Uloga enzima i citokina u patogenezi osteoartritisa

Posljednjih godina velika pažnja istraživača usmjerena je na identificiranje proteaza odgovornih za razgradnju izvanceličnog materijala zglobne hrskavice kod osteoartroze. Prema suvremenim shvaćanjima, matriksne metaloproteinaze (MMP) igraju važnu ulogu u patogenezi osteoartroze. Kod pacijenata s osteoartrozom detektira se povišena razina tri MMP-a - kolagenaza, stromelizina i želatinaza. Kolagenaza je odgovorna za razgradnju nativnog kolagena, stromelizin - kolagena tipa IV, proteoglikana i laminina, želatinaza - za razgradnju želatine, kolagena IV, Vh XI tipova, elastina. Osim toga, pretpostavlja se prisutnost još jednog enzima - agrekanaze, koja ima svojstva MMP-a i odgovorna je za proteolizu hrskavičnih agregata proteoglikana.

U ljudskoj zglobnoj hrskavici identificirane su tri vrste kolagenaza, čije su razine značajno povišene kod pacijenata s osteoartritisom: kolagenaza-1 (MMP-1), kolagenaza-2 (MMP-8) i kolagenaza-3 (MMP-13). Koegzistencija tri različite vrste kolagenaza u zglobnoj hrskavici sugerira da svaka od njih igra svoju specifičnu ulogu. Doista, kolagenaze-1 i -2 lokalizirane su uglavnom u površinskoj i gornjoj srednjoj zoni zglobne hrskavice, dok se kolagenaza-3 nalazi u donjoj srednjoj zoni i u dubokoj zoni. Štoviše, rezultati imunohistokemijske studije pokazali su da kako osteoartritis napreduje, razina kolagenaze-3 doseže plato, pa čak i opada, dok se razina kolagenaze-1 postupno povećava. Postoje dokazi da je kod osteoartritisa kolagenaza-1 uglavnom uključena u upalni proces u zglobnoj hrskavici, dok je kolagenaza-3 uključena u pregradnju tkiva. Kolagenaza-3, eksprimirana u hrskavici pacijenata s osteoartritisom, intenzivnije razgrađuje kolagen tipa II od kolagenaze-1.

Od predstavnika druge skupine metaloproteinaza, tri su također identificirane u ljudskom stromelizinu: stromelizin-1 (MMP-3), stromelizin-2 (MMP-10) i stromelizin-3 (MMP-11). Danas je poznato da je samo stromelizin-1 uključen u patološki proces kod osteoartroze. Stromelizin-2 se ne detektira u sinovijalnoj membrani pacijenata s osteoartrozom, ali se nalazi u vrlo malim količinama u sinovijalnim fibroblastima pacijenata s reumatoidnim artritisom. Stromelizin-3 se također nalazi u sinovijalnoj membrani pacijenata s reumatoidnim artritisom u blizini fibroblasta, posebno u zonama fibroze.

U skupini želatinaza u ljudskom hrskavičnom tkivu identificirane su samo dvije: 92 kD želatinaza (želatinaza B ili MMP-9) i 72 kD želatinaza (želatinaza A ili MMP-2); u bolesnika s osteoartritisom utvrđeno je povećanje razine 92 kD želatinaze.

Nedavno je identificirana još jedna skupina MMP-ova koji su lokalizirani na površini staničnih membrana i nazivaju se MMP-ovi membranskog tipa (MMP-MT). Ova skupina uključuje četiri enzima - MMP-MT1 - MMP-MT-4. Ekspresija MMP-MT pronađena je u ljudskoj zglobnoj hrskavici. Iako MMP-MT-1 ima svojstva kolagenaze, oba enzima MMP-MT-1 i MMP-MT-2 sposobni su aktivirati želatinazu-72 kDa i kolagenazu-3. Uloga ove skupine MMP-ova u patogenezi osteoartritisa zahtijeva pojašnjenje.

Proteinaze se izlučuju u obliku zimogena, koji se aktivira drugim proteinazama ili organskim spojevima žive. Katalitička aktivnost MMP-ova ovisi o prisutnosti cinka u aktivnoj zoni enzima.

