Uloga enzima i citokina u patogenezi osteoartritisa

U posljednjih nekoliko godina, mnogo pažnje istraživača usmjerena je na utvrđivanje proteaza odgovornih za razgradnju ECM zglobne hrskavice kod osteoartritisa. Prema modernim konceptima je važna uloga (MMP) igraju u patogenezi osteoartritisa. U bolesnika s osteoartritisom otkrivanje povišene razine tri predstavnika MMF - kolagenaze, stromelizine i gelatinaza. Kolagenaza je odgovoran za razgradnju kolagena, prirodnog stromelizin - kolagen tipa IV, laminin i protolikana, azhelatinaza - za razgradnju kolagena, želatine IV Vh vrste XI elastina. Nadalje, pretpostavlja postojanje drugog enzima - agrekanaze koji ima svojstva enzima MMP i odgovoran je za proteolize hrskavice proteoglikanom agregata.

Zglobna hrskavica humanih kolagenaza prepoznaje tri vrste razinama koje su povišene u bolesnika s osteoartritisom - kolagenaze-1 (MMP-1), kolagenaze-2 (MMP-8), kolagenaze-3 (MMP-13). Koegzistencija tri različite vrste kolagenaza u zglobnoj hrskavici upućuje na to da svaka od njih igra svoju posebnu ulogu. Štoviše, kolagenaze-1 i -2 su smješteni uglavnom u superficijalnim i gornjim srednjim zoni zglobne hrskavice, a kolagenaza-3 je nađen u dnu srednje i duboke zone. Osim toga, rezultati imunihistokemijski studije su pokazale da je tijekom progresije razini osteoartritisom kolagenaze-3 dostiže plato ili čak opada, a razina kolagenaze 1 postupno se povećava. Postoje dokazi da je za osteoartritis kolagenaze-1 je uglavnom su uključeni u upalnom procesu na artikularnoj hrskavici, a kolagenaza-3 - u remodeliranju tkiva. Izraženo u hrskavici pacijenata sa OA kolagenaze 3 vrši razgradnju kolagena tipa II intenzivnije od kolagenaze-1.

Predstavnika druge skupine metaloproteaze Human stromelizinovu identificirano kao tri - stromelizina-1 (MMP-3), stromelizin-2 (MMP-10) i stromelizin-3 (MMP-11). Danas je poznato da samo stromelizin-1 sudjeluje u patološkom procesu u osteoartritisu. U sinovijalne membrane pacijenata sa osteoartritisom nisu određene stromelizin-2, ali se nalazi u vrlo malim količinama u sinovijalnim fibroblastima bolesnika s reumatoidnim artritisom. Stromelizin-3, također nađen u zglobnoj masti bolesnika s reumatoidnim artritisom kod fibroblasta, osobito u područjima fibroze.

U želatinaznoj skupini, samo su dva identificirana u ljudskom hrskavom tkivu: 92 kD želatinaze (želatinaza B ili MMP-9) i želatina pri 72 kD (želatinaza A ili MMP-2); u pacijenata s osteoartritisom, određuje se povećanje razine želudatinaze od 92 kD.

Ne tako davno, identificirana je druga skupina MMP-a koja su lokalizirana na površini staničnih membrana i nazivaju se MMP membranskim tipom (MMP-MT). U ovu skupinu pripadaju četiri enzima - MMP-MT1-MMP-MT-4. MMP-MT ekspresija se nalazi u ljudskoj zglobnoj hrskavici. Iako MMP-MT-1 ima svojstva kolagenazom oba enzima MMP MT-MMP-1 i MT-2-sposoban aktivirovatzhelatinazu 72 kD i kolagenaza-3. Uloga ove skupine MMP-a u patogenezi OA zahtijeva preciziranje.

Proteinaze se izlučuju u obliku zimogena, koji je aktiviran drugim proteinazama ili organskim spojevima žive. Katalitička aktivnost MMP ovisi o prisutnosti cinka u aktivnoj zoni enzima.

