Laboratorijska dijagnoza osteoartritisa

U većini slučajeva, pacijenti s osteoartritisom nemaju promjene u krvnim i mokraćnim pretragama, osim u slučajevima sinovitisa sa značajnim izljevom, kada se može javiti porast ESR-a, hipergamaglobulinemija, porast razine pokazatelja akutne faze - CRP, fibrinogena itd. Pri pregledu sinovijalne tekućine ne otkrivaju se značajne razlike od normalnih pokazatelja.

Posljednjih godina intenzivno se traga za mogućim biološkim markerima (BM) degradacije i reparacije zglobnih tkiva (uglavnom hrskavice i kosti). BM bi trebao odražavati te dinamičke promjene, služiti kao prediktori prognoze osteoartroze i markeri učinkovitosti patogenetskog liječenja. Otkriće novih i dublje proučavanje poznatih bioloških markera omogućit će bolje razumijevanje mehanizama patogeneze osteoartroze. Međutim, glavni zadatak korištenja bioloških markera metabolizma hrskavice je procjena hondroprotektivnih svojstava lijekova i praćenje liječenja lijekovima koji pripadaju DMO AD skupini - "modificirajući bolest".

Kod osteoartritisa, patološke promjene se javljaju uglavnom u zglobnoj hrskavici, kao i u subhondralnoj kosti, sinovijalnoj membrani i drugim mekim tkivima zgloba. Budući da je naša sposobnost izravnog pregleda ovih struktura ograničena, najvažniji izvori za prikupljanje bioloških markera su krv, urin i sinovijalna tekućina.

Testiranje urina je najpoželjnije jer ne uključuje nikakve invazivne postupke. Po našem mišljenju, idealan materijal za testiranje je dnevni urin. Analiza jutarnjeg urina bila bi prikladnija, ali mogućnost njezine upotrebe temelji se samo na činjenici da se ova vrsta analize koristi za određivanje bioloških markera metabolizma kostiju kod osteoporoze: poznato je da su biološki markeri podložni cirkadijalnim ritmovima, a vrhunac koncentracije bioloških markera metabolizma kostiju javlja se noću. Trenutno u literaturi nema podataka o cirkadijalnim ritmovima bioloških markera mekih tkiva i hrskavice, pa će se konačna odluka o odabiru adekvatnog testa urina donijeti nakon provođenja odgovarajućih studija.

Krvne pretrage su rutinski klinički testovi. Neki biološki markeri se već određuju u krvi, poput indeksa akutne faze, dok bi drugi mogli biti uvršteni u standardni popis biokemijskih testova u bliskoj budućnosti. Za svaki biološki marker potrebno je navesti u kojoj komponenti krvi ga treba određivati - plazmi ili serumu. Rezultati istraživanja pokazuju da se koncentracija bioloških markera u krvnoj plazmi značajno razlikuje od one u serumu. Biološki markeri se obično određuju u krvnom serumu. Prema V. Rayanu i sur. (1998.), koncentracije bioloških markera u krvi uzete iz vene u blizini zahvaćenog zgloba i iz udaljenije vene su različite. Ovi podaci ukazuju na potrebu standardizacije uzorkovanja krvi za proučavanje bioloških markera.

Prema LJ Attencia i suradnika (1989.), hrskavica sinovijalnih zglobova odrasle osobe čini samo 10% ukupne mase hijaline hrskavice u tijelu, uključujući intervertebralne diskove. Dakle, određivanje bioloških markera u krvi i urinu odražava sistemski metabolizam, a ne lokalne promjene u zglobu zahvaćenom osteoartrozom. Sinovijalna tekućina je najbliža patološkom fokusu kod osteoartroze i vjerojatno najtočnije odražava procese koji se odvijaju u zahvaćenom zglobu. Koncentracija bioloških markera u sinovijalnoj tekućini može biti znatno veća nego u krvi, što znači da ju je lakše odrediti. Primjeri uključuju epitop 846 agrekana - u sinovijalnoj tekućini ga je 40 puta više nego u krvnom serumu, proteine hrskavičnog oligomera (COMP) - 10 puta više nego u krvnom serumu. Produkti razgradnje u sinovijalnoj tekućini točnije odražavaju kataboličke procese u zglobnoj hrskavici. Drenaža molekula iz sinovijalne tekućine kroz lokalni limfni sustav može dovesti do smanjenja njihove veličine, pa čak i do njihovog uništenja.

