Imunološke studije u urologiji

Propisivanje imunograma urološkom pacijentu znači da liječnik posumnja na prisutnost poremećaja u imunološkom sustavu. Ponavljajuće bakterijske, virusne, gljivične infekcije, alergijske manifestacije, sistemske bolesti mogu biti znakovi ovih poremećaja, koje karakterizira niz sindroma (infektivni, onkološki, alergijski, autoimuni, limfoproliferativni). Jedan pacijent može imati nekoliko sindroma. Na primjer, kronične zarazne bolesti (infektivni sindrom) mogu uzrokovati imunodeficijenciju, a imunodeficijencija se može manifestirati kao predispozicija za infektivne i onkološke bolesti (onkološki sindrom). Predispozicija za infekcije može se pojaviti na pozadini sekundarne imunodeficijencije, koja se razvila kao posljedica limfoproliferativne bolesti, poput leukemije. Postoje tri glavne skupine patoloških promjena u imunološkom sustavu:

• kvantitativni ili funkcionalni nedostatak jedne ili druge veze imunološkog sustava, što dovodi do razvoja imunodeficijencije;
• poremećaj u prepoznavanju antigena od strane imunološkog sustava, što dovodi do razvoja autoimunih procesa;
• hiperreaktivni ili "perverzni" imunološki odgovor, koji se manifestira razvojem alergijskih bolesti.

Postoje probirne (testovi razine 1) i razjašnjavajuće (testovi razine 2) metode imunodijagnostike. Prve postoje za bilježenje poremećaja u imunološkom sustavu, a druge - za utvrđivanje mehanizama uključenih u njihovu provedbu u svrhu daljnje imunokorekcije.

B-stanični imunitet

Metode probira

• Određivanje relativnog i apsolutnog broja B-limfocita imunofluorescencijom ili protočnom citofluorometrijom s monoklonskim antitijelima na antigene B-stanica (CD19, CD20, gdje je CD skupina diferencijacije). Normalan sadržaj B-limfocita u odraslih je 8-19% ukupnog broja leukocita ili 190-380 stanica/μl. Povećanje sadržaja B-limfocita javlja se kod akutnih i kroničnih bakterijskih i gljivičnih infekcija, kroničnih bolesti jetre, sistemskih bolesti vezivnog tkiva, kronične limfocitne leukemije i mijeloma.
• Određivanje koncentracije nespecifičnih imunoglobulina (F, M, G, E) jednostavnom radijalnom imunodifuzijom, nefelometrijom ili turbometrijom, radioimunotestom ili enzimskim imunološkim testom (ELISA). Norme za odrasle: imunoglobulin (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 03-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. Povećanje koncentracije imunoglobulina javlja se u istim patološkim stanjima u kojima dolazi do povećanja sadržaja B-limfocita. Smanjenje koncentracije imunoglobulina javlja se kod kongenitalne hipogamaglobulinemije, neoplazmi imunološkog sustava, uklanjanja slezene, gubitka proteina, bolesti bubrega ili crijeva, liječenja citostaticima i imunosupresivima.

Metode razjašnjavanja

• Određivanje cirkulirajućih imunoloških kompleksa u krvi selektivnom precipitacijom u polietilen glikolu nakon čega slijedi spektrofotometrijski test gustoće (normalno 80-20 U). Povećanje cirkulirajućih imunoloških kompleksa tipično je za akutne bakterijske, gljivične, virusne infekcije, autoimune bolesti imunokompleksa, serumsku bolest, alergijske reakcije tipa 3;
• Određivanje specifičnih imunoglobulina u krvi u odnosu na bakterijske i virusne antigene, deoksiribonukleinsku kiselinu (DNK) kod autoimunih bolesti, detekcija antispermičnih (autoimuna neplodnost) i antirenalnih antitijela (pijelonefritis i glomerulonefritis) radijalnom imunodifuzijskom ili ELISA metodom.
• Određivanje antispermalnih antitijela u spermi [MAR test (mješovita antiglobulinska reakcija)], normalan - negativan rezultat.
• Određivanje koncentracije imunoglobulina u urinu u svrhu diferencijalne dijagnoze između pijelonefritisa i glomerulonefritisa (selektivnost proteinurije).
• Određivanje sadržaja IgE u soku prostate u svrhu dijagnosticiranja alergijskog prostatitisa metodom radijalne imunodifuzije ili ELISA testom.
• Proučavanje odgovora u reakciji blastne transformacije B-limfocita na mitogen B-stanica (mitogen pokeweed za stimulaciju reakcije blastne transformacije B-limfocita u prisutnosti T-limfocita), čija je normativna vrijednost 95-100%.