Biološka aktivnost MMP-ova kontrolirana je specifičnim TIMP-ovima. Do danas su identificirane tri vrste TIMP-ova koji se nalaze u ljudskim zglobnim tkivima: TIMP-1–TIMP-3. Četvrti tip TIMP-a je identificiran i kloniran, ali još nije otkriven u ljudskim zglobnim tkivima. Ove molekule se specifično vežu za aktivno mjesto MMP-ova, iako se neke od njih mogu vezati za aktivno mjesto 72 kD progelatinaze (TIMP-2, -3, -4) i 92 kD progelatinaze (TIMP-1 i -3). Dokazi upućuju na to da kod osteoartritisa postoji neravnoteža između MMP-ova i TIMP-ova u zglobnoj hrskavici, što rezultira relativnim nedostatkom inhibitora, moguće dijelom zbog povećanja razine aktivnih MMP-ova u tkivu. TIMP-1 i -2 nalaze se u zglobnoj hrskavici i sintetiziraju ih hondrociti. Kod osteoartroze, samo se TIMP tipa I otkriva u sinovijalnoj membrani i sinovijalnoj tekućini. TIMP-3 se nalazi isključivo u izvanceličnom matičnom tijelu (ECM). TIMP-4 dijeli gotovo 50% svoje aminokiselinske sekvence s TIMP-2 i 38% s TIMP-1. U drugim ciljnim stanicama, TIMP-4 je odgovoran za modulaciju aktivacije 72 kD progelatinaze na površini stanice, što ukazuje na važnu ulogu tkivno specifičnog regulatora preoblikovanja ECM-a.

Drugi mehanizam za kontrolu biološke aktivnosti MMP-a je njihova fiziološka aktivacija. Vjeruje se da su enzimi iz obitelji serinskih i cisteinskih proteaza, poput AP/plazmina i katepsina B, fiziološki aktivatori MMP-a. Povećane razine urokinaze (uAP) i plazmina pronađene su u zglobnoj hrskavici pacijenata s osteoartritisom.

Unatoč činjenici da se u zglobnim tkivima nalazi nekoliko vrsta katepsina, katepsin-B smatra se najvjerojatnijim aktivatorom MMP-a u hrskavici. Fiziološki inhibitori serinskih i cisteinskih proteaza pronađeni su u ljudskim zglobnim tkivima. Aktivnost inhibitora AP-1 (IAI-1), kao i cisteinskih proteaza, smanjena je kod pacijenata s osteoartritisom. Slično MMP/TIMP, neravnoteža između serinskih i cisteinskih proteaza i njihovih inhibitora može objasniti povećanu aktivnost MMP-a u zglobnoj hrskavici pacijenata s osteoartritisom. Osim toga, MMP-i se mogu međusobno aktivirati. Na primjer, stromelizin-1 aktivira kolagenazu-1, kolagenazu-3 i 92 kD želatinazu; kolagenaza-3 aktivira 92 kD želatinazu; MMP-MT aktivira kolagenazu-3, a želatinaza-72 kDa pojačava ovu aktivaciju; MMP-MT također aktivira želatinazu 72 kDa. Citokini se mogu podijeliti u tri skupine - destruktivne (upalne), regulatorne (uključujući protuupalne) i anaboličke (faktori rasta).

Vrste citokina (prema van den Berg WB et al.)

Destruktivno	Interleukin-1 TNF-a Faktor inhibitora leukemije Interleukin-17
Regulatorni	Interleukin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Inhibitori enzima
Anabolički	Faktori rasta slični inzulinu TGF-β Koštani morfogenetski proteini Morfogenetski proteini dobiveni iz hrskavice

Destruktivni citokini, posebno IL-1, induciraju povećanje oslobađanja proteaza i inhibiraju sintezu proteoglikana i kolagena od strane hondrocita. Regulatorni citokini, posebno IL-4 i -10, inhibiraju proizvodnju IL-1, povećavaju proizvodnju antagonista IL-1 receptora (IL-1RA) i smanjuju razinu NO sintaze u hondrocitima. Dakle, IL-4 djeluje protiv IL-1 u tri smjera: 1) smanjuje proizvodnju, sprječavajući njegove učinke, 2) povećava proizvodnju glavnog "čistača" IL-1RA i 3) smanjuje proizvodnju glavnog sekundarnog "glasnika" NO. Osim toga, IL-4 smanjuje enzimsku razgradnju tkiva. In vivo, optimalni terapijski učinak postiže se kombinacijom IL-4 i IL-10. Anabolički faktori poput TGF-β i IGF-1 zapravo ne ometaju proizvodnju ili djelovanje IL-1, već pokazuju suprotnu aktivnost, na primjer, stimuliraju sintezu proteoglikana i kolagena, suzbijaju aktivnost proteaza, a TGF-β također inhibira oslobađanje enzima i stimulira njihove inhibitore.