Unatoč invazivnosti tehnike prikupljanja sinovijalne tekućine, povezane s nizom mogućih komplikacija, vrijednost određivanja bioloških markera u njoj je očita. Kako bi se izbjegli problemi s tzv. suhim zglobom, 20 ml izotonične otopine NaCl može se ubrizgati u zglob neposredno prije prikupljanja tekućine. Odmah nakon ubrizgavanja izotonične otopine, pacijent treba 10 puta saviti i ispružiti ud u zglobu, nakon čega slijedi brza aspiracija razrijeđene sinovijalne tekućine. Prema EM-JA Thonaru (2000.), takvo razrjeđivanje sinovijalne tekućine utječe na metabolizam u zglobnoj hrskavici. Međutim, rezultati studije FC Robiona i suradnika (2001.) pokazuju da ponovljeno ispiranje koljenskih zglobova konja ne uzrokuje značajne promjene u metabolizmu hrskavice. Ovi podaci svakako zahtijevaju potvrdu. Stoga se za svaki biološki marker učinak ispiranja zgloba na promjene njegove koncentracije mora utvrditi u fazi predkliničkih studija na životinjama.

Sljedeća važna točka je određivanje vremena poluraspada u sinovijalnoj tekućini i krvi za svaki biološki marker. Bez takvih podataka, interpretacija rezultata ispitivanja bit će teška. Obično je vrijeme poluraspada biološki aktivnih tvari u krvi kraće nego u drugim tekućim medijima zbog učinkovitog uklanjanja putem jetre i bubrega. Stoga je za svaki biološki marker potrebno odrediti i put eliminacije. Dakle, N-propeptid kolagena tipa III izlučuje se iz jetre endocitozom posredovanom receptorima, a neglikozilirani fragmenti kolagena izlučuju se uglavnom urinom, kao i osteokalcin. Na endotelnim stanicama sinusa jetrenih lobula nalaze se receptori za glikozaminoglikane, pa se hijaluronska kiselina i proteoglikani eliminiraju putem jetre. Vrijeme poluraspada hijaluronske kiseline u krvi je 2-5 minuta. Prisutnost sinovitisa može ubrzati uklanjanje bioloških markera iz zglobova, iako studija na kunićima nije pronašla značajne razlike u uklanjanju proteoglikana sa ili bez sinovitisa. Stoga je potrebno istražiti učinak upale na promjene koncentracije bioloških markera u tjelesnim tekućinama.

Bubrezi selektivno filtriraju biološke markere. Stoga glikozaminoglikani, koji nose veliki negativni naboj, možda neće prodrijeti kroz bazalnu membranu bubrega, dok se glikozaminoglikani poput hondroitin-6-sulfata i hondroitin-4-sulfata detektiraju u urinu.

Osim patologije (posebno osteoartritisa), niz čimbenika može utjecati na koncentraciju bioloških markera u tjelesnim tekućinama:

1. Cirkadijalni ritmovi proučavani su samo za mali broj bioloških markera. Proučavani su za markere metabolizma kostiju. Dakle, vrhunac koncentracije osteokalcina javlja se noću, a unakrsnih veza kolagena ujutro - u 8 sati. Kod reumatoidnog artritisa, vrhunac aktivnosti IL-6 također se javlja noću (oko 2 sata), i to ranije od osteokalcina. Ovi podaci su od određenog interesa u odnosu na sudjelovanje IL-6 u upali i fiziologiji koštanog tkiva. TNF-a, naprotiv, nema cirkadijalne ritmove. Međutim, receptori ovog citokina mogu im se pokoravati.
2. Peristaltika. Hijaluronsku kiselinu sintetiziraju sinovijalne stanice (kao i mnoge druge stanice) i potencijalni je marker sinovitisa kod osteoartritisa i reumatoidnog artritisa. Međutim, najveća koncentracija hijaluronata nalazi se u crijevnom limfnom sustavu. Nije iznenađujuće da se koncentracija hijaluronske kiseline u cirkulaciji može povećati nakon jela. Stoga bi uzorkovanje krvi za određivanje bioloških markera trebalo obaviti natašte ili 3 sata nakon jela. A učinak peristaltike na razinu bioloških markera u krvi zahtijeva proučavanje.
3. Tjelesna aktivnost ujutro nakon spavanja dovodi do povećanja koncentracije hijaluronske kiseline u krvi, MMP-3 i epitopa keratan sulfata kod zdravih osoba. Tjelesna aktivnost može promijeniti koncentraciju nekih markera i u sinovijalnoj tekućini i u krvnom serumu. Takvo povećanje je izraženije kod pacijenata s reumatoidnim artritisom, štoviše, koncentracija bioloških markera korelira s kliničkim stanjem ovih pacijenata.
4. Bolesti jetre i bubrega. Ciroza jetre uzrokuje značajno povećanje razine hijaluronske kiseline u serumu i vjerojatno utječe na eliminaciju proteoglikana. Poznato je da bolesti bubrega utječu na koncentracije osteokalcina. Ovo pitanje također zahtijeva dublje proučavanje.
5. Dob i spol. Tijekom rasta povećava se aktivnost stanica ploča rasta, što je popraćeno povećanjem koncentracije skeletnih bioloških biljega u krvnom serumu. Primjer je povećanje koncentracije fragmenata agrekana i kolagena tipa II u perifernoj krvi i urinu životinja u rastu. Stoga je interpretacija analiza bioloških biljega kod djece i adolescenata s mišićno-koštanim bolestima teška. Za mnoge biološke biljega utvrđeno je povećanje koncentracije sa starenjem. Kod muškaraca koncentracija bioloških biljega značajno premašuje onu kod žena u hrskavičnom i koštanom tkivu. Osim toga, kod žena u menopauzi i postmenopauzi mogu se očekivati promjene u koncentraciji bioloških biljega metabolizma hrskavice, slično onima koje se opažaju u koštanom tkivu.
6. Kirurški postupci također mogu utjecati na razinu bioloških markera, a taj učinak može trajati nekoliko tjedana.

Koncept bioloških markera osteoartroze temelji se na pretpostavci da oni odražavaju određene aspekte metaboličkih procesa u zglobnim tkivima. Međutim, odnos između koncentracija bioloških markera u tjelesnim tekućinama i metabolizma hrskavice, sinovijalne i drugih tkiva pokazao se vrlo složenim.

Na primjer, koncentracija markera degradacije ECM-a zglobne hrskavice u sinovijalnoj tekućini može ovisiti ne samo o stupnju degradacije same matrice, već i o drugim čimbenicima, poput stupnja eliminacije molekularnih fragmenata iz sinovije, što je već gore spomenuto, kao i o količini hrskavičnog tkiva koje je preostalo u zglobu.

Unatoč gore navedenim činjenicama, koncentracija bioloških markera u sinovijalnoj tekućini općenito korelira s metabolizmom molekula izvanceličnog matriksa (ECM) zglobne hrskavice. Na primjer, promjene u koncentraciji fragmenata agrekana, epitopa 846, COMB-a i C-propeptida kolagena II u sinovijalnoj tekućini nakon ozljede zgloba i tijekom razvoja osteoartroze u skladu su s promjenama u intenzitetu metabolizma agrekana, COMB-a i kolagena II u eksperimentalnim modelima osteoartroze kod životinja/i in vivo te u zglobnoj hrskavici pacijenata s osteoartrozom/i in vitro.