T-stanična veza imuniteta

Metode probira

• Određivanje relativnog i apsolutnog broja zrelih CD3 T-limfocita imunofluorescentnom reakcijom ili protočnom citofluorometrijom korištenjem monoklonskih anti-CD3 antitijela. Norma za odrasle je 58-76% ili 1100-1700 stanica/μl. Smanjenje broja T-limfocita pokazatelj je insuficijencije stanične veze imuniteta. To je tipično za neke sekundarne i primarne imunodeficijencije (kronične bakterijske i virusne infekcije: tuberkuloza, sindrom stečene imunodeficijencije, maligni tumori, kronično zatajenje bubrega, ozljede, stres, starenje, pothranjenost, liječenje citostaticima, izloženost ionizirajućem zračenju). Povećanje broja T-limfocita javlja se na pozadini imunološke hiperaktivnosti ili kod limfoproliferativnih bolesti. Kod upale se broj T-limfocita prvo povećava, a zatim smanjuje. Odsutnost smanjenja T-limfocita ukazuje na kronični upalni proces.
• Evaluacija subpopulacija limfocita.
  • Određivanje broja T-pomagačkih stanica (anti-CD4 antitijela). Normalno 36-55% ili 400-1100 stanica/mcl. Povećanje broja ovih stanica javlja se kod autoimunih bolesti, Waldenstromove bolesti, aktivacije antitransplantacijskog imuniteta; smanjenje broja T-pomagačkih stanica javlja se kod kroničnih bakterijskih, virusnih, protozojskih infekcija, tuberkuloze, sindroma stečene imunodeficijencije, malignih tumora, opeklina, ozljeda, pothranjenosti, starenja, liječenja citostaticima, izloženosti ionizirajućem zračenju.
  • Određivanje broja T-supresora (anti-CD4 antitijela). Normalno 17-37% ili 300-700 stanica/μl. Povećanje broja T-supresora događa se u istim uvjetima u kojima se smanjuje broj T-pomagačkih stanica, a njihovo smanjenje događa se u istim uvjetima u kojima se povećava sadržaj T-pomagačkih stanica.
  • Imunoregulacijski indeks CD4/CD8, normalno 1,5-2,5. Hiperaktivnost s vrijednostima iznad 2,5 (alergijske i autoimune bolesti); hipoaktivnost - manja od 1,0 (sklonost kroničnim infekcijama). Na početku upalnog procesa imunoregulacijski indeks se povećava, a kada se smiri, normalizira se.

Metode razjašnjavanja

• Određivanje broja prirodnih ubojica (NK stanica) - anti-CD16 i anti-CD56 antitijela. Norma za CD 16 limfocite je 6-26%, CD56 - 9-19%. Povećanje broja NK stanica javlja se tijekom odbacivanja transplantata, smanjenje - kod virusnih infekcija, raka, primarnih i sekundarnih imunodeficijencija, opeklina, ozljeda i stresa, liječenja citostaticima i izloženosti ionizirajućem zračenju.
• Određivanje broja T-limfocita s receptorom za interleukin-2 (aktivacijski marker) - anti-CD25 antitijela. Norma je 10-15%. Povećanje njihovog broja opaža se kod alergijskih bolesti, odbacivanja transplantata, odgovora na timus-ovisne antigene u akutnom razdoblju primarne infekcije, smanjenje - kod istih bolesti kod kojih dolazi do smanjenja broja NK stanica.
• Proučavanje ekspresije aktivacijskog markera - molekule histokompatibilnosti HLA-DR klase II. Povećana ekspresija javlja se u upalnim procesima, kod pacijenata s hepatitisom C, celijakijom, sifilisom, akutnim respiratornim bolestima.
• Evaluacija apoptoze limfocita. Okvirna predodžba o spremnosti limfocita za apoptozu može se odrediti ekspresijom Fas receptora (CD95) na njihovoj površini i bd-2 protoonkogena u mitohondrijima. Apoptoza limfocita procjenjuje se tretiranjem s dvije fluorescentne boje: propidij jodidom, koji se veže na fragmente DNA, i aneksinom Y, koji se veže na fosfatidilserin, koji se pojavljuje na staničnoj membrani na početku apoptoze. Rezultati se procjenjuju pomoću protočnog citofluorometra. Rezultati se izračunavaju na temelju omjera stanica obojenih različitim bojama. Neobojene stanice su održive, stanice vezane samo na aneksin Y su rane manifestacije apoptoze, s propidij jodidom i aneksinom Y su kasne manifestacije apoptoze, bojenje samo propidij jodidom ukazuje na nekrozu.
• Evaluacija proliferacije T-limfocita in vitro.
  • Promjene u staničnoj blastogenezi - reakcija blastne transformacije limfocita. Leukociti se inkubiraju s bilo kojim mitogenom biljnog podrijetla (lektini). Fitohemaglutinin se najčešće koristi 72 sata, zatim se uzima razmaz, boji i broji broj blasta! Indeks stimulacije je omjer postotka transformiranih stanica u pokusu (kultura s fitohemaglutininom) i postotka transformiranih stanica u kontroli (kultura bez fitohemaglutinina). Reakcija blastne transformacije limfocita može se procijeniti uključivanjem radioaktivne oznake (ZN-timndinum) u kultivirane stanice, budući da se sinteza DNA povećava tijekom stanične diobe. Poremećaji u proliferativnom odgovoru javljaju se i kod primarnih i kod sekundarnih imunodeficijencija povezanih s infekcijama, rakom, zatajenjem bubrega i kirurškim intervencijama.
  • U tim studijama procjenjuje se ekspresija aktivacijskih markera (CD25, transferinski receptor - CD71) i molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II HLA-DR, koji praktički ne postoje na mirujućim T-limfocitima. T-limfociti se stimuliraju fitohemaglutininom, nakon 3 dana analizira se ekspresija aktivacijskih markera metodom izravne ili neizravne imunofluorescentne reakcije, protočne citofluorometrije, korištenjem monoklonskih antitijela na izolirane receptore.
  • Mjerenje količine medijatora sintetiziranih aktiviranim T-limfocitima [interleukin (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferon itd.] pomoću radioimunotesta ili ELISA testa. Od posebne je važnosti procjena koncentracije γ-interferona i IL-4 kao markera Th1 i Th2 u supernatantu aktiviranih kultura i unutar stanice. Ako je moguće, korisno je odrediti ekspresiju gena za odgovarajući citokin razinom matrične ribonukleinske kiseline u stanici producentu i intenzitetom ekspresije receptora za odgovarajuće citokine.
    