Biološka aktivnost MMP kontrolira specifične TIMPs. Do danas su identificirane tri vrste TIMP koje se nalaze u ljudskim zglobnim tkivima, TIMP-1-TIMP-3. Četvrta vrsta TIMP je identificirana i klonirana, ali još nije otkrivena u ljudskim zglobnim tkivima. Te molekule se specifično veže na aktivno mjesto MMP, premda su neki od njih su u stanju vezati za aktivno mesto od 72 kDa progelatinaze (TIMP-2, -3, -4 i 92 kDa) progelatinaze (TIMP-1 i -3). Podaci pokazuju da je OA hrskavici zgloba na neravnoteže između MMP i TIMP što rezultira relativnim nedostatkom inhibitora koji se mogu djelomično povezanih s povišenom aktivnosti MMP u tkivo. TIMP-1 i -2 nalaze se u zglobnoj hrskavici, sintetizirani su hondrocitima. Kod osteoartritisa u sinovijalnoj membrani i sinovijalnoj tekućini otkriveno je samo prva vrsta TIMP. TIMP-3 detektira se isključivo u ECM-u. TIMP-4 ima identičnu sekvencu aminokiselina s TIMP-2 i -ZIN od skoro 38% -STIMP-1 za skoro 50%. Druge ciljne stanice TIMP-4 je odgovoran za modulaciju aktivacije Progelatinaza 72 kD površine stanica, što ukazuje na značajnu ulogu kao regulator tkivno specifični ECM remodeliranja.

Drugi mehanizam za kontrolu biološke aktivnosti MMP je njihova fiziološka aktivacija. Smatra se da su enzimi iz obitelji serin i cistein proteaza, kao što su PA / plazmin i katepsin B, odnosno, i fiziološki MMP aktivator. U zglobnoj hrskavici bolesnika s osteoartritisom otkriven je povišeni stupanj urokinaze (UAP) i plazmin.

Unatoč činjenici da se u zglobnim tkivima nalaze nekoliko tipova katepsina, katepsin-B se smatra najvjerojatnijim aktivatorom MMP-a u hrskavici. U tkivima ljudskog zgloba otkriveni su fiziološki inhibitori serinskih i cistein proteaza. Aktivnost inhibitora AP-1 (IAP-1), kao i cistein proteaza, smanjena je kod bolesnika s osteoartritisom. Slično kao kod MMP / TIMP, neravnoteža između serinskih i cistein proteaza i njihovih inhibitora može objasniti povećanu MMP aktivnost u zglobnoj hrskavici bolesnika s osteoartritisom. Osim toga, MMP se mogu aktivirati jedni druge. Na primjer, stromelizin-1 aktivira kolagenazu-1, kolagenazu-3 i gelatinazu 92 kD; Kolagenaza-3 aktivira 92 kD želatinazu; MMP-MT aktivira kolagenazu-3, a želatinozna-72 kD potencira ovu aktivaciju; MMP-MT također aktivira 72 kD želatinazu. Citokini se mogu podijeliti u tri skupine - destruktivne (protuupalne), regulatorne (uključujući protuupalne) i anaboličke (faktore rasta).

Vrste citokina (prema van den Berg WB et al)

Razoran	Interlejkin-1 TNF-alfa Inhibitorski faktor leukemije Interlejkin-17
Regulatorni	Interlejkin-4 Interlejkin-10 Interlejkin-13 Enzimski inhibitori
Anabolički	Faktori rasta slični mušulinu TGF-b Bone morfogenetski proteini Morfogenetski proteini dobiveni od hrskavice

Destruktivne citokini, osobito IL-1 inducira povećanje otpuštanja proteaza i inhibiraju sintezu kolagena proteoglikana i hondrocite. Regulatornih citokina, posebice IL-4 i -10, inhibiraju proizvodnju IL-1 receptora, da se poveća proizvodnja IL-1 (IL-1 RA), te smanjenje razine aktivnosti i NO-sintetaze u kondrocitima. Tako, IL-4 antagonizira IL-1 na tri načina: 1) smanjuje proizvodnju i sprječava njegove učinke, 2) povećava proizvodnju osnovne „čistač” IL-1Pa 3) smanjuje proizvodnju primarnog sekundarnog „messenger» NO. Osim toga, IL-4 smanjuje enzimatsku degradaciju tkiva. Pod uvjetima u vivo optimalni terapeutski učinak postiže se s kombinacijom IL-4 i IL-10. Anabolički faktori, kao kakTFR-p, i IGF-1, zapravo ne interferira s proizvodnjom ili djelovanje IL-1, ali prikazuje suprotnu aktivnost, na primjer, stimulira sintezu proteoglikan i kolagen, inhibiraju djelovanje proteaze i TGF (3, također inhibira oslobađanje enzima i potiče njihove inhibitore.