Identifikacija specifičnih izvora molekularnih fragmenata složen je proces. Povećano oslobađanje molekularnih fragmenata može se dogoditi i zbog općeg povećanja procesa razgradnje koji nisu kompenzirani sintetskim procesima i zbog povećane razgradnje uz istovremeni porast intenziteta sinteze istih molekula ECM-a; u potonjem slučaju, koncentracija molekula ECM-a se ne mijenja. Stoga je potrebno tražiti markere specifične za razgradnju i sintezu. Primjer prvog su fragmenti agrekana, a drugog C-propeptid kolagena 11.

Čak i ako je biološki marker povezan sa specifičnim aspektom metabolizma, potrebno je uzeti u obzir specifične značajke tog procesa. Na primjer, identificirani fragmenti mogu nastati kao rezultat degradacije de novo sintetizirane molekule koja se još nije integrirala u funkcionalni ECM, molekule koja je upravo integrirana u ECM i konačno trajne molekule ECM-a koja je važan funkcionalni dio zrele matrice. Drugi problem je definicija specifične zone matrice (pericelularna, teritorijalna i interteritorijalna matrica) koja je služila kao izvor bioloških markera detektiranih u sinovijalnoj tekućini, krvi ili urinu. Studije in vitro pokazuju da intenzitet metabolizma u pojedinačnim zonama ECM-a zglobne hrskavice može biti različit. Proučavanje određenih epitopa povezanih sa sulfacijom hondroitin sulfata može pomoći u identifikaciji populacije de novo sintetiziranih molekula agrekana.

Može se pretpostaviti da je pojava fragmenata molekula koje su normalno prisutne u hrskavičnom izvanceličnom materijalu (ECM) u sinovijalnoj tekućini povezana s metabolizmom hrskavičnog matriksa. Međutim, to nije uvijek slučaj, budući da ovisi o nizu čimbenika, posebno o tome koliko je koncentracija određene molekule u zglobnoj hrskavici veća od one u drugim zglobnim tkivima i koliko je intenzitet njezinog metabolizma u hrskavici veći od onog u drugim zglobnim tkivima. Dakle, ukupna masa agrekana u zglobnoj hrskavici značajno premašuje onu, na primjer, u meniskusu koljenskog zgloba, dok se ukupna masa COMB-a u meniskusu praktički ne razlikuje od one u zglobnoj hrskavici. I hondrociti i sinovociti proizvode stromelizin-1, ali ukupan broj stanica u sinovijalnoj membrani veći je od broja stanica u hrskavici, pa je značajan dio stromelizina-1 koji se nalazi u sinovijalnoj tekućini najvjerojatnije sinovijalnog podrijetla. Stoga je identifikacija specifičnog izvora bioloških markera izuzetno teška i često nemoguća.

Prilikom proučavanja bioloških markera u krvnom serumu i urinu javlja se problem određivanja njegovog mogućeg ekstraartikularnog izvora. Osim toga, u slučaju monoartikularnog oštećenja, biološki markeri koje izlučuje zahvaćeni zglob mogu se pomiješati s markerima koje izlučuju netaknuti zglobovi, uključujući i kontralateralne. Zglobna hrskavica čini manje od 10% ukupne mase hijaline hrskavice u tijelu. Stoga određivanje bioloških markera u krvi i urinu može biti opravdano prije kod poliartikularnih, odnosno sistemskih bolesti (u odnosu na osteoartrozu - kod generalizirane osteoartroze).

Zahtjevi za biološke markere ovise o tome koriste li se kao dijagnostički, prognostički ili evaluacijski test. Na primjer, dijagnostički test određuje razlike između zdravih osoba i pacijenata s osteoartritisom, što se izražava u smislu osjetljivosti i specifičnosti testa. Prognostički test identificira pojedince u kohorti koji najvjerojatnije brzo napreduju bolest. Konačno, evaluacijski test temelji se na sposobnosti markera da prati promjene tijekom vremena kod pojedinog pacijenta. Osim toga, biološki markeri mogu se koristiti za određivanje osjetljivosti pacijenata na određeni lijek.