Proinflamatorni citokini odgovorni su za povećanu sintezu i ekspresiju MMP-a u zglobnim tkivima. Sintetiziraju se u sinovijalnoj membrani, a zatim difundiraju u zglobnu hrskavicu kroz sinovijalnu tekućinu. Proinflamatorni citokini aktiviraju hondrocite, koji su pak također sposobni proizvoditi proinflamatorne citokine. U zglobovima zahvaćenim osteoartrozom, ulogu efektora upale uglavnom igraju stanice sinovijalne membrane. Sinovociti makrofagnog tipa luče proteaze i upalne medijatore. Među njima, IL-f, TNF-a, IL-6, inhibitorni faktor leukemije (LIF) i IL-17 najviše su „uključeni“ u patogenezu osteoartroze.

Biološki aktivne tvari koje potiču razgradnju zglobne hrskavice kod osteoartritisa

• Interleukin-1
• Interleukin-3
• Interleukin-4
• TNF-a
• Čimbenici koji stimuliraju koloniju: makrofagi (monociti) i granulociti-makrofagi
• Supstanca P
• STR. ₂
• Aktivatori plazminogena (tkivni i urokinazni tip) i plazmin
• Metaloproteinaze (kolagenaze, elastaze, stromelizini)
• Katepsini A i B
• Trilsin
• Bakterijski lipopolisaharidi
• Fosfolipaza Ag

Podaci iz literature ukazuju na to da su IL-1 i, moguće, TNF-a glavni medijatori uništavanja zglobnog tkiva kod osteoartroze. Međutim, još uvijek nije poznato djeluju li neovisno jedan o drugome ili postoji funkcionalna hijerarhija između njih. Životinjski modeli osteoartroze pokazali su da blokada IL-1 učinkovito sprječava uništavanje zglobne hrskavice, dok blokada TNF-a dovodi samo do smanjenja upale u zglobnim tkivima. Povećane koncentracije oba citokina pronađene su u sinovijalnoj membrani, sinovijalnoj tekućini i hrskavici pacijenata. U hondrocitima su sposobni povećati sintezu ne samo proteaza (uglavnom MMP i AP), već i sporednih kolagena, poput tipova I i III, te smanjiti sintezu kolagena tipova II i IX te proteoglikana. Ovi citokini također stimuliraju reaktivne vrste kisika i upalne medijatore poput PGE2 _. Rezultat takvih makromolekularnih promjena u zglobnoj hrskavici kod osteoartritisa je neučinkovitost reparativnih procesa, što dovodi do daljnje degradacije hrskavice.

Gore spomenuti proinflamatorni citokini moduliraju procese supresije/aktivacije MMP-a kod osteoartroze. Na primjer, neravnoteža između razina TIMP-1 i MMP-a u hrskavici kod osteoartroze može biti posredovana IL-1, budući da je in vitro studija pokazala da povećanje koncentracije IL-1 beta dovodi do smanjenja koncentracije TIMP-1 i povećanja sinteze MMP-a od strane hondrocita. Sintezu AP-a također modulira IL-1 beta. In vitro stimulacija hondrocita zglobne hrskavice s IL-1 uzrokuje povećanje sinteze AP-a ovisno o dozi i naglo smanjenje sinteze iAP-1. Sposobnost IL-1 da smanji sintezu iAP-1 i stimulira sintezu AP-a snažan je mehanizam za stvaranje plazmina i aktivaciju MMP-a. Osim toga, plazmin nije samo enzim koji aktivira druge enzime, već i sudjeluje u procesu razgradnje hrskavice izravnom proteolizom.

IL-ip se sintetizira kao neaktivni prekursor mase 31 kD (pre-IL-ip), a zatim se, nakon cijepanja signalnog peptida, pretvara u aktivni citokin mase 17,5 kD. U zglobnim tkivima, uključujući sinovijalnu membranu, sinovijalnu tekućinu i zglobnu hrskavicu, IL-ip se nalazi u aktivnom obliku, a in vivo studije su pokazale sposobnost sinovijalne membrane kod osteoartroze da luči ovaj citokin. Neke serinske proteaze sposobne su pretvoriti pre-IL-ip u njegov bioaktivni oblik. Kod sisavaca su takva svojstva pronađena samo kod jedne proteaze, koja pripada obitelji enzima specifičnih za cistein aspartat i naziva se IL-1β-konvertirajući enzim (ICF ili kaspaza-1). Ovaj enzim je sposoban specifično pretvoriti pre-IL-ip u biološki aktivni "zreli" IL-ip mase 17,5 kD. ICF je proenzim (p45) mase 45 kD koji je lokaliziran u staničnoj membrani. Nakon proteolitičkog cijepanja proenzima p45 nastaju dvije podjedinice poznate kao p10 i p20, koje karakterizira enzimska aktivnost.