Propanalni citokini su odgovorni za povećanu sintezu i ekspresiju MMP u zglobnim tkivima. Oni se sintetiziraju u sinovijalnoj membrani, a zatim se difundiraju u zglobnu hrskavicu kroz sinovijalnu tekućinu. Proinflamatorni citokini aktiviraju hondrocite, koji zauzvrat također mogu proizvesti proinflamatorne citokine. U zglobovima na koje utječe osteoartroza, uloga efektora upale ima uglavnom stanice sinovijalne membrane. To je sinovitis tip makrofaga koji izlučuje proteaze i upalne medijatore. Među njima, u patogenezu osteoartritisa najveći stupanj "spojen" IL-f, TNF-a, IL-6, leukemija inhibicijski faktor (LIF) i IL-17.

Biološki aktivne tvari koje stimuliraju degradaciju zglobne hrskavice u osteoartritisu

• Interlejkin-1
• Interlejkin-3
• Interlejkin-4
• TNF-alfa
• Faktori koji stimuliraju koloniju: makrofagi (monocitni) i granulocitni makrofagi
• Tvari P
• PGE ₂
• Aktivatori plazminogena (tipovi tkiva i urokinaza) i plazmin
• Metalloproteaze (kolagenaze, ellastase, stromelizine)
• Katepsine A i B
• triler
• Bakterijski lipopolisaharidi
• Fosfolipaza Ag

Podaci iz literature pokazuju da su IL-ip i eventualno TNF-a glavni posrednici uništavanja zglobnih tkiva u osteoartritisu. Međutim, još uvijek nije poznato djeluju li međusobno neovisno ili postoji funkcionalna hijerarhija među njima. Na modelima osteoartritisa kod životinja se pokazalo da IL-1 blokada učinkovito sprječava uništavanje zglobne hrskavice, dok blokada TNF-alfa dovodi do slabljenja upala u zajedničkim tkiva. U sinovijalnoj membrani, sinovijalnoj tekućini i hrskavici pacijenata, otkrivene su povišene koncentracije oba citokina. U hondrociti su u stanju povećati sintezu ne samo proteaza (MMP i uglavnom AP), ali i manje kolagena, kao što su tipa I i III, kao i smanjiti sintezu kolagena tipa II i IX i proteoglikana. Ti citokini potiču i aktivne vrste kisika i upalne medijatore poput PGE ₂. Rezultat takvih makromolekularnih promjena u zglobnoj hrskavici s osteoartritisom je neučinkovitost popravnih procesa, što dovodi do daljnje degradacije hrskavice.

Gore navedeni proinflamatorni citokini moduliraju procese inhibicije / aktivacije MMP u osteoartritisu. Na primjer, neravnoteža između razine TIMP-1 i MMP u hrskavici u osteoartritis može biti posredovan IL-ip, jer je studija in vitro pokazala je da povećanje koncentracije IL-1 beta smanjuje koncentraciju TIMP-1 i MMP povećanu sintezu hondrociti. Sinteza AP je također modulirana IL-1 beta. Stimuliranje in vitro hondrocite iz zglobne hrskavice s IL-1 vyzyvet dozno-ovisnim povećanjem u sintezi i oštrim AP smanjenja sinteze PAI-1. Sposobnost IL-1 kako bi se smanjila sintezu sinteze PAI-1 i stimuliraju AP je snažan mehanizam za generiranje aktivaciju plazmina i MMP. Osim toga, plazmin nije samo enzimski druge enzime, također sudjeluje u razgradnji hrskavice izravnom proteolize.

IL-ip je sintetiziran kao inaktivni prekursor mase 31 kD (pre-IL-ip), Azat, nakon odcjepljenja signalni peptid, se prevodi u aktivni citokina od mase 17,5 kD. U tkivima zglobova, uključujući sinovijalne membrane i sinovijalnoj tekućini zglobne hrskavice, IL-ip otkriven u aktivnom obliku, i u studijama in vivo pokazali su sposobnost sinovijalne membrane u osteoartritis izlučivanja taj citokin. Neke serinske proteaze mogu pretvoriti pre-IL-ip u svoj bioaktivni oblik. U sisavaca, takve osobine se nalaze u samo jednoj proteazi koja pripada porodici cistein aspartatspetsificheskih enzima naziva IL-1p-konvertirajućeg enzima (IKF ili caspase-1). Ovaj enzim može specifično pretvoriti pre-IL-ip u biološki aktivan "zreli" IL-ip s masom od 17,5 kD. IKF je proenzim molekulske mase od 45 kD (p45), koji je lokaliziran u staničnoj membrani. Nakon proenzima P45 proteolitička razgradnja kako bi se dobilo dvije podjedinice, poznat kao P10 i P20, što je karakteristično za enzimatske aktivnosti.