U početku se pretpostavljalo da biološki markeri mogu poslužiti kao dijagnostički testovi koji bi pomogli u razlikovanju zgloba zahvaćenog osteoartrozom od intaktnog, kao i u provođenju diferencijalne dijagnostike s drugim bolestima zglobova. Stoga se određivanje koncentracije keratan sulfata u krvnom serumu smatralo dijagnostičkim testom za generaliziranu osteoartrozu. Međutim, naknadne studije pokazale su da ovaj biološki marker može samo u nekim situacijama odražavati razgradnju hrskavičnih proteoglikana. Pokazalo se da koncentracije bioloških markera u krvnom serumu ovise o dobi i spolu osobe koja se pregledava.

Putativni biološki markeri metabolizma zglobnog tkiva u sinovijalnoj tekućini i krvnom serumu pacijenata s osteoartritisom

Biološki marker	Proces	U sinovijalnoj tekućini (linkovi)	U krvnom serumu (linkovi)
1. Hrskavica
Agrekan
Fragmenti temeljnih proteina	Degradacija agrekana	Lohmander LS. i dr., 1989.; 1993.	Thonar EJMA i sur., 1985.; Campion GV i sur., 1989; MehrabanF. i sur., 1991.; Spector TD i sur., 1992; Lohmander LS., Thonar EJ-MA, 1994.; Poole AR i sur., 1994.) t (Poole AR i sur., 1994.)
Epitopi temeljnih proteina (neoepitopi specifični za zonu cijepanja)	Degradacija agrekana	Sandy JD i sur., 1992.; LohmanderLS. i sur., 1993.; LarkM.W. i sur., 1997
Epitopi keratonskih sulfata	Degradacija agrekana	Campion GV i sur., 1989.; Belcher C i sur., 1997.
Epitopi hondroitin sulfata (846, ЗВЗ, 7D4 i DR.)	Sinteza/degradacija agrekana	Poole AR i sur., 1994; HazellP.K. i sur., 1995.; Slater RR Jr. i sur., 1995.; Plaas AHK i sur., 1997; 1998.; Lohmander LS. i sur., 1998
Omjer hondroitin-6 i hondroitin-4 sulfata	Sinteza/degradacija agrekana	Shinme iM. i dr. 1993.
Mali proteoglikani	Razgradnja malih proteoglikana	Witsch-PrehmP. i dr., 1992.
Matrični proteini hrskavice
HOMP	Degradacija HOMP-a	Saxne T., Heinegerd D., 1992"; LohmanderLS. et al., 1994; Petersson IF i dr., 1997.	Šarif M. i dr., 1995.
Hrskavični kolageni
C-propeptid kolagena tipa II	Sinteza kolagena II	ShinmeiM. i sur., 1993.; YoshiharaY. i sur., 1995.; LohmanderLS. i sur., 1996
Fragmenti alfa lanca kolagena tipa II	Razgradnja kolagena II	Hollander AP i sur., 1994; Billinghurst RC i sur., 1997; AtleyLM. i sur., 1998
MMP-ovi i njihovi inhibitori	Sinteza i sekrecija	Iz sinovije ili zglobne hrskavice?
II. Meniskusi
HOMP	Degradacija HOMP-a	Iz zglobne hrskavice, meniskusa ili sinovije?
Mali proteoglikani	Razgradnja malih proteoglikana
III. Sinovijalna membrana
Hijaluronska kiselina	Sinteza hijaluronske kiseline		Goldberg RL i sur., 1991.; HedinP.-J. i sur., 1991.; Sharif M. i sur., 1995.
MMP-ovi i njihovi inhibitori
Stromelizin (MMP-3)	Sinteza i sekrecija MMP-3	LohmanerLS i dr., 1993.	ZuckerS. i sur., 1994; YoshiharaY. i sur., 1995
Intersticijska kolagenaza (MMP-1)	Sinteza i sekrecija MMP-1	Clark IM i sur., 1993.; LohmanderLS i sur., 1993.	Manicourt DH i sur., 1994.
TIMP	Sinteza i sekrecija TIMP-a	Lohmander LS. i sur., 1993.; Manicourt DH i sur., 1994	Yoshihara Y. i sur., 1995
N-propeptid kolagena tipa III	Sinteza/degradacija kolagena III	Šarif M. i dr., 1996.	Šarif M. i dr., 1996.