TNF-a se također sintetizira kao membranski vezan prekursor s masom od 26 kDa; proteolitičkim cijepanjem oslobađa se iz stanice kao aktivni topljivi oblik s masom od 17 kDa. Proteolitičko cijepanje provodi enzim koji pretvara TNF-a (TNF-AC), koji pripada obitelji adamalizina. AR Amin i sur. (1997.) otkrili su povećanu ekspresiju TNF-AC mRNA u zglobnoj hrskavici pacijenata s osteoartritisom.

Biološka aktivacija hondrocita i sinovocita pomoću IL-1 i TNF-a posredovana je vezanjem na specifične receptore na površini stanice - IL-R i TNF-R. Za svaki citokin identificirane su dvije vrste receptora - IL-IP tipovi I i II te TNF-R tipovi I (p55) i II (p75). IL-1PI i p55 odgovorni su za prijenos signala u stanicama zglobnog tkiva. IL-1R tip I ima nešto veći afinitet za IL-1beta nego za IL-1a; IL-1R tip II, naprotiv, ima veći afinitet za IL-1a nego za IL-ip. Ostaje nejasno može li IL-IP tip II posredovati signale IL-1 ili služi samo za kompetitivnu inhibiciju povezanosti IL-1 s IL-1R tipom I. Hondroitidi i sinovijalni fibroblasti pacijenata s osteoartrozom sadrže velike količine IL-1PI i p55, što pak objašnjava visoku osjetljivost tih stanica na stimulaciju odgovarajućim citokinima. Ovaj proces dovodi do povećanog lučenja proteolitičkih enzima i uništavanja zglobne hrskavice.

Uključenost IL-6 u patološki proces osteoartritisa ne može se isključiti. Ova pretpostavka temelji se na sljedećim opažanjima:

• IL-6 povećava broj upalnih stanica u sinovijalnoj membrani,
• IL-6 stimulira proliferaciju hondrocita,
• IL-6 pojačava učinke IL-1 u povećanju sinteze MMP-a i inhibiranju sinteze proteoglikana.

Međutim, IL-6 je sposoban inducirati proizvodnju TIMP-ova, ali ne utječe na proizvodnju MMP-ova, pa se smatra da je ovaj citokin uključen u proces inhibicije proteolitičke razgradnje zglobne hrskavice, što se provodi mehanizmom povratne veze.

Drugi član obitelji IL-6 je LIF, citokin koji proizvode hondrociti dobiveni od pacijenata s osteoartrozom kao odgovor na stimulaciju proinflamatornim citokinima IL-1p i TNF-a. LIF stimulira resorpciju proteoglikana hrskavice, kao i sintezu MMP-a i proizvodnju NO. Uloga ovog citokina u osteoartrozi nije u potpunosti razjašnjena.

IL-17 je homodimer od 20-30 kD s učinkom sličnim IL-1, ali mnogo manje izraženim. IL-17 stimulira sintezu i oslobađanje brojnih proinflamatornih citokina, uključujući IL-1p, TNF-a, IL-6 i MMP u ciljnim stanicama, poput ljudskih makrofaga. Osim toga, IL-17 stimulira proizvodnju NO od strane hondrocita. Poput LIF-a, uloga IL-17 u patogenezi osteoartritisa slabo je proučena.

Anorganski slobodni radikal NO igra važnu ulogu u razgradnji zglobne hrskavice kod osteoartritisa. Hondrociti izolirani od pacijenata s osteoartritisom proizvode veće količine NO i spontano i nakon stimulacije proinflamatornim citokinima u usporedbi s normalnim stanicama. Visok sadržaj NO pronađen je u sinovijalnoj tekućini i serumu pacijenata s osteoartritisom - to je rezultat povećane ekspresije i sinteze inducirane NO sintaze (hNOC), enzima odgovornog za proizvodnju NO. Nedavno je klonirana DNA hNOC-a specifičnog za hondrocite i određen je aminokiselinski slijed enzima. Aminokiselinski slijed ukazuje na 50% identičnosti i 70% sličnosti s hNOC-om specifičnim za endotel i živčano tkivo.