TNF-a je također sintetiziran kao membranski prekursor s masom od 26 kD; proteolitičkim cijepanjem, oslobađa se iz stanice kao aktivnog topljivog oblika sa masom od 17 kD. Proteolitičko cijepanje provodi se TNF-a-konverzijom enzima (TNF-KF), koji pripada obitelji adamalizina. AR Amin i koautori (1997) pronašli su povećanu ekspresiju TNF-CF mRNA u zglobnoj hrskavici bolesnika s osteoartritisom.

Biološka aktivacija hondrocita i sinovitocita IL-1 i TNF-a posredovana je vezanjem na specifične receptore na površini stanica - IL-R i TNF-R. Za svaki citokin identificirali dvije vrste receptora - IL-IP I i II vrste i TNF-R I (p55) i p75 (II) vrsta. Za prijenos signala u stanicama zglobnih tkiva, IL-1PI i p55 reagiraju. IL-1 tip I ima malo veći afinitet za IL-1 beta nego za IL-la; IL-1P tip II - naprotiv, ima veći afinitet za IL-1a nego za IL-ip. Ostaje nejasno može li IL-IP II tipa II posredovati IL-1 signale ili služi samo da kompetitivno inhibira vezanje IL-1 na tip IL-1PI. U hondroiitah i sinovijalne fibroblasta u bolesnika s osteoartritisom naći veliku količinu IL-1PI i p55, što pak objašnjava visoku osjetljivost tih stanica stimulacijom citokinima relevantnim. Ovaj proces dovodi i do porasta lučenja proteolitičkih enzima i uništavanja zglobne hrskavice.

Nije isključeno sudjelovanje IL-6 u patološkom procesu u osteoartritisu. Ova se pretpostavka temelji na sljedećim opažanjima:

• IL-6 povećava broj upalnih stanica u sinovijalnoj membrani,
• IL-6 stimulira proliferaciju kondrocita,
• IL-6 povećava učinke IL-1 u povećanju sinteze MMP i inhibiranja sinteze proteoglikana.

Međutim, IL-6 je u stanju izazvati proizvodnju TIMP, ali ne utječe na proizvodnju MMP Stoga se smatra da je ovaj citokin uključen u proces širenja proteolitičke razgradnje zglobne hrskavice, koja se provodi kroz mehanizam povratne sprege.

Drugi prikazuje IL-6, obitelj je LIF - citokin, koji je proizveden hondrociti dobiveni od pacijenata s osteoartritisom, kao odgovor na stimulaciju pro-upalnih citokina IL-ip i TNF-a. LIF stimulira resorpciju proteoglikana hrskavice, kao i sintezu proizvodnje MMP i NO. Uloga ovog citokina u osteoartritisu nije potpuno razumljiva.

IL-17 je 20-30 kD homodimer koji ima IL-1-sličan učinak, ali mnogo manje izražen. IL-17 stimulira sintezu i izolaciju brojnih protuupalnih citokina, uključujući IL-ip, TNF-a, IL-6 i MMP u ciljnim stanicama, na primjer, kod humanih makrofaga. Osim toga, IL-17 stimulira proizvodnju NO s hondrocitima. Kao i LIF, uloga IL-17 u patogenezi OA malo je proučavana.

Anorganski slobodni radikal NO ima važnu ulogu u degradaciji zglobne hrskavice s OA. Hondrociti dobiveni od pacijenata s osteoartritisom proizvode više NO spontano kao i nakon stimulacije s proupalnim citokinima u usporedbi s normalnim stanicama. Visoki NO sadržaj se nalazi u sinovijalnoj tekućini i serumu bolesnika s osteoartritisom - rezultat povećane ekspresije i sinteze inducirane NO sintetaze (hNOC), enzima koji je odgovoran za proizvodnju NO. Nedavno je klonirana DNA hCOC-specifičnog hNOC, određena je aminokiselinska sekvenca enzima. Aminokiselinska sekvenca ukazuje na 50% identičnosti i 70% sličnosti s hNOC specifičnim za endotel i neuralno tkivo.