Brojne studije pokazale su razlike u koncentracijama agrekanskih fragmenata, HOMP-a i MMP-a te njihovih inhibitora u zglobnoj tekućini koljenskih zglobova zdravih dobrovoljaca, pacijenata s reumatoidnim artritisom, reaktivnim artritisom ili osteoartrozom. Unatoč činjenici da autori pokazuju značajne razlike u prosječnim koncentracijama bioloških markera, interpretacija podataka je teška, budući da je komparativna analiza bila profilna i retrospektivna. Prognostička svojstva ovih testova potrebno je potvrditi u prospektivnim studijama.

Biološki markeri mogu se koristiti za procjenu težine bolesti ili stadija patološkog procesa. U slučaju osteoartroze, težina bolesti i njezini stadiji procjenjuju se rezultatima rendgenskih pregleda, artroskopije, kao i težinom sindroma boli, ograničenjem funkcije zahvaćenih zglobova i funkcionalnim kapacitetom pacijenta. L. Dahlberg i sur. (1992.) te T. Saxne i D. Heinegard (1992.) predložili su korištenje nekih molekularnih markera metabolizma zglobne hrskavice za dodatnu karakterizaciju stadija osteoartroze. Međutim, potrebna su daljnja istraživanja u tom smjeru kako bi se takvi biološki markeri uveli u medicinsku praksu.

Postoje izvješća o mogućoj upotrebi bioloških markera kao prognostičkih testova. Na primjer, pokazano je da koncentracija hijaluronske kiseline (ali ne i keratan sulfata) u serumu pacijenata s osteoartritisom koljena na početku studije ukazuje na progresiju gonartroze tijekom 5 godina promatranja. U istoj populaciji pacijenata, pokazano je da je povećani sadržaj COMB-a u serumu pacijenata s gonartrozom tijekom prve godine nakon početka studije povezan s radiografskom progresijom tijekom 5 godina promatranja. Studije bioloških markera u pacijenata s reumatoidnim artritisom pokazale su da je koncentracija COMB-a, epitopa 846, hondroitin sulfata u serumu povezana s bržim napredovanjem bolesti. Ovi rezultati, dobiveni u malim skupinama pacijenata, često ne pokazuju snagu veze između razine bioloških markera i progresije bolesti, tj. potrebna su daljnja istraživanja, prospektivna i na većim kohortama pacijenata.

TD Spector i sur. (1997.) otkrili su blagi porast serumskog CRP-a u bolesnika s ranim osteoartritisom i izvijestili da CRP može biti prediktor progresije osteoartritisa. U ovom slučaju, porast CRP-a odražava procese oštećenja zglobnog tkiva i može biti povezan s porastom hijaluronske kiseline, što također ukazuje na progresiju bolesti. Moguće je da je sinovijalna membrana odgovorna za većinu hijaluronske kiseline određene u serumu, što ukazuje na prisutnost blagog sinovitisa. Povećane koncentracije stromelizina MMP u sinovijalnoj tekućini i serumu bolesnika s osteoartritisom i nakon ozljede zgloba također mogu biti povezane s blagim sinovitisom.

Konačno, biološki markeri mogu se koristiti kao kriteriji učinkovitosti u kliničkim ispitivanjima lijekova, kao i za praćenje patogenetskog liječenja. Međutim, postoje dva međusobno povezana problema: nedostatak lijekova s dokazanim svojstvima "modificiranja strukture" ili "modificiranja bolesti" uvelike je posljedica nedostatka pouzdanih bioloških markera, i obrnuto, nedostatak specifičnih markera metabolizma zglobnog tkiva uvelike je posljedica nedostatka kontroliranih studija lijekova u tim skupinama.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]