NO inhibira sintezu makromolekula izvanceličnog materijala (ECM) zglobne hrskavice i stimulira sintezu MMP-a. Štoviše, povećanje proizvodnje NO prati smanjenje sinteze antagonista IL-IP (IL-1RA) od strane hondrocita. Dakle, povećanje razine IL-1 i smanjenje IL-1RA dovodi do hiperstimulacije NO u hondrocitima, što zauzvrat dovodi do povećane razgradnje hrskavičnog matriksa. Postoje izvješća o terapijskom učinku in vivo selektivnog hNOC inhibitora na progresiju eksperimentalne osteoartroze.

Prirodni inhibitori citokina mogu izravno spriječiti vezanje citokina na receptore stanične membrane, smanjujući njihovu proinflamatornu aktivnost. Prirodni inhibitori citokina mogu se podijeliti u tri klase na temelju njihovog načina djelovanja.

Prva klasa inhibitora uključuje antagoniste receptora koji sprječavaju vezanje liganda za njegov receptor kompetitivnim djelovanjem za mjesto vezanja. Do danas je takav inhibitor pronađen samo za IL-1 - to je gore spomenuti kompetitivni inhibitor IL-1/ILIP sustava IL-1 PA. IL-1 PA blokira mnoge učinke koji se opažaju u zglobnim tkivima kod osteoartritisa, uključujući sintezu prostaglandina sinovijalnim stanicama, proizvodnju kolagenaze hondrocitima i razgradnju koštane srži zglobne hrskavice.

IL-1RA se nalazi u različitim oblicima - jednom topljivom (rIL-1RA) i dva međustanična (μIL-lPAI i μIL-1RAP). Afinitet topljivog oblika IL-1RA je 5 puta veći od afiniteta međustaničnih oblika. Unatoč intenzivnim znanstvenim istraživanjima, funkcija potonjeg ostaje nepoznata. In vitro eksperimenti pokazali su da inhibicija aktivnosti IL-1beta zahtijeva koncentraciju IL-1RA 10-100 puta veću od normalne, dok in vivo uvjeti zahtijevaju tisućustruko povećanje koncentracije IL-1RA. Ova činjenica može djelomično objasniti relativni nedostatak IL-1RA i višak IL-1 u sinovijalnoj ovojnici pacijenata s osteoartrozom.

Druga klasa prirodnih inhibitora citokina su topljivi citokinski receptori. Primjeri takvih inhibitora kod ljudi koji su povezani s patogenezom osteoartritisa su rIL-1R i pp55. Topljivi citokinski receptori su skraćeni oblici normalnih receptora; kada se vežu za citokine, sprječavaju njihovo vezanje za membranski povezane receptore ciljnih stanica, djelujući mehanizmom kompetitivnog antagonizma.

Glavni prekursor topljivih receptora je membranski vezan IL-1RP. Afinitet rIL-IP za IL-1 i IL-1RA je različit. Dakle, rIL-1RN ima veći afinitet za IL-1β nego za IL-1RA, a rIL-1PI pokazuje veći afinitet za IL-1RA nego za IL-ip.

Postoje i dvije vrste topljivih receptora za TNF - pp55 i pp75, poput topljivih IL-1 receptora, nastaju "odbacivanjem". In vivo se oba receptora nalaze u tkivima zahvaćenih zglobova. Uloga topljivih TNF receptora u patogenezi osteoartroze je predmet rasprave. Pretpostavlja se da u niskim koncentracijama stabiliziraju trodimenzionalnu strukturu TNF-a i povećavaju poluživot bioaktivnog citokina, dok visoke koncentracije pp55 i pp75 mogu smanjiti aktivnost TNF-a kompetitivnim antagonizmom. Vjerojatno, pp75 može djelovati kao nosač TNF-a, olakšavajući njegovo vezanje na receptor povezan s membranom.

Treću klasu prirodnih inhibitora citokina predstavlja skupina protuupalnih citokina, koji uključuju TGF-beta, IL-4, IL-10 i IL-13. Protuupalni citokini smanjuju proizvodnju proupalnih i nekih proteaza te stimuliraju proizvodnju IL-1RA i TIMP-a.