NO inhibira sintezu makromolekula ECM zglobne hrskavice i stimulira sintezu MMP. Štoviše, povećanje NO produkcije popraćeno je smanjenjem sinteze antagonista IL-IP (IL-1RA) hondrocitima. Stoga, povećanje razine IL-1 i smanjenje IL-1 RA dovodi do hiperstimulacije NO-kondrocita, što zauzvrat dovodi do povećane degradacije matrice hrskavice. Bilo je izvješća o terapeutskom učinku in vivo selektivnog inhibitora hNOC na napredovanje eksperimentalnog osteoartritisa.

Prirodni inhibitori citokina mogu izravno inhibirati vezanje citokina na receptore staničnih membrana, smanjujući njihovu proupalnu aktivnost. Prirodni inhibitori citokina mogu se podijeliti u tri klase prema načinu djelovanja.

Prva klasa inhibitora uključuje antagoniste receptora, koji sprečavaju vezanje liganda na njegov receptor natječajem za mjesto vezanja. Do sada je takav inhibitor pronađen samo za IL-1, gore navedeni kompetitivni inhibitor IL-1 / ILIP IL-1 PA sustava. IL-1 RA blokira mnoge od učinaka koji su promatrane u tkivima zglobova kod osteoartritisa, uključujući sintezu prostaglandina sinovijalnih stanica, proizvodnja kolagenaze hondrociti i razgradnje zglobne hrskavice u kabinetu.

IL-1PA je detektiran u različitim oblicima - jedan topljivi (rIL-1PA) i dva intercelularna (μIL-lPAI i μIL-1APAP). Afinitet topivog oblika IL-1RA je 5 puta veći od intercelularnih oblika. Unatoč intenzivnom znanstvenom istraživanju, funkcija potonjeg ostaje nepoznata. Eksperimety in vitro su pokazale da inhibicija IL-1 beta aktivnosti potrebne koncentracije IL-1Pa 10-100 puta prelaze granicu u uvjetima in vivo zahtijeva tisuću puta povećanje koncentracije IL-1Pa. Ta činjenica može djelomično objasniti relativni nedostatak IL-1 RA i višak IL-1 u sinoviji bolesnika s osteoartritisom.

Druga klasa prirodnih inhibitora citokina predstavljaju topivi receptori citokina. Primjer takvih inhibitora kod ljudi koji se odnose na patogenezu osteoartroze je pIL-1P i pp55. Topljivih citokinskih receptora Skraćeni oblici receptora normalnih vezanjem citokina, oni sprječavaju njihovo vezanje na membranu receptore povezane ciljne stanice, djeluju mehanizmom usporedni antagonizam.

Glavni prekursor topljivih receptora je membranski vezani IL-1PP. Afinitet rIL-IP u odnosu na IL-1 i IL-1 PA je različit. Tako, pIL-1PH ima veći afinitet za IL-1p nego za IL-1 PA, a pIL-1PI pokazuje veći afinitet za IL-1RA nego za IL-ip.

Za TNF postoje i dvije vrste topljivih receptora - pp55 i pp75, poput topljivih IL-1 receptora, oni se formiraju "sheeding" (damping). In vivo, oba receptora nalaze se u tkivima pogođenih zglobova. Raspravlja se o ulozi topljivih TNF receptora u patogenezi osteoartritisa. Smatra se da je u niskim koncentracijama da se stabilizira trodimenzionalnu strukturu TNF i povećati vrijeme poluživota i biološki aktivne citokina, dok visoke koncentracije PP55 i PP75 može smanjiti aktivnost TNF po konkurentnim antagonizma. Očigledno, pp75 može djelovati kao nosač TNF-a, olakšavajući njegovo vezanje na membranu povezanu receptor.

Treću klasu prirodnih inhibitora citokina predstavlja skupina protuupalnih citokina, koji uključuju TGF-beta, IL-4, IL-10 i IL-13. Protuupalni citokini smanjuju proizvodnju protuupalnih, kao i nekih proteaza, stimuliraju proizvodnju IL-1RA i TIMP.