• Reakcija inhibicije migracije limfocita. Senzibilizirani T-limfociti u reakciji s antigenom izlučuju limfokine, uključujući faktore koji inhibiraju migraciju limfocita. Fenomen inhibicije opaža se kada se mitogeni unesu u staničnu kulturu. Procjena stupnja inhibicije omogućuje nam procjenu sposobnosti limfocita da luče citokine. Normalno, učestalost migracije, ovisno o specifičnom mitogenu, iznosi 20-80%.
• Procjena citotoksičnosti NK stanica. Određuje se sposobnost prirodnih stanica ubojica da ubiju ciljne stanice eritromijeloidne linije K-562. Ako se procjenjuje citotoksičnost ovisna o antitijelima, koriste se ciljne stanice obložene IgG antitijelima. Ciljne stanice su označene 3H-uridinom i inkubirane s efektorskim stanicama. Smrt ciljnih stanica procjenjuje se oslobađanjem radioaktivne oznake u otopinu. Smanjenje citotoksičnosti javlja se kod malignih neoplazmi. U nekim slučajevima, kada je potrebno predvidjeti učinkovitost liječenja interleukinima, citotoksičnost NK stanica procjenjuje se tijekom inkubacije s određenim citokinima.

Proučavanje funkcije fagocita

Metode probira

Proučavanje intenziteta apsorpcije mikrobnih stanica fagocitima (fagocitoza lateks čestica, testna kultura stafilokoka, E. coli ili mikroorganizama izoliranih od pacijenta). Centrifugiranjem heparinizirane krvi izolira se suspenzija leukocita, dodaje se serum IV krvne grupe za opsonizaciju (opsonini su proteini koji pojačavaju fagocitozu). Mikrobna suspenzija se razrjeđuje, miješa s leukocitima i inkubira 120 minuta, uzimajući uzorke za analizu 30,90,120 minuta nakon početka inkubacije. Iz prikupljene suspenzije leukocita izrađuju se razmazi. Određuju se sljedeći pokazatelji fagocitoze:

• fagocitni indeks - postotak stanica koje su ušle u fagocitozu unutar 30 minuta i 120 minuta inkubacije; standardna vrijednost fagocitnog indeksa (30) je 94%, fagocitni indeks (120) je 92%;
• fagocitni broj - prosječan broj bakterija smještenih unutar stanice; standardna vrijednost fagocitnog broja (30) je 11%, fagocitni broj (120) je 9,8%;
• koeficijent fagocitnog broja - omjer fagocitnog broja (30) i fagocitnog broja (120); normalno 1,16;
• Baktericidni indeks neutrofila - omjer broja ubijenih mikroba unutar fagocita i ukupnog broja apsorbiranih mikroba; normalno 66%.

