeće laboratorijske sobe su potrebne:

• Područje za rukovanje uzorcima je laboratorij prilagođen za rad s infektivnim agensima III-IV skupina patogenosti, prema Metodičkim uputama 13.1888-04.
• Zona za pripremu reakcijske smjese PCR - laboratorijska prostorija koja osigurava zaštitu od unutarnje laboratorijske kontaminacije - "čista" zona.
• • Ako se koristi elektroforeza ili hibridizacija za analizu PCR proizvoda. Laboratorij prostorija u kojoj se množi fragmenti DNA ekstrahirane iz cijevi i pojačanje, odnosno mogu doći u okoliš, u skladu sa zahtjevima za PCR laboratorija (1.3.1794-03 smjernice, navođenja 1.3.1888-04) mora biti u potpunosti se izdvaja iz prostora navedenih u prethodnim stavcima. To bi trebao biti isključen iz zone kretanja u zoni elektroforezu za rukovanje uzorkom i „čiste” područje bilo osoblja, opreme i sve druge materijale i objekte, kao i prijenos zraka kroz ventilacijski sustav, ili kao posljedica propuha. Ova zona nije potrebna za fluorimetrijsku detekciju PCR proizvoda.
• Soba za dokumentaciju i obradu rezultata opremljena je računalima i potrebnom uredskom opremom. Ova soba može sadržavati opremu koja omogućuje otkrivanje PCR proizvoda bez otvaranja cijevi. - fluorescentni PCR detektori i termalni cikloni za real-time PCR.

Sanitarni i epidemiološki zahtjevi za primarnu primjenu sputuma slični su standardnim mikrobiološkim zahtjevima za rad s mikobakterijama tuberkuloze.

[79], [80], [81], [82],

Završetak laboratorijske opreme za PCR dijagnostiku

Laboratorij uključuje opremu za sljedeće sobe.

• prostor za pripremu uzorka, sadrži sljedeću opremu: laminar II klase zaštite "SP-1.2": termostat sa čvrstim stanjima s pokrovom grijanja za epruvete tipa "Eppendorf"; mikrocentrifugiranje pri 13.000 okr / min; centrifuga (Vortex); hladnjak sa temperaturnom području od -20 ^do C 10 do ^oko ° C; pipete promjenjivog volumena serije "Rroline"; pumpa s OM-1 trapom; stativ za pipete; tronožac radna stanica 200x0,5 ml; stativna radna stanica 50 x 1.5 ml; Držači za pohranjivanje epruvete 80x1,5 ml;
• Sobu za pripremu reakcijske smjese: PCR-kutija za zaštitnu komoru ("Laminar-C" 110 cm); centrifuga - Vortex; Varijabilne volumne pipete serije Proline; stativ za pipete; tronožac radna stanica 200x0,2 ml; Držači za pohranjivanje epruvete 80x1,5 ml; hladnjak sa temperaturnom području od -20 ^do C do + 10 ^za C;
• soba za elektroforezu: kamera za horizontalnu elektroforezu; napajanje; transilluminator;
• DNA pojačala ili analizator nukleinske kiseline (PCR u realnom vremenu) s računalom i softverom; mogu se postaviti u svaku rezervnu sobu. Ako se koristi PCR tehnologija u realnom vremenu. Prostorija za elektroforezu nije potrebna.

[83], [84], [85], [86]

Vanjska kontrola kvalitete

Da bi bili sigurni u postizanje objektivno pouzdanih rezultata, laboratoriji bi trebali sudjelovati u sustavu vanjske procjene kakvoće laboratorijskih istraživanja.

Sudionici u sustavu kontrole kvalitete primaju; 12 bočice liofiliziranih stanica suspenzije bakterija od kojih su dvije sadrže E. Coli E. Kokosove, 3 bočice s Mycobacterium tuberculosis (soj avirulentni) na 10 ² / ml; 3 ampula sa stanicama sličnog soja u koncentraciji od 10 ⁴ / ml; 2 ampule s ne-tuberkuloznim mikobakterijama M. Avium-intracellulare i M. Kansasii u koncentraciji od 10 ⁵ / ml.

Distribuirani testovi za vanjsku procjenu kvalitete prethodno su testirani u dva nezavisna laboratorija s velikim iskustvom u ovom području.

[87], [88]