Metode razjašnjavanja

• Proučavanje baktericidne sposobnosti fagocita u testu s nitroplavim tetrazolijem (NBT) - NBT test. Leukocitima se dodaje žuta nitroplava tetrazolijeva boja. Kada neutrofil apsorbira boju, dolazi do procesa redukcije pod utjecajem slobodnih kisikovih radikala, što rezultira plavom obojenošću. Reakcija se provodi na ploči s ravnim dnom s 96 jažica. Hanksova otopina (spontani NBT) dodaje se u prve tri jažice sa smjesom NBT-a i leukocita, a u drugu se dodaju čestice lateksa; smjesa se inkubira na 37 C tijekom 25 minuta. Rezultati se očitavaju na 540 nm na čitaču i izražavaju u proizvoljnim jedinicama. Izračunava se koeficijent stimulacije (K _st ), jednak omjeru optičke gustoće u stimuliranim jažicama i prosječne optičke gustoće u jažicama bez stimulacije. Kod zdravih osoba, NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78±0,36.
• Studija adhezijskih molekula. Protočna citofluorometrija koristi se za određivanje ekspresije površinskih antigena CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Imunodeficijencije s oštećenom adhezijom manifestiraju se ponavljajućim infekcijama, sporim cijeljenjem rana i odsutnošću gnoja u žarištima infekcije.

Proučavanje sustava komplementa

Metode probira

Određivanje hemolitičke aktivnosti komplementa je proučavanje klasičnog puta aktivacije komplementa. Različita razrjeđenja seruma bolesne i zdrave osobe dodaju se ovčjim eritrocitima obloženim antitijelima. Jedinica hemolitičke aktivnosti je recipročna vrijednost razrjeđenja seruma pri kojem je uništeno 50% eritrocita. Stupanj hemolize procjenjuje se fotometrijski oslobađanjem hemoglobina u otopinu. Smanjenje hemolitičke aktivnosti komplementa opaža se kod sistemskog eritemskog lupusa s oštećenjem bubrega, akutnog glomerulonefritisa, kombiniranih imunodeficijencija, mijastenije, virusnog hepatitisa, limfoma, a povećanje - kod opstruktivne žutice, Hashimotovog tireoiditisa, reumatizma, reumatoidnog artritisa, nodularnog periarteritisa, dermatomiozitisa, infarkta miokarda, ulceroznog kolitisa, Reiterovog sindroma, gihta.

Metode razjašnjavanja

• Određivanje komponenti komplementa. Kvantitativno određivanje provodi se radijalnom imunodifuzijom i nefelometrijom.
  Studija nije informativna osim ako se antigenska svojstva komponenti komplementa ne promijene.
• Utvrđeno je da Clq komponenta komplementa pojačava fagocitozu i posreduje u staničnoj citotoksičnosti. Njeno smanjenje javlja se kod bolesti imunoloških kompleksa, sistemskog eritemskog lupusa, gnojnih infekcija i tumora.
• C3 komponenta je uključena u aktivaciju klasičnih i alternativnih putova komplementa. Smanjenje njezine koncentracije povezano je s kroničnim bakterijskim i gljivičnim infekcijama, prisutnošću cirkulirajućih ili tkivnih imunoloških kompleksa.
• C4 komponenta je uključena u aktivaciju klasičnog puta. Smanjenje njezine koncentracije povezano je s produljenom aktivacijom komplementa imunološkim kompleksima i smanjenjem koncentracije C1 inhibitora, koji kontrolira aktivaciju klasičnog puta komplementa. Nedostatak C4 javlja se kod sistemskog eritemskog lupusa, povećanje C4 javlja se kod bolesti bubrega, odbacivanja transplantata, akutne upale i gastrointestinalnih bolesti.
• C5a je mali fragment molekule C5 koji se od nje odvaja kao rezultat aktivacije sustava komplementa. Njegova koncentracija raste tijekom upale, sepse, atopijskih i alergijskih bolesti.
• Cl-inhibitor je multifunkcionalni faktor. Kontrolira aktivaciju komponente komplementa C1, inhibira aktivnost kalikreina, plazmina i aktiviranog Hagemanovog faktora, Cl i Or proteaza. Nedostatak C1-inhibitora dovodi do angioedema.
• funkcionalne studije komplementa. Testni serum se dodaje standardnom serumu kojem nedostaje bilo koja komponenta komplementa i određuje se hemolitička aktivnost komplementa. Ako se hemolitička aktivnost ne vrati u normalu, aktivnost ove komponente komplementa u testnom serumu smatra se smanjenom.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]